基于三七不定根获得人参稀有皂苷的方法

本发明涉及药用植物器官培养，更具体地说，涉及一种基于三七不定根获得人参稀有皂基的方法。

背景技术：

1、三七(panax notoginseng)属于五加科人参属的多年生草本药用植物，以根入药，为我国传统名贵大宗药材，主要分布于我国云南等地区。三七的主要活性成分为三七总皂苷，其含量和种类直接关系到三七的药理活性。三七皂苷具有抑制自由基损伤、抗炎、降血脂、抑制细胞过度自噬、降低心肌耗氧量等药理作用。近年来，随着大健康产业发展以及人们对“回归自然”理念的深入认识，在亚洲乃至世界范围内，三七在医药、功能食品和化妆品等领域的应用越来越广泛。由于三七生长周期较长，从种植到收获入药大约需要5-7年，加上连作障碍、根腐病及重金属和农药残留等突出问题，需要新的替代途径生产三七原材料满足市场的极大需求。

2、研究表明，利用植物细胞和器官的离体培养物可以作为生产天然产物的原材料，代替野生或栽培的药用植物资源。近几年来，通过细胞或不定根工业化培养技术生产天然产物的探索越来越多。例如细胞培养的紫草、青蒿、茜草、红豆杉等，不定根培养的紫锥菊、颠茄、贯叶连翘等，以及毛状根培养的金铁锁、蛇根草、丹参等等，它们可以合成生物碱、类黄酮、皂苷等多种具有药用价值的天然产物。

3、其中，不定根或毛状根遗传和生理生化代谢更稳定，生长速度更快，可以合成更多种类的化合物，因此，不定根或毛状根培养比细胞或愈伤组织培养方式具有更大的优势。现代研究发现人参稀有皂苷与三七中富含的大量皂苷相比具有更高的生物活性，但它在三七中含量极低，从植株中提取分离且获取相对困难且远远不能满足药物使用和开发的需求。将三七中常见的含量较高的人参皂苷转化为人参稀有皂苷是提高其药理活性和生物利用率的关键。人参皂苷rb1是三七中含量较高的皂苷成分，通过各种方式对其糖基进行修饰和转化，从而获得药理活性更高的人参稀有皂苷c-k、rg3等，为制备人参稀有皂苷提供了新的思路。

4、目前，主要采用热处理法、化学处理法、微生物及酶转化法、smith降解法改变人参皂苷的化学结构，转化成稀有皂苷，但仍存在反应剧烈，并存在酸碱残留、副产物较多、后期分离实验难度大及对环境具有污染等缺点。迄今为止，尚未发现在三七不定根培养过程中提高稀有皂苷转化率的研究。

技术实现思路

1、本发明旨在解决三七不定根培养过程中提高稀有皂苷转化率的问题，通过人参内生菌与茉莉酸甲酯联合使用以提高稀有皂苷产量。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种基于三七不定根获得人参稀有皂苷的培养基，包括：以ms为基础培养基，添加5-7mg/l iba、0.2-0.6mg/l naa、0.1-0.3mg/l kt、3％蔗糖、50-150μmol/l乙酸钠。(乙酸钠培养基)

3、一种基于三七不定根获得人参稀有皂苷的方法，包括如下步骤：

4、s1、人参内生菌活化：将人参内生菌菌块纯化后接种至pda培养基中活化5-8d，将活化获得的菌丝接种pdb培养基中培养5-8d，得到人参内生菌菌液；所述pda培养基为马铃薯浸出粉8-12g/l、葡萄糖10-15g/l、琼脂8-10g/l，其余为水；所述pdb培养基为马铃薯浸出粉8-12g/l、葡萄糖10-15g/l，其余为水；

5、s2、三七不定根的诱导与增殖：将三七植株的根部脱毒后接种至诱导培养基中培养，将诱导得到的不定根接种在固体增殖培养基继代培养后，再接种至100-150ml液体增殖培养基培养；所述诱导培养基为添加3-5mg/l iba、0.01-0.03mg/l naa、0.6％琼脂、3％蔗糖的ms培养基；所述液体增殖培养基为添加5-7mg/l iba、0.2-0.6mg/l naa、0.1-0.3mg/lkt、3％蔗糖的ms培养基；所述固体增殖培养基为所述液体增殖培养基中添加0.4％琼脂；

