一种羊精液冻存液及其应用

本发明涉及生物，尤其涉及一种羊精液冻存液及其应用。

背景技术：

1、随着家畜养殖业向集约化、规模化发展，人工授精技术也逐渐被广泛应用。人工授精技术是高效扩繁的重要技术手段，具有提高配种率，减少公畜饲养量和疾病传播，降低引种费用，显著提高经济效益，便于集中统一管理等诸多优点，而精液保存是人工授精技术的关键环节，对于提高优种公畜的利用率，推进家畜的遗传改良工作有重要意义。

2、精液在冷冻保存过程中会诱导精子功能的有害变化，包括ros的产生，其促进膜脂质的过氧化，降低精子活力和线粒体活性，并增加dna片段化和氧化。过度的ros会导致精子功能缺陷，包括膜损伤、dna碎裂和线粒体功能障碍，然后最终导致精子运动和受精潜能受损。为此，各种外源性抗氧化剂已广泛补充到公羊冷冻延长剂中，以消除ros造成的有害影响。在稀释液中补充外源性抗氧化剂以改善氧化应激和改善解冻后精液质量，可以减轻精液在冷冻保存过程中的过氧化损伤，延长精液保存期。

3、eslami等研究了公羊精液的液态保存，发现棕榈油酸可以作为一种抗氧化剂来保护精子免受损伤，用它处理72h可以显著提高精子的活力和运动能力，并且通过pcr测定进一步证明榈油酸可以提高精子的抗氧化水平及超氧化物歧化酶(sod)活性。

4、在过去的几十年中，冷冻精液技术迅猛发展，不同动物的精液冷冻都获得了较快的进展。羊的精子与其他家畜相比具有一定生理特性，冷冻后活力低、受胎率低，且不稳定，成为制约羊冷冻精子发展的桎梏。

技术实现思路

1、本发明提供一种羊精液冻存液及其应用，用以解决现有技术中绵羊的精子冷冻后活力低、受胎率低，且不稳定的缺陷，本发明将gsh-px用于羊精液保存，提高了保存后羊精液的活力以及存活时间，提升羊精液品质。

2、本发明提供了gsh-px在羊精液保存中的应用。

3、gsh-px(glutathione peroxidase，谷胱甘肽过氧化物酶)是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，也是体内重要的自由基捕获酶之一。gsh-px不仅具有清除自由基和衍生物的作用，还减少脂质过氧化物的形成，增强机体抗氧化损伤的能力。gsh-px还参与前列腺素和血栓素的合成，保护细胞的结构和功能。此外，gsh-px能够通过降低线粒体氧化损伤保护线粒体，从而降低细胞氧化应激水平，提高生殖细胞冷冻后活力。

4、精子呼吸的耗氧量通常按109个精子在37℃下所消耗的氧量计算，正常牛、鸡、兔和绵羊精子的耗氧量分别为21、7、11和22μl。可见，绵羊精子的耗氧量较高。

5、本发明将gsh-px(谷胱甘肽过氧化物酶)作为一种外源性抗氧化剂用于羊精液保存，可以破坏过氧化物的作用，增强精子的抗氧化能力，避免氧化应激损伤，延长精子的保存期，提升绵羊冷冻精液品质，提高绵羊冷冻精液解冻后活力以及存活时间。

6、在一些实施例中，所述精液为绵羊精液；

7、优选地，所述保存为冷冻保存；

8、更优选地，将gsh-px的稀释液用于绵羊精液的冷冻保存。

9、冷冻可以使精子的代谢活动受到抑制，当温度恢复时，仍能保持活力。但冻融过程可产生大量的ros，因精子质膜富含多聚不饱和脂肪酸，易受氧化应激损伤。绵羊的精子冷冻后解冻测定发现活力较低、受胎率低，且不稳定。

10、本发明采将gsh-px的稀释液用于绵羊精液的冷冻保存，可明显改善冷冻保存的绵羊精液品质；同时提高绵羊精子的运动能力，提高精子质膜完整性和线粒体活性。

11、本发明还提供了一种羊精液冻存液。

12、所述羊精液冻存液中，gsh-px的添加量为0.01-100u/ml；

13、优选地，所述羊精液冻存液中，gsh-px的添加量为25-100u/ml；

14、更优选地，gsh-px的添加量为50-100u/ml。

15、虽然过量的ros会导致精子功能缺陷，但在生理水平产生的ros是获能、顶体反应、超活化和获得受精能力所必需的。本发明在羊精液冻存液中，添加一定浓度的gsh-px，可以破坏过氧化物，但过量的gsh-px会造成ros的过量清除，为维持细胞内正常生理水平的ros，在羊精液冻存液中，添加25-100u/ml，优选50-100u/ml，进一步优选50u/ml的gsh-px对羊精液进行冷冻保存，可显著提高绵羊精子冻后质量，包括冻后活力，运动能力都显著提升，维持质膜和dna完整，保护顶体和线粒体不受损伤。在一些实施例中，所述羊精液冻存液中还包括甘油、抗冻剂、gsh和mitoq；

16、本发明在羊精液冻存液中还添加了甘油和抗冻剂，两者对精子具有防冻保护作用，可以提高精子的复苏率。添加的gsh和mitoq是为了与gsh-px配合共同起到清除ros，提高精子抗氧化损伤能力的作用。

