一种提高克隆受体母猪怀孕分娩率的方法与流程

本发明涉及哺乳动物繁殖，尤其涉及一种提高克隆受体母猪怀孕分娩率的方法。

背景技术：

1、体细胞克隆技术是指把动物体细胞经过抑制培养，使细胞处于休眠状态，采用核移植的方法，将卵母细胞去核作为核受体，以体细胞或含少量细胞质的细胞核作为核供体，将后者移入前者中构建重组胚，供体核在去核卵母细胞的胞质中重新编程，并启动卵裂，开始胚胎发育并妊娠产仔，生产出克隆动物的技术，又称为体细胞核移植技术。体细胞克隆技术可以复制优良种畜、生产转基因家畜、制备动物疾病模型和分离胚胎干细胞等，在农业和医学应用上都有巨大的应用价值。目前已经成功克隆出羊、牛、小鼠、猪、兔和马等超过20种哺乳动物，但该技术仍存在一些未解决的问题，比较突出的问题是克隆动物的出生效率低下，大多数克隆胚胎在妊娠期死亡。目前，猪的克隆胚胎全期发育效率只有约0.1-1％，克隆效率低下严重阻碍了体细胞克隆技术在养猪业的推广应用。

2、目前主流观点认为，克隆胚胎发育异常是体细胞基因组在卵母细胞质中经历的去分化、恢复全能性及启动胚胎发育过程中的表观遗传重编程异常造成，导致囊胚率较低，但是最新的研究表明，即便是较高的囊胚率也未必可以获得较高的怀孕分娩率,所以克隆胚胎怀孕分娩率较低的问题还需要更多的科学发现。鉴于现有科学技术水平限制，体外克隆胚胎和体外受精胚胎必须移植到受体母猪体内才能正常发育成为完整的个体。如何确保胚胎正常着床和发育，是影响胚胎移植最终效率的重要因素。胚胎着床和发育与受体母猪的胎次、膘情、生理状况、胚胎移植后的饲养管理密切相关。

3、为了提高体细胞克隆胚胎移植怀孕率和产仔数，一般移植胚胎数量高达200-300枚，而普通母猪受孕仅有20枚左右的胚胎。克隆胚胎受体母猪移植怀孕率一般在20-50％，产仔数在2-6头，整体克隆效率在0.1-1％。由于克隆胚胎发育与普通胚胎不同，所以对应的受体母猪挑选、母猪激素处理及发情、胚胎移植术前管理、胚胎移植手术及术后护理、妊娠期饲喂、受体母猪分娩、克隆仔猪出生护理等饲养管理措施均有不同，便于获更好的整体克隆效率。

4、铁是动物机体代谢中重要的微量元素之一，参与电子传递、氧化磷酸化等生理生化过程。铁也是核糖核苷酸还原酶的组成部分，参与细胞中的dna合成。绝大多数铁在机体中以血红蛋白的形式存在，血红蛋白是红细胞的主要成分，是机体运输氧气和二氧化碳最主要的载体。血红蛋白含量可以反映机体铁稳态。铁的摄入或吸收不足会导致缺铁性贫血，其特征为红细胞数量减少、血红蛋白量含量降低、食欲不振、嗜睡、呼吸频率增加，贫血严重会导致死亡。研究发现，母猪血红蛋白水平与仔猪初生体重呈负的遗传相关，与仔猪成活率呈正的遗传相关。研究表明，妊娠母猪血红蛋白含量与繁殖性能呈负线性相关。饲料原料中的铁元素含量及生物学效价很低，在商业生产中通常额外添加铁补充剂以避免铁元素的缺乏。

5、中国专利201510261676.0提供了一种提高母猪生产性能的方法，包括妊娠舍的日常管理、妊娠期饲养、药物保健和妊娠期常规免疫，通过上述方法，特别是对妊娠期饲养和药物保健上进行精细化饲养管理，能够显著提高母猪的产活率和健仔率，产活率达到98％以上，母猪平均每胎都在12-14头，母猪在产仔后哺乳期泌乳能力强，奶水质量高，并且能够延长泌乳高峰期，增强初生仔猪的初生重和抗病能力，具有极大的应用前景。

6、中国专利201810465160.1公开了一种提高母猪及仔猪生产性能的肽螯合铁复合制剂，其特征在于各组分质量比如下：肽螯合铁15～25份、益生菌25～35份、酵母细胞壁10～15份。该发明经过合理配伍，表现出协同增效作用，不但可替代针剂给仔猪补铁，而且可显著增加母猪产奶量，提高饲料利用率及提高母猪及仔猪的免疫力，具有增加出生仔猪成活率、促进动物生长及显著改善母猪及仔猪的生产性能等优点。

