一种橡树的组织培养方法

本发明涉及植物组织培养，具体涉及一种橡树的组织培养方法。

背景技术：

1、橡树(quercus palustris münchh.)又名又称栎树或柞树，是壳斗科(fagaceae)栎属(quercus l.)大型落叶乔木，通常指栎属植物，非特指某一树种。原生于欧洲、安那托利亚至高加索地区，具有树体高大、枝叶繁茂、树形优美、抗寒耐旱、适应性强等特点。橡树木材坚实，纹理美观，可用于建筑行业，以及制造橡木桶和名贵家具，具有良好的经济价值；其叶片形态优美，秋季变为金色且宿存时间较长，是优良的观赏树种和园林绿化树种；其种子淀粉含量高，可供食用和酿酒，具有十分广阔的发展前景。

2、组织培养技术已广泛应用于1500多种植物的无性繁殖。壳斗科植物组织培养的研究起源于20 世纪 50 年代，在80年代开始盛行，到目前栎属、栲属、栗属和石栎属的研究均有报道，组织培养已成为壳斗科植物快速繁育的重要手段之一。橡树在我国具有重要的应用前景，但其结实量大小年现象明显、开花结实迟、营养繁殖困难、难以建立种子园及不能连续回交获得纯系、种子萌发困难且生长缓慢、种子在自然条件下出苗整齐性差，导致橡树大规模生产种苗困难，培育经选择的优良种苗更困难，严重制约着我国橡树产业的发展。因此，亟需一种育种周期短、操作简单、繁殖系数高、生根率高的橡树组织培养方法。

技术实现思路

1、基于上述问题，本发明提供一种橡树的组织培养方法，该方法繁殖系数高、生根率高。

2、本发明是采用以下技术方案来实现的：

3、一种橡树的组织培养方法，包括如下步骤：

4、⑴丛生芽分化培养: 以橡树无菌苗为材料，剪除无菌苗的多余新生叶片，保留单株1.5-2 cm的无菌芽接入到丛生芽分化培养基上，进行分化培养，获得无菌苗幼嫩芽；

5、⑵生根培养：通过步骤⑴获得无菌苗幼嫩芽，剪除多余的新生叶片，保留单株1.5-2 cm，接入到生根培养基上，进行生根培养。

6、进一步地，步骤（1）所述丛生芽分化培养基为wpm基本培养基中添加0.2-0.3 mg/l6-ba和50-100 mg/l cef。

7、进一步地，所述丛生芽分化培养基添加有29-31 g/l的蔗糖、5.8-6.2 g/l的琼脂，ph为5.7-5.9。

8、步骤（2）所述生根培养基为1/2ms基础培养基中添加0.1-0.5 mg/l 萘乙酸（naa）和100 mg/l 噻孢霉素钠（cef）。

9、所述生根培养基添加有29-31 g/l的蔗糖、5.8-6.2 g/l的琼脂，ph为5.7-5.9。

10、步骤⑴所述丛生芽分化培养和步骤⑵所述生根培养的条件均为：培养温度(25±2)℃，光照时间16-17 h/d。

11、所述橡树无菌苗的培养包括如下步骤：

12、（1）种子预处理：剥去美国白栎种子的种皮，获得带子叶的合子胚；

13、（2）种子的消毒灭菌：将合子胚流水冲洗、酒精漂洗、无菌水冲洗、次氯酸钠溶液浸泡、无菌水再次冲洗、植物组培抗菌剂溶液浸泡；

14、（3）种子萌发培养：将灭菌后的合子胚接种到种子萌发培养基中，促进根芽茎的萌发，得到美国白栎无菌苗。

15、优选地，步骤⑵所述种子的消毒灭菌步骤为：将合子胚流水冲洗4 h，用体积分数为75%酒精漂洗90 s，无菌水冲洗一次，质量分数为10%次氯酸钠溶液浸泡15 min，无菌水冲洗三次，植物组培抗菌剂（ppm）溶液浸泡24 h。

