灵菌红素与假单胞菌DMC-X1的组合物、固定化制剂及其应用

本公开属于水处理，本公开尤其涉及一种灵菌红素与假单胞菌dmc-x1的组合物、固定化制剂及其应用。

背景技术：

1、随着社会经济水平的逐步提高和人类活动的不断扩张，水体富营养化和全球气候变暖日益严重，最终导致蓝藻藻华的频繁爆发。当藻华污染严重时，一方面藻细胞的聚集会改变群落结构和破坏水体生态系统的平衡，另一方面由蓝藻产生的微囊藻毒素(microcystins，mcs)会大量释放到水体中，这些藻毒素含量远远超过安全限量1μg/l，且在自然水体中难以被降解，严重威胁水生生态的安全。除此之外，mcs还会通过饮用水供应、水上娱乐活动、食物链等途径富集进入人体，导致人类急性肠胃炎、心脏疾病、肝功能障碍和肝癌等，对人类健康产生严重威胁。因此如何有效地控制蓝藻藻华、去除水体中的mcs、保证用水安全已成为全球高度关注的问题。

2、目前常用的蓝藻藻华及其毒素的控制方法可划分为物理方法、化学方法和生物方法三大类。相比于物理方法和化学方法存在高成本、二次污染等诸多问题，生物法因其环境友好、低成本、高效率等优势受到人们的广泛关注。生物法包括投放水生动物、水生植物或者微生物来控制蓝藻藻华及其所产毒素。微生物是自然界中分布最广泛、种类最多的生物类群，具有多种生态学功能，在富营养化水体的净化和生态系统的恢复过程中起着至关重要的作用。一方面，微生物可以分泌杀藻化合物来抑制藻细胞的生长。目前报道的杀藻化合物种类主要包括蛋白质、氨基酸、脂肪酸、色素、抗生素、多肽类物质等。有些化合物能够直接作用于藻细胞，破坏细胞膜稳定性，改变细胞通透性，最终导致藻细胞死亡；有些化合物进入细胞后则激活过量的活性氧，破坏细胞内氧化还原状态，最终导致藻细胞死亡。另一方面，微生物可以降解藻细胞释放的mcs，迄今为止已经分离得到多种能够降解mcs的细菌，其中大多数能够降解mcs的细菌都属于a-变形菌纲。除a-变形菌纲外，β-变形菌纲、γ-变形菌纲、放线菌纲和芽孢杆菌纲的部分细菌也被证实能够降解mcs。

3、申请人前期分离获得1株对mcs具有高效降解能力的假单胞菌pseudomonaschengduensis dmc-x1(专利申请cn116515665a)。虽然mc降解菌株能清除水体中mcs，但是由于降解菌不能抑藻、杀藻，从而不能从源头上阻断藻华爆发水域中mcs的产生。因此，如何达到既去除藻细胞又能降解藻类释放mcs，已成为现今亟待解决的重大环境问题。

4、构建杀藻化合物和mcs降解菌的联合作用体系在蓝藻藻华的治理上具有广阔的应用前景，其既能高效去除藻细胞又能有效降解藻类释放的mcs，避免二次污染。杀藻化合物和mcs降解菌的联合使用过程中存在诸多挑战，如选择合适的杀藻化合物和mcs降解菌的配伍使用问题，杀藻化合物和降解菌在固定化缓释制剂中的相容性问题等。杀藻化合物既要发挥高效杀藻活性，又不能影响细菌的mc降解活性。目前有报道将杀藻化合物灵菌红素与mcs降解菌联合使用处理铜绿微囊藻(卢青青，灵菌红素与太湖土著藻毒素降解菌协同控藻作用研究，东南大学)，但是并没有利用固定化技术将二者包埋。由于游离降解菌在天然水体处理中的应用具有较大局限性，比如细胞密度被稀释、被其他生物捕食、被复杂环境因素影响导致降解率下降以及储存不便，这使得游离降解菌难以大规模应用，因此，当前普遍使用固定化技术提高降解菌的现场实用性。另一方面，将杀藻化合物固定化后可以使其缓慢释放，以免一次添加量太高造成二次污染。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题中的至少一个，本公开提供一种灵菌红素与假单胞菌dmc-x1的组合物、固定化制剂及其应用。

2、为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

3、1、灵菌红素与假单胞菌dmc-x1的组合物，每3～7μg灵菌红素对应的假单胞菌dmc-x1活菌数为1.0×103～1.34×109。其中，假单胞菌dmc-x1已在专利申请cn116515665a中公开。

4、优选的，每3μg灵菌红素对应的假单胞菌dmc-x1活菌数为1.34×109。

5、2、灵菌红素与假单胞菌dmc-x1的固定化制剂，是以海藻酸钠为载体，氯化钙为交联剂，包埋前述组合物而得。

6、3、灵菌红素与假单胞菌dmc-x1的固定化制剂的制备方法，具体步骤如下：

7、(1)培养产灵菌红素菌株zooshikella sp.sz-14获得培养物，无水乙醇粗提得到乙醇粗提物，乙酸乙酯粗提，获得灵菌红素粗提物；其中，产灵菌红素菌株zooshikellasp.sz-14已在专利cn113151073b中公开；

