一种千金子的组培方法与流程

本发明属于千金子组培快繁，具体涉及一种千金子的组培方法。

背景技术：

1、随着水稻轻简化栽培的应用以及干湿交替的稻田管理模式的推进，致使旱生喜湿的千金子(leptochloa chinensis)在稻田迅速发展成为稻田主要恶性杂草，部分区域千金子危害严重，成为最优势杂草。稻田杂草抗药性研究结果表明全国稻田千金子抗药性发展迅猛，部分区域千金子对稻田主要除草剂氰氟草酯产生了75.8倍以上的抗药性。然而在进一步研究千金子抗药性作用机制时，却面临调查采样时收集的千金子抗性种群种子量少，且遗传背景混杂，需要通过植物组培技术大量快速获得遗传背景单一的千金子种质资源，以便进行后续研究。目前牛筋草(eleusine indica)、狗尾草(setaria viridis)、多花黑麦草(loliummultiflorum)等杂草已经建立起稳定的组培体系，然而千金子尚未有报道表明有组培体系。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对上述问题，首次提出一种千金子的组培方法，为研究千金子抗药性、遗传背景等打下良好的基础。

2、本发明的目的是通下述方式实现的：

3、一种千金子的组培方法，包括如下步骤：

4、(1)外植体的消毒：以千金子的成熟胚为外植体进行消毒；

5、(2)愈伤组织的诱导和继代：将外植体接种在诱导培养基上黑暗培养诱导出胚性愈伤组织；

6、(3)愈伤组织的分化：将愈伤组织转入分化培养基上分化得到芽苗；

7、(4)生根：芽苗转到生根培养基上分化出根；

8、(5)形成完整植株后炼苗，移栽。

9、步骤(1)中成熟胚砂纸打磨去除颖壳后，用75％酒精消毒30s后，用4％次氯酸钠消毒10-15min，期间左右摇晃确保灭菌彻底，消毒完成后，用无菌水清洗4～6次后，置于无菌滤纸上，在超净台吹干备用。

10、步骤(2)将外植体接种在诱导培养基上；诱导培养基：4.43g/l m519+0.5～4mg/l2，4-d，蔗糖30g/l，植物凝胶5g/l或琼脂8g/l，ph为5.8-5.9。

11、步骤(2)26-32℃黑暗培养。

12、步骤(2)9cm培养皿内50-200颗种子。

13、步骤(2)将诱导出的愈伤组织进行继代培养，条件同诱导处理，且18-25d需更换培养基，直至获得足量愈伤，愈伤继代不要超过4代。

14、由于千金子种子细小，可以用灭菌勺子均匀撒播。28℃黑暗培养7d后开始出愈伤，15d愈伤诱导率约为75％，30d出愈率高达90％，建议千金子愈伤继代不要超过4代，可保持良好的分化能力。

15、步骤(3)的分化培养基：m519 4.43g/l+6-ba 0.1～2.0mg/l+kt 0～0.5mg/l，+蔗糖30g/l+植物凝胶5g/l或琼脂8g/l，ph为5.8-5.9，28℃-32℃，12h光照/12h黑暗培养，光照强度为8000-20000lx。5d后开始分化芽点，15d可以看见千金子幼苗雏形，分化率达到90％以上。

16、步骤(4)生根培养基：ms 4.43g/l+naa 0～0.5mg/l+蔗糖30g/l+植物凝胶5g/l或琼脂8g/l，ph为5.8-5.9，28℃-32℃，12h光照/12h黑暗培养，光照强度为8000-20000lx。

17、步骤(4)当芽长至1.0-2.0cm高时，转到生根培养基上分化出根，15d后形成完整植株。

18、步骤(5)开盖炼苗1-2d后移入营养土中，注意保湿。移栽成活率达到90％以上。

19、本发明首次提出千金子的组培体系，利用其成熟胚为外植体，使得外植体的获取简单易行且数量大，少量种子就能获得大量的愈伤组织。该体系操作简便、稳定性好、繁殖效率高的优点。

技术特征：

1.一种千金子的组培方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)26℃-32℃黑暗培养。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，步骤(2)9cm培养皿内50-200颗种子。

6.根据权利要求1或3或4所述的方法，其特征在于，步骤(2)将诱导出的愈伤组织进行继代培养，条件同诱导处理，且18-25d需更换培养基，直至获得足量愈伤，愈伤继代不要超过4代。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)生根培养基：ms 4.43g/l+naa 0～0.5mg/l+蔗糖30g/l+植物凝胶5g/l或琼脂8g/l，ph为5.8-5.9，28℃-32℃，12h光照/12h黑暗培养，光照强度为8000-20000lx。

9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于，步骤(4)当芽长至1.0-2.0cm高时，转到生根培养基上分化出根，15d后形成完整植株。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)开盖炼苗1-2d后移入营养土中，注意保湿。

技术总结
本发明公开了一种千金子的组培方法。包括：1)外植体的消毒：以千金子的成熟胚为外植体进行消毒；(2)愈伤组织的诱导和继代：将外植体接种在诱导培养基上黑暗培养诱导出胚性愈伤组织；(3)愈伤组织的分化：将愈伤组织转入分化培养基上分化得到芽苗；(4)生根与移栽：芽苗转到生根培养基上分化出根；(5)形成完整植株后炼苗，移栽。本发明首次提出千金子的组培体系，利用其成熟胚为外植体，使得外植体的获取简单易行且数量大，少量种子就能获得大量的愈伤组织。该体系操作简便、稳定性好、繁殖效率高的优点。

技术研发人员：杨浩娜,王立峰,柏连阳,陈玄,黄婷
受保护的技术使用者：湖南省农业生物技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15