一种百香果微小茎尖体内嫁接方法

本发明涉及果树繁殖领域，具体是一种百香果微小茎尖体内嫁接方法。

背景技术：

1、百香果（ passifloraedulissims），又名西番莲、鸡蛋果，西番莲科（passifloraceae）西番莲属（ passiflora）草质藤本植物，其果实风味特殊爽口、富含vc，散发多种水果香气，被誉为“果汁之王”，深受消费者青睐。

2、百香果病毒病主要为黄瓜花叶病毒（ cucumber mosaic virus，cmv ）、夜来香花叶病毒（ telosmamosaic virus，temv）、东亚西番莲病毒（ east asian passiflora virus，eapv）、西番莲重型斑驳相关病毒（ passion fruit severe mottleassociated virus，pfsmoav）、西番莲潜隐病毒（ passifloralatent virus，plv）和广东番木瓜曲叶病毒（ papaya leaf curl guangdong virus，palcugdv）6种。其中cmv、temv 和eapv3种病毒检出频率高，发生范围广，且存在混合侵染现象，田间症状有花叶、斑驳、皱缩、卷曲、顶枯及小叶等， 严重时植株矮化、果实变形，甚至植株死亡。常见症状为嫩叶明显黄化、卷曲，病株矮化，生长不良，果实变小、变色，畸形，果肉少或无，品质下降，是限制百香果发展的最大障碍。而目前百香果种苗脱毒技术还不完善，难以生产无病毒苗木。

3、微芽嫁接又称茎尖嫁接，是组织培养与嫁接相结合的一种培育无毒嫁接苗的技术。即在无菌条件下切取样品的微小茎尖嫁接到组培繁育出的砧木苗上，给予适宜的培养条件，最终愈合发育成完整植株，以达到脱毒的效果。由于病毒在植物体中是通过维管束和胞间连丝传播，而植物茎尖分生区细胞活跃，细胞分裂速度极快，且没有维管束，病毒传播受限且速度跟不上细胞分裂速度，因此，茎尖中病毒含量极低，可通过微芽嫁接技术获得脱毒植株。

4、茎尖嫁接技术是1972年murashige首次提出的方法，后来被广泛地运用在柑桔脱除黄龙病、裂皮病等多种病毒和类病毒病原。该技术在苹果等木本果树的脱毒以及用以快速鉴别砧木性质等也已应用。

5、植物嫁接原理应用在茎尖嫁接技术上可分为体内微嫁接（ in  vivomicrografting）和体外微嫁接（ in vitromicrografting）。但是，将微小茎尖体外或体内嫁接技术应用于百香果上在国内均未见报道。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种百香果微小茎尖体内嫁接方法。

2、为了实现上述目的，本发明包括如下步骤：

3、一种百香果微小茎尖体内嫁接方法，包括以下步骤：

4、 s1.准备砧木及接穗采集，砧木为展开1～2片真叶，苗龄21～28d实生砧木苗，接穗为剪取健壮优质、无病虫害枝条；

5、s2.通过体视显微镜，在抗氧化溶液的配合下，用注射器针头作手术刀，先对已固定砧木茎上做1×0.5mm的纵向矩形嫁接切口，再从接穗上切取小于1mm的茎尖并移至嫁接切口处定位，砧木去顶并固定茎尖后将嫁接苗移栽至基质中，用保鲜膜包裹营养杯杯口，完成微小茎尖体内嫁接；

6、s3.嫁接后管理，完成微小茎尖体内嫁接后7d内定时喷水，加大空气湿度，7d后逐步减少喷水量。

7、进一步的，上所述步骤s2中用普通透明胶带将水平放置在体视显微镜工作台上的砧木固定其茎杆、叶片。

8、进一步的，上所述步骤s2中用长1.5cm、φ0.3mm的注射器针头作显微手术刀。

9、进一步的，上所述步骤s2中是在砧木的下胚轴上做1×0.5mm的纵向切口，再切除切口内部表皮组织和部分皮质。

10、进一步的，上所述步骤s2中使用抗氧化溶液，溶液为100mg/l抗坏血酸和100mg/l柠檬酸的混合溶液。

11、进一步的，上所述步骤s2中接穗同砧木一样，用普通透明胶带将接穗固定在体视显微镜工作台上，用注射器针头从接穗上斜切取小于1mm（包含2-4个叶原基）的茎尖，随即浸泡在抗氧化溶液中，5s后再用针头将茎尖移至砧木切口处，定位茎尖。