8、(2)培养假单胞菌dmc-x1获得菌悬液；

9、(3)将灵菌红素粗提物与菌悬液混合得到混合物，最后将混合物利用海藻酸钠水溶液和氯化钙水溶液的交联反应实现包埋，获得小球状固定化制剂。

10、优选的，步骤(1)中，所述培养物是通过以下方法制备得到的：先将产灵菌红素菌株zooshikella sp.sz-14接种于2216e液体培养基中，30℃和150rpm避光震荡培养24小时，获得种子液；然后将种子液以体积接种量1％接种至2216e液体培养基中，30℃和150rpm避光震荡培养48小时，即得所述的培养物。

11、优选的，步骤(1)中，乙醇粗提的具体方法为：将500ml培养物于4℃条件下以8000rpm离心处理10分钟，取沉淀，加入20ml无水乙醇，于4℃振荡避光萃取4小时；萃取结束后于4℃条件下，以8000rpm离心处理10分钟，取上清，55℃旋转蒸干，得到乙醇粗提物。

12、优选的，步骤(1)中，乙酸乙酯粗提的具体方法为：向乙醇粗提物中加入20ml乙酸乙酯，于4℃条件下，避光120rpm振荡萃取4小时，得到乙酸乙酯粗提物。

13、进一步优选的，将乙酸乙酯粗提物于4℃条件下，8000rpm离心10分钟，取上清，42℃旋转蒸干，得到灵菌红素粗提物。

14、进一步优选的，2216e液体培养基的组成如下：细菌蛋白胨5g/l，酵母提取物1g/l，磷酸高铁0.1g/l，琼脂粉15g/l，陈海水定容到1l，ph 7.2。

15、优选的，步骤(2)的具体方法为：先将假单胞菌dmc-x1接种于含有200μg/l微囊藻毒素(microcystin，mc)的msm无机盐液体培养基中，在30℃和150rpm条件下摇床避光培养至菌株生长处于稳定期，取稳定期菌液，离心取沉淀，再用msm无机盐液体培养基重悬，获得菌悬液。

16、进一步优选的，msm无机盐液体培养基的组成如下：mgso4·7h2o180mg/l，cacl220mg/l，na2moo4·2h2o2.5mg/l，znso4·7h2o8mg/l，fecl3·6h2o0.25mg/l，kh2po4300mg/l，nahpo4·12h2o 868mg/l。

17、优选的，步骤(2)中，菌悬液的浓度为1.876×1010cells/ml。

18、优选的，步骤(3)的具体方法为：先将灵菌红素粗提物与菌悬液混合得到混合物，接着加入质量浓度2％海藻酸钠水溶液，充分混匀，得到混合液，然后将混合液逐滴滴入质量浓度2％氯化钙水溶液中，在4℃条件下固定化交联4～6小时，即得小球状的固定化菌剂，无菌水清洗，即得小球状固定化制剂；其中，混合物、海藻酸钠水溶液和氯化钙水溶液的体积比为1：1：100。

19、4、灵菌红素与假单胞菌dmc-x1的组合物、固定化制剂在水质净化中的应用。

20、优选的，水质净化包括：微囊藻杀藻，降解微囊藻毒素，降解可溶性有机物。

21、5、灵菌红素与假单胞菌dmc-x1的组合物、固定化制剂在蓝藻藻华水处理中的应用。

22、本发明的有益效果：

23、申请人前期发现灵菌红素(prodigiosins，pgs)对铜绿微囊藻具有较强的杀藻活性和控制铜绿微囊藻藻华的潜力，同时也分离得到一株具有高效mcs降解能力的菌株pseudomonas chengduensis dmc-x1，并且pgs并不影响降解菌dmc-x1的降解活性。为了同时达到控制藻华和降解微囊藻毒素(microcystins，mcs)的目的，本发明将灵菌红素与mcs降解菌pseudomonas chengduensis dmc-x1联合使用，灵菌红素能清除藻细胞，从源头上阻断mcs的产生，而mcs降解菌则将释放到水体中的mcs去除。

24、本发明进一步将具有杀藻活性的灵菌红素与mcs降解菌利用海藻酸钠和氯化钙的交联反应实现包埋，获得固定化小球dmc-x1-pgs，该小球具有良好的铜绿微囊藻杀藻活性和mcs降解能力。同时，dmc-x1-pgs小球处理降低了藻培养液对明亮发光杆菌和大型蚤的毒性。

25、为了进一步评估dmc-x1-pgs在藻华爆发现场的使用效果，本实验室从浙江省湖州市合溪新港采集藻华爆发水样，使用制备好的dmc-x1-pgs处理水样，结果发现其对蓝藻藻华爆发水样具有良好的杀藻活性和mcs降解能力，并且在处理过程中，dmc-x1-pgs小球还可以去除水体中的可溶性有机物，发挥了净化水质的作用。这说明杀藻化合物和降解菌连用的固定化缓释小球dmc-x1-pgs突破了目前单一功能(杀藻或解毒)固定化制剂的局限性，在控制蓝藻藻华、消除mcs毒性和净化水体方面表现出巨大的应用潜力。