6、s3、三七不定根生物反应器培养：将步骤s2液体增殖培养基培养获得的三七不定根接种至乙酸钠培养基在生物反应器中进行培养；所述乙酸钠培养基为添加5-7mg/l iba、0.2-0.6mg/l naa、0.1-0.3mg/l kt、50-150μmol/l乙酸钠、3％蔗糖的ms培养基；

7、s4、提高不定根的人参稀有皂苷转化率：分别吸取步骤s1所得人参内生菌菌液和浓度为180-220μmol/l茉莉酸甲酯加入生物反应器中继续培养10-15d，得到含有稀有皂苷的三七不定根。

8、优选方式下，步骤s1所述人参内生菌为翘孢霉属真菌emericella sp.bp-19。

9、优选方式下，步骤s1中，所述pda培养基的培养条件为26-28℃黑暗条件下倒置培养；所述pdb培养基的培养条件为26-28℃黑暗条件下摇床培养，转速为160-180rpm。

10、优选方式下，步骤s2中，所述诱导培养基的培养条件为22-28℃黑暗条件下培养30-35d；所述固体增殖培养基的培养条件为22-28℃黑暗条件下暗培养30-35d，继代培养2-3次；所述液体增殖培养基的培养条件为25-28℃黑暗条件条件下摇床培养40-45d，转速为70-90rpm。

11、优选方式下，步骤s3中，所述乙酸钠培养基的培养条件为24-28℃黑暗条件下培养40-50d，所述生物反应器的通气量为0.10-0.30vvm。

12、优选方式下，步骤s1中，每20-30ml所述pda培养基接种1-2块所述人参内生菌菌块，每45-55ml所述pdb培养基接种0.5-0.8cm2的菌丝。

13、优选方式下，步骤s2中，每30-40ml诱导培养基接种3-5根三七植株根部小段；诱导出不定根后，取鲜重为2-3g的三七不定根，切成0.5-1.0cm的小段接种在30-40ml所述固体增殖培养基中；三七不定根在所述液体增殖培养基中的接种量为6-8g/l。

14、优选方式下，步骤s3中，三七不定根的接种量为6-8g/l，所述乙酸钠培养基的体积为1.5-3l。

15、优选方式下，步骤s4中，所述添加所述人参内生菌菌液的od600＝0.4，人参内生菌菌液的接种量为1-5％。

16、本发明过程中使用的所有培养基在使用前均经过灭菌处理，优选方式下，灭菌条件为101kpa、121℃灭菌20-30min。

17、在更详细的方案中，本发明为一种获得人参稀有皂苷的三七不定根。

18、一种获得人参稀有皂苷的乙酸钠培养基，所述乙酸钠培养基为ms培养基；其中，每升所述ms培养基包括：5-7mg/l iba、0.2-0.6mg/l naa、0.1-0.3mg/lkt、3％蔗糖、50-150μmol/l乙酸钠。

19、一种基于三七不定根获得人参稀有皂苷的方法，包括如下步骤：

20、(1)20年人参内生菌的活化：挑取1-2块纯化后的20年人参内生菌bp-19菌块取接种到20-30ml pda培养基上进行活化，26-28℃黑暗条件下倒置培养5-8d，取0.5-0.8cm2的菌丝移至装有45-55ml pdb培养基的100ml摇瓶，26-28℃黑暗条件下摇床培养，转速160-180rpm培养5-8d，得到20年人参内生菌bp-19的菌液。

21、步骤(1)所述pda培养基为添加为马铃薯浸出粉8-12g/l、葡萄糖10-15g/l、琼脂8-10g/l、其余为水的固体培养基，在101kpa、121℃灭菌20-30min。pdb培养基为添加为马铃薯浸出粉8-12g/l、葡萄糖10-15g/l、其余为水的液体培养基，在101kpa、121℃灭菌20-30min。