7、目前，铁补充剂分为无机盐铁、有机酸螯合铁和氨基酸螯合铁三类，现有技术中有机铁源在促进母猪繁殖性能方面的作用有限，因此，研发出一种消化吸收效果好、生物利用度高的铁补充剂以应用到提升克隆受体母猪怀孕分娩率中将具有一定的市场前景。

技术实现思路

1、有鉴于现有技术方案中的上述问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种提高克隆受体母猪怀孕分娩率的方法。

2、本发明的技术方案：

3、一种提高克隆受体母猪怀孕分娩率的方法，包括如下步骤：

4、s1根据选择标准挑选合适的断奶母猪或空怀母猪为备选受体母猪；

5、s2当备选受体母猪为断奶母猪时，在其断奶第二天即肌肉注射孕马血清促性腺激素(pmsg)及维生素ade注射液，第四天注射人绒毛膜促性腺激素(hcg)；当备选受体母猪为空怀母猪时则通过拌料口服烯丙孕素，连续服用18天，停喂第二天后注射孕马血清促性腺激素(pmsg)，维生素ade注射液，第四天注射人绒毛膜促性腺激素(hcg)；

6、s3对备选受体母猪进行背膘检测、发情检测及健康情况检测，符合标准的母猪进行胚胎移植术前管理，准备的母猪数量要高于计划手术数量，以备不时之需；

7、s4检查合格后的受体母猪肌肉注射头孢喹肟混悬液，同时使用10％盐酸林可霉素注射液、鱼腥草注射液混合后子宫灌注，子宫灌注后12h或者手术前2h检查阴道脓性分泌物，有脓性分泌物的母猪不能参与移植；

8、s5对受体母猪进行胚胎移植手术，严格消毒措施、控制环境温度及手术时间，手术结束后肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(hcg)，手术结束后14d再次肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(hcg)；

9、s6胚胎移植后连续三天每天给受体母猪肌肉注射头孢噻呋钠及鱼腥草，创口常规消毒。术后在整个妊娠期补充n-氨甲酰谷氨酸，进行背膘检测并根据检测结果进行喂食。术后每天检查母猪情况，包括阴道分泌物及返情、流产，在术后第30d/60d做两次b超孕检。

10、s7受孕母猪经胚胎移植107-110d后进行体表清洁、消毒后进入分娩舍待产，移植后115d无分娩症状的母猪可肌肉注射氯前列烯醇(pg)催产，若超过118d仍无分娩征兆则进行剖腹产，分娩结束后对克隆仔猪进行出生记录及登记；

11、s8对克隆仔猪进行出生护理，对母猪乳房进行消毒后让克隆仔猪自主吃奶，如克隆仔猪无法自主哺乳则进行协助哺乳，或有出生缺陷的克隆仔猪则人工哺乳，按正常程序对克隆仔猪进行保健、免疫。进一步的，所述步骤s1中受体母猪品种为长白猪、大白猪及二元杂交猪。

12、进一步的，所述步骤s1中所选断奶母猪的标准为分娩2胎以上，45胎以下，连续两胎产仔数≥12头，断奶仔猪≥10头，上胎无掏产、无明显子宫炎症、肢蹄健康、乳房正常、背膘14-18mm；空怀母猪的标准与断奶母猪相同；

13、进一步的，所述步骤s2中pmsg的注射量为800-1000iu/头，维生素ade注射液为4-5ml/头，hcg为400-500iu/头。

14、进一步的，所述步骤s4中头孢喹肟混悬液的用量为-1ml/20kg体重，盐酸林可霉素注射液的用量为10-20ml/头，鱼腥草注射液的用量为50-60ml/头。

15、进一步的，所述步骤s5中hcg的用量为400-500iu/头。

16、进一步的，所述步骤s6中头孢噻呋钠的用量为0.5-1g/头，鱼腥草注射液的用量为20ml/头。

17、进一步的，所述步骤s6中补充氨基酸为在饲料中加入n-氨甲酰谷氨酸，添加量为800-1000g/t，有机铁螯合剂的添加量为400-1000g/t，补充维生素为在饲料中添加维生素e、亚硒酸钠、生物素、叶酸，添加量分别为80-100g/t、0.1-0.3g/t、0.1-0.5g/t、6-10g/t；术后管理包括第一天禁食，第二天每天饲喂0.8-1kg/头，第三天1.2-1.5kg/头，第四天到第十天1.6-2kg/头。

