本发明涉及组织培养及离体快速繁殖，具体涉及一种五脉绿绒蒿组织培养离体快速繁殖方法。
背景技术：
1、五脉绿绒蒿(meconopsis quintupinenia rege1.)是罂粟科(papaveraceae)绿绒蒿属(meconopsis vig.)植物，藏名“欧氏完保”，又名野毛金莲(《青海常用中草药手册》)，为传统藏药，在民间有广泛应用，分布于西藏、陕西、甘肃、青海、四川等地，主要生长于海拔2300～4600m的高山草甸和阴坡灌丛中。全草入药，具有清热、治肝炎、胆囊炎、肺炎、肺结核、胃溃疡等功效。作为高山药用植物绿绒蒿的重要品种，五脉绿绒蒿在30多个藏药配方中均被用到，主要用于治疗肝炎、肺炎、头痛、水肿等症，镇痛效果尤佳。文献资料中有关五脉绿绒蒿的研究主要集中在资源、形态组织学、化学成分、药理活性、临床应用等方面，五脉绿绒蒿含有多种化学成分，具有多种显著的药理作用，具有广阔的开发和应用前景。青海省是五脉绿绒蒿的主产区之一，具有分布广、观赏价值高和治疗疾病等特征。目前随着科技的进一步发展，五脉绿绒蒿的应用越来越广泛，但其自然资源开发一直处于无序状态，导致其野生资源趋于枯竭的边缘，为了合理开发绿绒蒿资源，促使野生资源的可持续利用和健康发展，对绿绒蒿的人工开发也在逐步展开。
2、五脉绿绒蒿目前为止均为野生，虽然分布较广，五脉绿绒蒿药材长期依赖野生采挖来满足国内外市场需求，种质资源破坏严重、蕴藏量急剧减少，五脉绿绒蒿种群遭到了毁灭性破坏，致使其资源已无法满足市场需要。尤其是近年来随着国内外对五脉绿绒蒿需求量的增加，供需矛盾日益突出，加之利益驱使，大量掠夺性采挖，使五脉绿绒蒿资源枯竭的危险，进行种质资源保护和扩大五脉绿绒蒿繁育势在必行。
3、植物组织培养技术是利用细胞的全能性(即个体的某个器官或组织已经分化的细胞再生成完整个体的遗传潜力)，取植物个体上的细胞团或组织，通过人工配制的培养基，使这些细胞团或组织形成成千上万个植株。利用组织培养进行离体快速繁殖有以下几方面重要意义：(1)繁殖速度快，不受外界气候因素影响，一年四季在室内均可快速大量繁殖；(2)便于保持优良生物学特性；(3)在保存和繁育优良突变体或优良杂种一代方面有非常重要的意义，一株具有明显优势的五脉绿绒蒿突变体或一个具明显优势的后代经组织培养后可大面积推广等等。
4、现有的研究中对高山野生药材的组织培养较多，如雪莲、红景天等，但以野生五脉绿绒蒿茎尖为外植体的组织培养尚未见报道。从野外采集的外植体，其表面滋生大量细菌和真菌等微生物，有的甚至长到组织内部；加之五脉绿绒蒿所含醌类、酚类物质较多，很容易氧化褐变，直接对五脉绿绒蒿育苗存在周期过长、繁殖系数低的问题；因此对外植体材料的选择和消毒处理方法都是非常关键。
5、为此，本发明首次采用茎尖外植体组织培养方法，开展野生五脉绿绒蒿种质离体繁殖研究工作，为保护五脉绿绒蒿种质资源，开展遗传改良、促进五脉绿绒蒿工厂化育苗、从组织培养产物中获得五脉绿绒蒿生物活性物质都提供了一条新途径。
技术实现思路
1、基于上述技术问题，本发明的目的是提供一种易于操作、可进行大规模工厂化生产的五脉绿绒蒿组织培养离体快速繁殖方法。
2、本发明保护一种五脉绿绒蒿组织培养离体快速繁殖方法，具体包括如下步骤：
3、步骤1，外植体的选择和处理：以五脉绿绒蒿的茎尖为外植体，经流水冲洗15～30分钟，用无菌去离子水冲洗4～5次，再将冲洗后的外植体置于质量浓度为0.2％的氯化汞溶液中，浸泡灭菌4～5分钟，并用无菌去离子水冲洗4～6次，最后用无菌滤纸吸干水分即得消毒后的外植体茎尖；
4、步骤2，外植体接种：将所述消毒后的外植体茎尖先接种在无激素培养基上，7～15天后接种至诱导芽分化培养基上，其中每25ml所述诱导芽分化培养基中接种2～3棵消毒后的外植体茎尖；在温度为23℃±2℃、光源为日光灯、光强为30～60umol.m-2.s-1、光照时间为12h.d-1的条件下培养25～30天，使茎尖基部形成2～3个丛生芽；
5、步骤3，继代增殖培养：将所述2～3个丛生芽接种到继代增殖培养基上，其中每25ml所述继代增殖培养基中接种1～2个所述丛生芽；在温度为23℃±2℃、光源为日光灯、光强为30～60umol.m-2.s-1、光照时间为12h.d-1的条件下培养25～35天，形成五脉绿绒蒿丛生苗；
6、步骤4，生根诱导：将五脉绿绒蒿丛生苗长至3～4cm时分株，将生长旺盛的苗从丛生苗中分剥下来，然后转入生根培养基中，，其中每25ml所述生根培养基中接种2～3棵所述五脉绿绒蒿丛生苗；在温度为23℃±2℃、光源为日光灯、光强为30～60umol.m-2.s-1、光照时间为12h.d-1的条件下培养20～30天后，丛生苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗；
7、步骤5，育苗基质消毒：将腐殖质与珍珠岩按2：1重量比混合而成的混合基质，所述混合基质在115～121℃温度下进行高温消毒，15～20min后即得消毒后的育苗基质；所述育苗基质的总孔隙度为70～75％，有机质含量为20％；
