一种抗稻曲病水稻新品种选育方法及雾化接种器

本发明涉及水稻品种选育领域，更具体地说，它涉及一种抗稻曲病水稻新品种选育方法及雾化接种器。

背景技术：

1、稻曲病(false smut of rice,fsr)是无性阶段半知菌亚门绿核菌属(ustilaginoidea virens(cooke)tak)引起的水稻穗部真菌性病害，广泛分布于亚洲、非洲、南美洲、欧洲等水稻主产区的40多个国家。稻曲病导致空瘪率增加，千粒质量下降，降低水稻产量，病粒拌种能不同程度地降低水稻种子发芽率，同时稻曲病原菌次生代谢物稻曲病菌毒素(ustiloxins)，是一类具有阻断真核细胞有丝分裂活性物质，有较强的细胞毒性，对人畜和植物有毒害作用。

2、专利号：cn114041419b公开的一种抗稻曲病优质水稻新品种选育方法中，采用人工接种厚垣孢子并遮光处理筛选稻曲病抗源，利用杂交育种法将抗源性材料与品质性状优良的品种杂交，通过后代重组分离，选育出优良的水稻新品种。在抗稻曲病优质水稻新品种选育方法主要采用人工接种分生孢子的方式，即通过自然感病辅以人工喷雾接种稻曲病的厚垣孢子混悬液，并采取接种后遮光处理的方法，对水稻品种进行抗病鉴定，获得抗稻曲病的水稻品种。然而，这种方法无法提高接种可控性，不利于增强新品种的抗感染能力，且接种效果容易受到环境和作物影响，不稳定。

3、因此，需要提供一种新的抗稻曲病水稻新品种选育方法，能够高效、稳定地获得抗稻曲病优质水稻新品种，对于解决稻曲病威胁、提高水稻产量和优质稻米供应具有重要意义。

技术实现思路

1、为了解决抗稻曲病水稻新品种选育时人工接种存在的问题，本技术的第一个目的是提供一种抗稻曲病水稻新品种选育方法及雾化接种器，采用雾化接种器筛选稻曲病抗原，提高接种可控性。本技术的第二个目的是提供一种抗稻曲病水稻新品种选育的水稻筛选方法，通过在杂交培育过程中增加氮肥的使用，提高稻曲病的感染率，来增强新品种的抗感染能力，利用杂交育种将高产早熟的品种与抗稻曲病的品种杂交，通过重组分离选育出抗稻曲病、早熟、高产的水稻新品种。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种抗稻曲病水稻新品种选育方法，具体包含以下步骤：

4、(1)稻曲病抗性水稻品种的杂交选育；

5、(2)在病圃单株选择抗性品种；

6、(3)通过雾化接种进行稻曲病抗性鉴定；

7、(4)对品质性状进行分析获得抗稻曲病优质水稻新品种。

8、作为本发明的进一步方案，稻曲病抗性水稻品种的杂交选育，包括：

9、选择母本和父本：选择具有抗稻曲病性状的亲本水稻品种，进行杂交；其中，选择高产早熟水稻品种作为母本，选择抗稻曲病的品种，通过自然感病筛选并利用雾化接种器进行雾化接种稻曲病菌(magnaporthe oryzae)，从中筛选出具有抗稻曲病基因的水稻品种作为父本，其中，雾化接种器被用来均匀地将稻曲病菌的厚垣孢子混悬液喷洒在水稻植株上，模拟自然感染的过程，用于筛选出在自然环境中表现出抗性的水稻品种，筛选出的在自然环境中表现出抗性的水稻品种携带有抗稻曲病基因，用于作为父本；

10、配组杂交：去除母本花的雄蕊，将父本的花药授粉在母本柱头上，进行人工杂交，获得杂交后代；

11、单株选择：从杂交后代中选择具有抗稻曲病、早熟和高产性状的单株，连续多代进行单株选择，获得抗病、早熟、多产的选育品种。

12、作为本发明的进一步方案，利用雾化接种器进行雾化接种稻曲病菌，筛选出具有抗稻曲病基因的水稻品种作为父本时，通过分子标记技术进行筛选，使用pcr(聚合酶链反应)来鉴定水稻品种，包括以下步骤：