18、妊娠母猪将铁转移到胎儿体内一部分是通过子宫转铁蛋白(子宫分泌的一种黄导蛋白)来实现的，妊娠后期子宫转铁减少被认为是新生仔猪贫血症发生的一个原因。母猪妊娠后期时血清铁最低，而此时转运铁到胎儿的效率妊娠期间胎儿血清铁水平呈降低趋势，并且红细胞压积浆铁离子水平与胎儿重和胎盘效率成正相关。因此，妊娠期母猪的分娩率以及仔猪的成活率都会受到铁元素影响。在本发明中，发明人通过制备得到铁配合物，再在碱性条件下与甘露糖进行络合得到该有机铁螯合剂，这种螯合剂水溶性好，吸收率高，并且结构稳定，因此能够在肠道被吸收不会被轻易破坏，利用率大大提高，铁元素在妊娠母猪体内的充分吸收导致仔猪出生时不会发生贫血等现象，并且成活率较高。本发明还通过对妊娠期母猪进行不同的饲喂量管理从而控制了母猪生产体重，从而减少因体重过轻或过重导致的难产、死胎等现象，进一步提升了分娩率。

19、所述有机铁螯合剂的制备方法，包括如下步骤：

20、x1称取2-氨甲基吡啶5-6重量份、三乙胺4-6重量份加入到4-10重量份的乙醇中，再加入3-溴丙酸7-9重量份，加热至70-90℃后搅拌20-30h，反应结束后冷却至室温，过滤，残余物经乙腈洗涤后浓缩至干得到3-吡啶-甲基氨基丙酸；

21、x2称取步骤x1中的3-吡啶-甲基氨基丙酸2-3重量份、四甲基氢氧化铵2-3重量份加入到10-20重量份的甲醇中，再加入四水合氯化亚铁3-4重量份，搅拌1-4h后过滤，滤液倒入到二乙醚中后出现沉淀，7d后过滤干燥得到铁配合物；

22、x3称取低聚甘露糖5-6重量份，加入25-30重量份的水使其溶解，在加入0.5mol/l氢氧化钠水溶液调节ph至9-10，搅拌混合均匀后步骤x2中的铁配合物5-6重量份，并使ph保持9-10，然后加入两倍体积的无水乙醇醇析，离心分离4000-5000rpm下离心5-10min，下层沉淀经2倍体积的无水乙醇醇析后继续离心，下层沉淀冷冻干燥得到甘露糖-铁配合物作为有机铁螯合剂。

23、进一步的，所述步骤s6中对术后管理结束的母猪根据背膘情况进行饲喂，具体的为术后11-30d，背膘＜14mm饲喂2.0-2.2kg/d，背膘14-18mm饲喂1.8-2kg/d；术后31-85d，背膘＜14mm饲喂2.6-2.8kg/d，背膘14-18mm饲喂2.0-2.2kg/d，背膘＞18mm，饲喂1.8-2kg/d；术后86d之后，背膘18-22mm，饲喂2.8-3kg/d。

24、与现有技术相比，本发明的有益效果：

25、(1)由于移植入受体母猪体内的胚胎数量较多，受体母猪体内激素不足会影响到克隆胚胎发育和着床受孕。因此在移植前后额外补充激素，可以维持受体母猪体内激素的水平，提供有利于胚胎发育和着床的宫内环境，进而提高怀孕分娩率；

26、(2)在受体母猪移植后，影响产仔数和健仔数的主要因素是母猪妊娠期胚胎损失率高。因此在本发明中发明人在妊娠期内补充了n-乙酰谷氨酸(ncg)，可促进内源精氨酸合成，可以有效提高母猪窝产仔数和健仔数。同时补充维生素以促进妊娠期子宫扩张和胎盘形成，增加子宫角长度和胎盘表面积，更好地为胎儿提供营养，促进了胎儿生长发育；

27、(3)在受孕母猪妊娠期饲养管理中，根据背膘情况调整饲喂量的作用是：如果妊娠期过瘦，会影响胎儿的营养供给，使得弱仔或畸形胎、死胎增加；过瘦还会导致母猪体能储备不够，使得母猪产仔无力，发生难产，甚至导致胎猪窒息死亡；母猪过肥同样会因为胎儿过大、产道狭窄导致产程延长难产率上升，因此根据背膘适时调整饲喂量，让怀孕受体母猪保持适度膘情可以大幅减少难产率。