8、步骤6，植株移栽：将所述完整再生小苗直接移栽到所述消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常五脉绿绒蒿植株；所述一棵完整再生小苗种植在所述消毒后的育苗基质10cm2的范围内。
9、进一步的，所述步骤1中，五脉绿绒蒿的基源植物为罂粟科草本植物五脉绿绒蒿meconopsis quintupinenia rege1.。
10、进一步的，所述步骤2中，无激素培养基指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，vc母液2ml，蔗糖30克，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mm naoh溶液调整ph值至5.8，最后加入琼脂粉5.0克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
11、进一步的，所述步骤2中，诱导芽分化培养基指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的6-苄氨基腺嘌呤母液20ml，浓度为0.1mg/ml的萘乙酸母液10ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mm naoh溶液调整ph值至5.8，最后加入琼脂粉5.0克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
12、进一步的，所述步骤3中，继代增殖培养基指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0.1mg/ml的6-苄氨基腺嘌呤母液10ml，浓度为0.1mg/ml的玉米素母液5ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mm naoh溶液调整ph值至5.8，最后加入琼脂粉5.0克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
13、进一步的，所述步骤4中，生根培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液50～100ml，微量元素母液5～10ml，有机成分母液5～10ml，铁盐母液2.5～5ml，柠檬酸母液4ml，vc母液2ml，蔗糖15～30克，浓度为0.1mg/ml的萘乙酸母液5～10ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入1mm naoh溶液调整ph值至5.8，最后加入琼脂粉6.0克，在100ml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121℃高温消毒即得。
14、进一步的，所述大量元素母液是指含有硝酸铵16.5g/l，硝酸钾19.0g/l，硫酸镁3.7g/l，磷酸二氢钾1.7g/l，氯化钙4.4g/l的混合液；所述微量元素母液是指含有硫酸锰1.68g/l，硫酸锌0.86g/l，硼酸0.62g/l，碘化钾0.083g/l，钼酸钠0.025g/l，硫酸铜0.0025g/l，氯化钴0.0025g/l的混合液；所述有机成分母液是指含有甘氨酸0.2g/l，盐酸硫胺素0.04g/l，盐酸吡哆醇0.05g/l，烟酸0.05g/l，肌醇0.1g/l的混合液；所述铁盐母液是指含有硫酸亚铁5.58g/l，na2.edta.2h2o7.46mg/l的混合液；所述柠檬酸母液是指含有柠檬酸10mg/ml的溶液；所述vc母液是指含有抗坏血酸1mg/ml的溶液。
15、相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：
16、(1)本发明首次采用茎尖外植体通过生物工程技术——组织培养技术进行离体快繁，克服了五脉绿绒蒿育苗周期过长、繁殖系数低的问题；同时开展野生五脉绿绒蒿种质资源离体繁殖研究工作，为保护珍稀濒危五脉绿绒蒿种质资源，开展遗传改良、促进五脉绿绒蒿的工厂化育苗提供了一条新途径，提供了一种能进行五脉绿绒蒿的人工繁殖、种质资源离体保存、利用及选育药用成分含量高的组织培养离体繁殖方法。
17、(2)由于本发明所用培养基中含有植物激素6-ba，6-ba激素属细胞分裂素类，其具有诱导芽分化的主导作用，因此诱发时间短、出苗快、增殖频率高，尤其出苗齐，炼苗后可直接成活，易于操作，可进行大规模工厂化生产。
18、(3)本发明利用组织培养进行离体快速繁殖具有繁殖速度快，不受外界气候因素影响，一年四季在室内均可快速大量繁殖的优点；便于保持优良生物学特性，即同步性好；在保存和繁育优良突变体或优良杂种一代方面有非常重要的意义，一株具有明显优势的五脉绿绒蒿突变体或一个具明显优势的后代经组织培养后可大面积推广等。