13、步骤1.dna提取：从水稻品种中提取总dna。

14、步骤2.设计引物：鉴定与稻曲病抗性相关的基因时，设计特定的引物(引导pcr扩增的dna片段)，引物根据已知的稻曲病抗性基因的dna序列设计，参考已有的文献和数据库可以获取dna序列信息。

15、步骤3.pcr扩增：使用设计好的引物进行pcr扩增，以放大目标dna片段。在pcr反应中，模板dna将与引物结合，dna聚合酶将在高温下合成新的dna链，其中，若样本中包含稻曲病抗性的dna将在pcr过程中被扩增。

16、步骤4.电泳分析：将pcr产物分析并可视化，通过琼脂糖凝胶电泳。

17、步骤5.比对和验证：将pcr产物与已知的稻曲病抗性基因的dna序列进行比对，以确定是否在样本中找到了基因或相关的dna序列，其中，使用测序技术来验证pcr产物的序列。

18、步骤6.结果解释：根据pcr结果和比对的信息，确定是否在水稻品种中检测到与稻曲病抗性相关的基因或dna序列。

19、步骤7.验证和深入研究：鉴定到的候选基因或dna序列进一步验证，确保与稻曲病抗性相关。

20、其中，通过pi-ta、pi-ta2、pi-ta-2、pi-b、pi9中任意一项水稻基因，作为水稻稻曲病抗性基因，在基因水平进行筛选，最后筛选出抗稻曲病基因的水稻品种作为父本。

21、作为本发明的进一步方案，在病圃单株选择抗性品种，包括：

22、选种圃准备：模拟自然感病条件，设置选种圃；

23、伪杂种去除：在选种圃内，从f1代起去除伪杂种；

24、抗性品种选择：从f2代起，在选种圃中选择无病、综合性状优良的单株，并进行自交繁殖，逐代增加稻曲病胁迫压力及氮肥量，以筛选出无病且综合性状优良的稻曲病抗性品种作为候选品种。

25、作为本发明的进一步方案，通过雾化接种进行稻曲病抗性鉴定，利用雾化接种器对候选品种进行稻曲病抗性鉴定，包括：将稻曲病菌的厚垣孢子混悬液用无菌水稀释后倒入雾化接种器进行雾化；所述雾化接种器包括雾化接种装置和防护罩，所述防护罩用于将水稻罩住，同时将雾化接种装置喷出的雾化水汽限制在防护罩范围内；其中，利用雾化接种器进行稻曲病抗性鉴定包括：

26、病原体培养：培养稻曲病菌的厚垣孢子混悬液，确保有足够的孢子供接种使用；

27、雾化接种：使用专门设计的所述雾化接种器，将稻曲病菌的厚垣孢子混悬液均匀喷洒在候选品种的叶片上，模拟自然感染过程；

28、接种后处理：接种后进行保湿保温处理，以促进病原体的感染，监测候选品种的叶片，评估抗病性能。

29、作为本发明的进一步方案，对品质性状进行分析获得抗稻曲病优质水稻新品种，包括：

30、对雾化接种后未出现病症的候选品种进行品质性状分析，通过综合评估，确定最终的抗稻曲病优质水稻新品种。

31、本发明的抗稻曲病水稻新品种选育方法，利用雾化接种器进行接种，能够更精确地模拟病原体的感染过程，提高了抗稻曲病性状的筛选效率和准确性，同时也有助于获得优质水稻新品种。这一方法可以显著加快抗稻曲病水稻品种的选育过程，为农业生产提供更多抗病优质水稻资源。

32、作为本发明的进一步方案，稻曲病抗性水稻品种的杂交选育中，采用单株选择法选择具有抗稻曲病性状的亲本水稻品种，包括以下步骤：

33、在稻曲病常年发生严重的稳定地块设置病圃，将在自然条件下已经受到稻曲病侵染的水稻株系种植于病圃内；在种植水稻的第二年或第三年，采用单株选择法，每年从种植群体中选取发病很轻或者不发病的单株，分单株收种；每一年所选单株的种子在下一年再次种植，继续采用单株选择法，从中再次选择发病很轻或者不发病的单株，以获得具有抗稻曲病性状的亲本水稻品种。