12、进一步的，上所述步骤s2中对齐茎尖与砧木的形态学上、下端后，使用注射器吸走抗氧化溶液，使两者吸附在一起。

13、进一步的，上所述步骤s2中，用薄棉花包裹固定茎尖。

14、进一步的，上所述步骤s2中，用手术刀在砧木嫁接切口上方去顶，并在距离嫁接切口下端0.5cm包裹一团浸润抗氧化溶液的脱脂棉以保持湿度，完成微小茎尖体内嫁接。最后移栽嫁接苗至经高压灭菌的基质中，并用保鲜膜覆盖杯口以保持湿度。

15、本发明具有如下有益效果：

16、（1）建立了一种百香果微小茎尖体内嫁接方法，无需在无菌条件下的操作流程相对简便。

17、（2）使用实生砧木苗的下胚轴，避免砧木腋芽影响接穗茎尖生长。

18、（3）使用抗氧化溶液包裹嫁接口以及浸泡茎尖，有助于改善微小茎尖体内嫁接过程中易失水的问题，从而提高嫁接成活率。

19、（4）使用薄棉花代替嫁接常用薄膜固定茎尖，解决了因茎尖过小而难于将其与砧木固定的操作问题。

20、（5）使用浸润抗氧化溶液的脱脂棉包裹嫁接口下方以及将营养杯杯口用保鲜膜包裹，有助于改善微小茎尖体内嫁接苗培养过程中易失水，成活率低的问题。

21、（6）优化微小茎尖体内嫁接过程的步骤，提高嫁接成活率，成活率达到70%以上；小于1mm微小茎尖嫁接，可以有脱毒效果，为无毒苗的生产繁育提供材料。

技术特征：

1.一种百香果微小茎尖体内嫁接方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种百香果微小茎尖体内嫁接方法，其特征在于，所述步骤s2包括以下步骤：先将砧木水平放置在体视显微镜工作台上，用普通透明胶带固定其茎杆、叶片，在抗氧化溶液的配合下，用注射器针头作手术刀，先对砧木茎上做纵向矩形嫁接切口。

3.根据权利要求2所述的一种百香果微小茎尖体内嫁接方法，其特征在于，所述注射器针头长1.5cm、φ0.3mm。

4.根据权利要求2所述的一种百香果微小茎尖体内嫁接方法，其特征在于，所述纵向矩形嫁接切口具体是在砧木的下胚轴上做1×0.5mm的纵向切口，再切除切口内部表皮组织和部分皮质。

5.根据权利要求2所述的一种百香果微小茎尖体内嫁接方法，其特征在于，抗氧化溶液的配合为在嫁接切口处滴入由100mg/l抗坏血酸和100mg/l柠檬酸组成的抗氧化溶液。

6.根据权利要求1所述的一种百香果微小茎尖体内嫁接方法，其特征在于，所述步骤s2接穗同砧木一样，用普通透明胶带将接穗固定在体视显微镜工作台上，用注射器针头从接穗上斜切取小于1mm、包含2-4个叶原基的茎尖，随即浸泡在抗氧化溶液中，5s后再用针头将茎尖移至砧木切口处，定位茎尖后，用手术刀在砧木嫁接切口上方去顶，然后固定茎尖，并在距离嫁接切口下端0.5cm包裹一团浸润抗氧化溶液的脱脂棉以保持湿度，最后移栽至基质中，并用保鲜膜包裹营养杯杯口以保持湿度，完成微小茎尖体内嫁接。

7.根据权利要求6所述的一种百香果微小茎尖体内嫁接方法，其特征在于，定位茎尖包括对齐茎尖与砧木的形态学上、下端后，使用注射器吸走抗氧化溶液，使两者吸附在一起。

8.根据权利要求6所述的一种百香果微小茎尖体内嫁接方法，其特征在于，固定茎尖包括用薄棉花包裹固定茎尖。

9.根据权利要求1所述的一种百香果微小茎尖体内嫁接方法，其特征在于，所述步骤s2包括微小茎尖体内嫁接在室温条件下进行，不需要无菌条件。

技术总结
本发明涉及果树繁殖领域，具体是一种百香果微小茎尖体内嫁接方法，包括以下步骤：（1）准备砧木及接穗；（2）微小茎尖体内嫁接方法：通过体视显微镜，在抗氧化溶液的配合下，用注射器针头作手术刀，先对砧木茎上做1×0.5mm的纵向矩形嫁接切口，再从接穗上切取小于1mm的茎尖并移至嫁接切口处定位，砧木去顶并固定茎尖后将嫁接苗移栽至基质中，完成微小茎尖体内嫁接；（3）嫁接后管理。本发明创新了微小茎尖体内嫁接技术，无需无菌条件，解决了微小茎尖固定不稳、易失水、难以与砧木充分结合等问题，从而实现小于1mm茎尖的体内嫁接，提高成活率，并达到脱毒的效果，为百香果脱毒苗繁育奠定基础。

技术研发人员：曾黎辉,罗怡,李越
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22