一种农杆菌介导的千金子遗传转化方法与流程

本发明属于千金子遗传转化，具体涉及一种农杆菌介导的千金子遗传转化方法。

背景技术：

1、我国85％以上的农田受杂草危害，造成每年粮食减产3700万吨。千金子(leptochloa chinensis)是我国稻田的主要恶性杂草之一，其危害潜力仅此于稗草。当田间密度达到21株/m2时，可使水稻减产36％以上。部分水稻直播田千金子危害严重，水稻收成减少大半，严重影响水稻的产量和质量。因此科学防控千金子对保障水稻优质增产具有重要意义。2022年molecule plant报道千金子染色体级别参考基因组的成功组装，这将有力推动有关千金子危害性的遗传与分子机制的调查研究。然而，千金子的遗传转化体系研究尚处于空白阶段，其相关基因的功能验证均无法在千金子体内进行研究，阻碍了千金子危害机制与安全防控的研究。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种农杆菌介导的千金子遗传转化方法，该方法以千金子愈伤为侵染材料，通过使用农杆菌eha105侵染后能有效获得转基因千金子植株，为千金子功能基因的验证打下良好的基础，以及为千金子安全防控技术的研发提供了技术支撑。

2、本发明的目的是通下述方式实现的：

3、一种农杆菌介导的千金子遗传转化方法，包括如下步骤：

4、(1)以千金子(leptochloa chinensis)幼穗为外植体诱导产生胚性愈伤组织；

5、(2)用含有外源基因的农杆菌eha105菌液侵染千金子愈伤组织后，置于共培养基中共培养；

6、(3)共培养结束后，将愈伤组织转入筛选培养基上进行筛选；

7、(4)将新产生的抗性愈伤组织转入分化培养基中培养；

8、(5)将分化培养得到的芽苗转到生根培基中分化出根；

9、(6)形成完整植株后炼苗移栽。

10、步骤(1)在千金子孕穗初期，叶枕距为2～5cm长时，用剪刀剪下生长健壮的幼穗，在超净台用0.1％升汞消毒15分钟后用无菌水冲洗干净，无菌条件干燥后接种于诱导培养基进行暗培养，诱导后幼穗产生胚性愈伤组织，及时转入到诱导培养基中继续扩繁培养愈伤组织。

11、步骤(1)中诱导和扩繁均优选是暗培养，且培养基配方和培养条件相同。

12、步骤(1)愈伤组织诱导时，采用4.43g/l m519基础培养基+0.5g/l脯氨酸+0.3g/l水解酪蛋白+0.5～4mg/l2，4-d+30g/l蔗糖+5g/l植物凝胶或8g/l琼脂，ph为5.8-5.9，26℃-32℃黑暗培养；15天产生愈伤组织，及时转入到诱导培养基中继续扩繁培养愈伤组织，时间20天左右。

13、步骤(2)用5.53g/l aam培养基+30g/l蔗糖+100-300μmol/l as(乙酰丁香酮),ph5.2-5.6的aam侵染液将含有外源基因的农杆菌eha105菌液调至0d600为0.3～1.0，侵染千金子愈伤10-20min后，进行共培养。

14、步骤(2)浸染后的愈伤组织置于5.53g/l aam培养基+30g/l蔗糖+5g/l植物凝胶或8g/l琼脂+100-300μmol/l as,ph5.2-5.6的共培养基中21℃-28℃共培养2-4d。

15、本发明共培养为暗培养。

16、步骤(3)共培养结束后，将愈伤转入4.43g/l m519基础培养基+200-400mg/l特美汀+30-40mg/l潮霉素+0.5～4mg/l 2，4-d+30g/l蔗糖+5g/l植物凝胶或8g/l琼脂，ph为5.8-5.9的筛选培养基上进行抗性筛选。

17、步骤(3)中第一次抗性筛选后，10～15d转入新的筛选培养基上，进行第二次抗性筛选。

18、本发明抗性筛选也是暗培养；筛选期间应时常监测污染情况，若有农杆菌侵染则及时剔除污染愈伤或及时转移未污染愈伤。

19、步骤(4)将产生的抗性愈伤组织转入4.43g/l m519基础培养基+100-300mg/l特美汀+10-30mg/l潮霉素+0.1～2.0mg/l 6-ba+0～0.5mg/l kt+30g/l蔗糖+5g/l植物凝胶或8g/l琼脂，ph为5.8-5.9的分化培养基中，26℃-32℃,12h光照/12h黑暗培养，光照强度为8000-20000lx，直到分化出小苗。

20、分化培养时7d后开始长绿点，15d可以看见千金子幼苗雏形，分化率约为60％。

21、步骤(5)当芽长至1.0-2.0cm高时，转到4.43g/l ms培养基+0～0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+5g/l植物凝胶或8g/l琼脂，ph为5.8-5.9，28℃-32℃，12h光照/12h黑暗培养，光照强度为8000-20000lx的生根培养基中生根。

22、步骤(6)形成完整植株后开盖炼苗1-2d，期间加适量水，练苗后移入营养土中，注意保湿。移栽成活率达到90％以上。

23、本发明首次实现了以千金子幼穗为外植体诱导的愈伤组织为侵染材料的农杆菌遗传转化方法，通过使用农杆菌eha105侵染后能有效获得转基因千金子植株，为千金子功能基因的验证打下良好的基础，为千金子安全防控技术的研发提供了技术支撑。

技术特征：

1.一种农杆菌介导的千金子遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)形成完整植株后开盖炼苗1-2d，期间加适量水，练苗后移入营养土中，注意保湿。

技术总结
本发明公开了一种农杆菌介导的千金子遗传转化方法，包括如下步骤：(1)以千金子(Leptochloa chinensis)幼穗为外植体诱导产生胚性愈伤组织；(2)用含有外源基因的农杆菌EHA105菌液侵染千金子愈伤组织后，置于共培养基中共培养；(3)共培养结束后，将愈伤组织转入筛选培养基上进行筛选；(4)将新产生的抗性愈伤组织转入分化培养基中培养；(5)将分化培养得到的芽苗转到生根培养基中分化出根；(6)形成完整植株后炼苗移栽。本发明通过使用农杆菌EHA105侵染后能有效获得转基因千金子植株，为千金子功能基因的验证打下良好的基础，为千金子安全防控技术的研发提供了技术支撑。

技术研发人员：王立峰,杨浩娜,柏连阳,陈玄,黄婷,唐易
受保护的技术使用者：湖南省水稻研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15