16、优选地，步骤⑶所述种子萌发培养基为wpm基本培养基中添加0.002 mg/l tdz和100 mg/l cef。

17、进一步地，步骤⑴中所述橡树种子选自生长良好、无病虫害、抗逆性强的优良单株的美国白栎植株。

18、本发明所具有的优点和有益效果是：

19、本发明丛生芽分化培养基中是在wpm基本培养基中添加了适宜浓度的6-苄氨基嘌呤（6-ba）和噻孢霉素钠，wpm基本培养基、6-ba和噻孢霉素钠共同作用，具有更好的促进细胞分化的效果，能提高芽的分化，抑制内生菌的繁殖，降低内生菌对芽分化的负面影响，在共同作用下，丛生芽分化培养基能够快速繁育出大量丛生小苗，增值系数可达7.13。生根培养基是在1/2ms基础培养基中添加萘乙酸（naa）和噻孢霉素钠，1/2ms培养基中含有少量的营养，1/2ms培养基、萘乙酸（naa）和噻孢霉素钠共同作用，既能能降低内生菌对生根的负面影响，又能加快植物根系的生长以适应环境，三者共同作用下可快速诱导生根，生根率达93%，且生根快，生根条数多。种子萌发培养基为wpm基本培养基中添加0.002 mg/l tdz和100 mg/l cef，wpm基本培养基中添加噻苯隆（tdz）和cef后，可以抑制内生菌的活性，减少内生菌对橡树苗生长的影响，从而提高增值系数和生根率。本发明橡树无菌苗的培育方法是使用橡树的剥去种皮的合子胚在种子萌发培养基上进行萌发培养，可使合子胚多次萌芽，出苗率高；再结合使用质量分数为5%的ppm溶液浸泡合子胚24 h，可快速高效杀菌和持久抑菌。本发明建立了一种育种周期短、操作简单、繁殖系数高、生根率高的橡树组织培养方法，可在短时间内获得大量种苗，为橡树产业的快速发展提供了技术支持。

技术特征：

1.一种橡树的组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

2. 根据权利要求1所述的一种橡树的组织培养方法，其特征在于，步骤（1）所述丛生芽分化培养基为wpm基本培养基中添加0.2-0.3 mg/l 6-苄氨基嘌呤和50-100 mg/l噻孢霉素钠。

3. 根据权利要求2所述的一种橡树的组织培养方法，其特征在于，所述丛生芽分化培养基添加有29-31 g/l的蔗糖、5.8-6.2 g/l的琼脂，ph为5.7-5.9。

4. 根据权利要求1所述的一种橡树的组织培养方法，其特征在于，步骤（2）所述生根培养基为1/2ms基础培养基中添加0.1-0.5 mg/l 萘乙酸和100 mg/l 噻孢霉素钠。

5. 根据权利要求4所述的一种橡树的组织培养方法，其特征在于，所述生根培养基添加有29-31 g/l的蔗糖、5.8-6.2 g/l的琼脂，ph为5.7-5.9。

6.根据权利要求1所述的一种橡树的组织培养方法，其特征在于，步骤⑴所述丛生芽分化培养和步骤⑵所述生根培养的条件均为：培养温度(25±2)℃，光照时间16-17 h/d。

7.根据权利要求1所述的一种橡树的组织培养方法，其特征在于，所述橡树无菌苗的培养包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的一种橡树的组织培养方法，其特征在于，步骤⑵所述种子的消毒灭菌，包括以下步骤：将合子胚流水冲洗4 h，用体积分数为75%酒精漂洗90 s，无菌水冲洗一次，质量分数10%次氯酸钠溶液浸泡15 min，无菌水冲洗三次，植物组培抗菌剂溶液浸泡24 h。

9.根据权利要求8所述的一种橡树的组织培养方法，其特征在于：步骤⑶所述种子萌发培养基为wpm基本培养基中添加0.002 mg/l 噻苯隆和100 mg/l 噻孢霉素钠。

10.根据权利要求7所述的一种橡树的组织培养方法，其特征在于：步骤⑴中所述橡树种子选自生长良好、无病虫害、抗逆性强的优良单株的美国白栎植株。

技术总结
本发明公开了一种橡树的组织培养方法，包括以下步骤：丛生芽分化培养:以美国白栎无菌苗为材料，剪除多余新生叶片，保留单株1.5‑2 cm的无菌芽接入到丛生芽分化培养基上，进行分化培养；生根培养：通过步骤⑴获得无菌苗幼嫩芽，剪除多余的新生叶片，保留单株1.5‑2 cm，接入到生根培养基上，进行生根培养。丛生芽分化培养基能够快速繁育出大量丛生小苗，增值系数可达7.13；生根培养基可快速诱导生根，生根率达93%，且生根速度快，生根条数多；同时培养基中均添加了适宜浓度的Cef，可以进一步抑制内生菌的活性，减少内生菌对美国白栎苗生长的影响，从而提高增值系数和生根率。

技术研发人员：何方,李豪,王婷,黄雄,钟宇,陈小红,徐振锋
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15