17、谷胱甘肽(gsh)是哺乳动物细胞中主要的非蛋白巯基化合物，具有多种生物学功能，是精液本身存在的抗氧化剂，可以快速地被细胞用作氧化应激的防御。谷胱甘肽的巯基(sh)赋予其抗氧化损伤保护作用。gsh的缺乏会导致精子中段的不稳定，从而导致运动障碍。gsh保护细胞膜脂质氧化，消除超级过氧化物和阻止氧化。gsh可以清除脂质过氧化物，从而抑制过氧化连锁反应。gsh也可以清除h2o2，避免脂质过氧化。

18、mitoq(线粒体靶向抗氧化剂)能通过降低ros水平，减少线粒体蛋白、脂质和dna氧化损伤而保护线粒体。本发明在羊精液冻存液中添加mitoq精子前向运动和总活动率都有所增加。mitoq与gsh和gsh-px共用，可以有效减少ros，冷冻复苏后精子活力明显增加，能有效改善精子生育潜力。

19、在一些实施例中，每100ml所述羊精液冻存液中，甘油4-8ml，抗冻剂1-3ml，gsh4.5-5.5mm,mitoq 5-10μm；

20、优选地，所述羊精液冻存液中还包括鸡蛋卵黄稀释液；更优选地，以体积百分含量计，所述鸡蛋卵黄稀释液中鸡蛋卵黄液的添加量为10-20％。

21、本发明在羊精液冻存液中还添加了鸡蛋卵黄，蛋黄中含有大量的维生素、矿物质及高生物价值的蛋白质，为精子提供充足的营养。

22、进一步优选地，所述鸡蛋卵黄稀释液中还包括基础稀释液，所述基础稀释液包括三羟甲基氨基甲烷、果糖、柠檬酸和青链霉素。

23、所述基础稀释液中，按重量份计，三羟甲基氨基甲烷1-2份，果糖0.3-0.8份，柠檬酸1.6-2.0份；青链霉素的添加量为90-110iu/100ml，余量为水。

24、其中，三羟甲基氨基甲烷为缓冲液，果糖为精子在体外代谢提供能量来源，柠檬酸调节基础稀释液的ph；青链霉素为抗生素，具有抑菌效果。三羟甲基胺基甲烷、柠檬酸及果糖共用可维持稀释液环境与精子内环境的渗透压平衡。

25、本发明还提供了一种用于羊精液保存的试剂盒，所述试剂盒包括所述的精液冻存液；优选地，所述试剂盒包括基础稀释液、鸡蛋卵黄稀释液和/或包括gsh-px的混合液；更优选地，包括gsh-px的混合液为甘油，抗冻剂，gsh,mitoq，gsh-px组成的混合液。

26、本发明还提供了一种羊精液冷冻保存的方法。

27、羊精液冷冻保存的方法包括：将所述的精液冻存液与精液混合后进行冻存；

28、优选地，所述精液冻存液与精液按体积比为(2-7):1进行混合。

29、在一些实施例中，所述冻存为先冷藏再冷冻；

30、优选地，所述冷藏的温度为0-4℃；

31、更优选地，先将精液冻存液与精液的混合液降温到0-4℃，保温1-2小时，再进行冷冻；

32、进一步优选地，所述冷冻的温度为-18℃以下。

33、使用时，羊精液冻存前，先将采集的羊精液与预热至37℃左右的基础稀释液按体积比为1:0.5混合进行稀释，迅速检测精子活力与密度，活率0.8以上，精子密度2×108个/ml以上方可使用，否则弃去。然后将羊精液与鸡蛋卵黄稀释液(ⅰ液)等体积混合放入冰箱降温2h，从37℃降温到0-4℃，再将羊精液与甘油4-8ml，抗冻剂1-3ml，gsh 4.5-5.5mm,mitoq5-10μm与gsh-px组成的ⅱ液体积比1:2.5混合后放入0-4℃冰箱中平衡1.5h，最后，将平衡后的混合液置于冻精细管中，于液氮中冷冻保存。

34、精液加入精液冻存液，经冷冻后还需解冻才能使用。

35、在一些实施例中，冻存后解冻的方法包括：将冻存液(羊精液与ii液的混合液)在35-39℃预热，再与35-39℃的稀释液混合备用；

36、优选地，预热的时间为20-40s；

37、更优选地，所述稀释液为基础稀释液；所述基础稀释液中，按重量份计，三羟甲基氨基甲烷1-2份，果糖0.3-0.8份，柠檬酸1.6-2.0份；青链霉素的添加量为90-110iu/100ml，余量为水。

38、本发明将gsh-px用于羊精液的保存，提高了保存后羊精液的活力以及存活时间，提升了羊精液品质。经试验证实，本发明提供的精液冻存液能够显著提高精液冷冻保存活性，延长精子体外保存时间；同时，冷冻解冻后精子活力与不添加gsh-px相比能提高15％左右。

39、本发明采用gsh-px、gsh和mitoq共用得到的精液冻存液，用于羊精液的保存，羊精液品质更好，受胎率更高；本发明的精液冻存液使用方便，操作简便，应用成本低，效果显著，对羊不产生任何有害影响。可以为羊精液保存提供一定的数据支撑，尤其是在绵羊精液保存及相关的胚胎移植产业(人工授精技术)和胚胎工程中广泛应用，具有广阔的市场前景。