22、步骤(1)所述真菌为分离自新鲜的20年人参植株的人参内生菌翘孢霉属真菌emericella sp.bp-19。

23、(2)三七不定根的诱导与增殖：以云南文山三七植株作为材料，选取根部为外植体实验材料，用手术刀将根切成小段，先用乙醇消毒5-8min，无菌水冲洗3次，再用nacio3消毒6-8min，最后用无菌水冲洗5次后取3-5根接种至30-40ml诱导培养基，在温度为22～28℃的条件下暗培养30-35d，诱导出不定根后取2-3g(鲜重)不定根切成0.5-1.0cm的小段接种在30-40ml的固体增殖培养基，在温度为22-28℃的黑暗条件下暗培养30-35d，继代2-3次后，取100-150ml液体增殖培养基分装至250ml三角瓶中培养，接种量为6-8g/l，于25℃的恒温摇床中暗培养40-45d，转速设置为70-90rpm；

24、步骤(2)中所述诱导培养基为添加3-5mg/l iba、0.01-0.03mg/l naa、0.6％琼脂、3％蔗糖的ms培养基；固体增殖培养基为添加5-7mg/l iba、0.2-0.6mg/lnaa、0.1-0.3mg/lkt、0.4％琼脂和3％蔗糖的ms培养基；液体增殖培养基为添加5-7mg/l iba、0.2-0.6mg/lnaa、0.1-0.3mg/l kt、3％蔗糖的ms培养基。

25、步骤(2)中所述脱毒过程中所述小段为0.5-1cm，乙醇浓度为75％，nacio3溶液浓度为5％。

26、(3)三七不定根生物反应器培养：将增殖获得的三七不定根接种于含1.5-3l的乙酸钠培养基的5l生物反应器中，接种量为6-8g/l，设置通气量为0.10-0.30vvm，24-28℃温度下暗培养，培养40-50d。

27、步骤(3)中所述的生物反应器中培养基为5-7mg/l iba、0.2-0.6mg/l naa、0.1-0.3mg/l kt、50-150μmol/l乙酸钠、3％蔗糖的ms培养基。

28、(4)提高不定根的人参稀有皂苷转化率：将所述的20年人参内生菌bp-19菌液与茉莉酸甲酯加入三七不定根生物反应器中继续培养10-15d，即得一种稀有皂苷高含量三七不定根。

29、步骤(4)中所述的茉莉酸甲酯的浓度为180-220μmol/l。

30、步骤(4)中所述20年人参内生菌bp-19菌液od600＝0.4(4×107cfu/ml)，接种量为1-5％。

31、本发明的有益效果是：

32、1、本发明通过生物反应器培养三七不定根生产稀有皂苷。作为一种药食同源的植物，三七对心血管系统、血液、中枢神经系统和免疫系统有广泛的影响。现代药理表明，三七药材的主要生物活性成分三七总皂苷(p.notoginseng saponins,pns)，其含量和种类与三七的药理活性有着直接的关系。与五加科人参属代表药材人参相比，三七植株中主要皂苷含量高达8％-12％，远高于人参中总皂苷的含量，其中人参皂苷rg1、rb1、rd、re与三七皂苷r1含量最高，约占三七中总皂苷含量的80％。

33、2、本发明将20年人参内生菌与茉莉酸甲酯联合使用以提高稀有皂苷产量，茉莉酸甲酯能诱导不定根中人参皂苷的积累，但对三七的生物量有抑制作用，与内生菌联合使用可促进不定根皂苷含量及增大不定根的生物量；内生菌可以使培养基呈酸性条件促进三七不定根中大量皂苷转化为稀有皂苷，生长周期短、生长迅速易于培养而不受环境因素影响，适宜功能工业化生产；另外，相比其他方法，本发明在培养过程中内生菌与茉莉酸甲酯的联合使用使本发明无毒害残留、后期分离实验难度小、节约培养时间与成本等优势。

34、3、本发明获得的稀有皂苷在自然界中含量极低、难获取并且结构复杂，化学合成难以实现，难以直接从植株中提取获得，一般通过转化原型人参皂苷而获得。稀有皂苷可作为人类糖尿病、心脑血管等重大慢性疾病用的药食兼用物质。