34、作为本发明的进一步方案，抗性品种选择时，在f2代中选择无病、综合性状优良的单株，收获种子，自交繁殖6～7代，每一代都在稻曲病胁迫压力下选择单株，且每隔2代逐渐增加施氮肥的量，直至获得表型稳定、一致、综合性状优良且无稻曲病发生的稻曲病抗性品种。

35、作为本发明的进一步方案，每隔2代逐渐增加施氮肥的量，具体为：f1代不施氮肥，f2、f3代施氮量为80kg/hm2，f4、f5代施氮量为160kg/hm2，f6代施氮量为240kg/hm2。

36、作为本发明的进一步方案，步骤s3中，通过雾化接种进行稻曲病抗性鉴定，雾化接种的步骤为：

37、培养稻曲病菌的厚垣孢子混悬液：将2g稻曲球培养于150ml pbs培养基中，培养2日，获得稻曲病的厚垣孢子混悬液，并置于孢子储存盒中；

38、稻曲病厚垣孢子随雾化水汽接种至水稻：接种时，将孢子储存盒中的稻曲病的厚垣孢子混悬液用2000ml无菌水稀释后倒入雾化接种器的孢子储存盒，通过雾化喷头喷出雾化水汽携带在防护罩范围内的空气中进行雾化；

39、通过雾化保湿直至结束：在水稻抽穗期，太阳下山后进行雾化接种，使稻曲病厚垣孢子随雾化水汽均匀地分布在防护罩内同一水平面的空气中，并持续雾化喷水以保湿保温；

40、其中，接种后持续雾化喷水，保湿保温，雾化液仅包含无菌水，以促进孢子的萌发和感染水稻。

41、作为本发明的进一步方案，步骤s3中，通过雾化接种进行稻曲病抗性鉴定时，雾化接种的为稻曲病厚垣孢子冻干粉，为稻曲病厚垣孢子混悬液冻干后所得，接种时雾化水蒸汽与冻干粉接触并携带，接种在水稻上；接种后持续用无菌水以0.2ml/min的速率进行雾化喷水，每隔30min雾化15min，以保持稻曲病厚垣孢子的湿润状态；

42、其中，厚垣孢子冻干粉的制备方法为：首先在150ml pbs培养基中培养2g稻曲球，然后将稻曲病的厚垣孢子混悬液进行冷冻干燥。

43、作为本发明的进一步方案，对稻曲病抗性鉴定时获得的抗稻曲病水稻品种进行整精米率、垩白度、食味品质、不完善粒含量、水份含量、直链淀粉含量的品质性状分析时，品质性状分析时的标准为：根据中华人民共和国国家标准—优质稻谷gb/17891-2017，选择符合优质粳稻国家二级及以上标准的水稻品种，即整精米率≧61.0％、垩白度≦4.0％、食味品质≧80分、不完善粒含量≦3.0％、水份含量≦14.5％、直链淀粉含量14.0％～20.0％，且病穗率≦3％，以获得抗稻曲病的优质水稻新品种。

44、第二方面，本发明还提供了一种抗稻曲病水稻新品种选育的雾化接种器，该雾化接种器用于实现上述的抗稻曲病水稻新品种选育方法，所述雾化接种器包括雾化接种装置和防护罩，所述防护罩包括上罩和下罩，所述上罩为长方体形，所述上罩内部中空、下端开口且上端封闭；所述下罩为长方体形，所述下罩内部中空、上下端开口且沿高度方向四周开设有通孔，通孔用于对防护罩内部通风；所述防护罩为透明材质。

45、作为本发明的进一步方案，所述雾化接种装置外部的一侧还设有可拆卸固定有孢子储存盒，孢子储存盒用于储存孢子混悬液；所述孢子储存盒固定在上罩内的顶部，孢子储存盒内底部填充有孢子冻干粉，孢子储存盒内底部的两侧开设有通槽。

46、作为本发明的进一步方案，所述雾化接种器的雾化接种装置还包括雾化水箱、导雾管和雾化喷头，雾化水箱通过导雾管连接雾化喷头，雾化喷头固定在上罩内的顶部，导雾管的出雾端与雾化喷头连通，导雾管的进雾端位于雾化水箱内液面的上方。

47、作为本发明的进一步方案，所述上罩内的顶部固定有弹性膜，并通过滚轮拉动弹性膜，使雾化水汽均匀吸附在水稻的表面和背面，以增强接种效果；

48、所述弹性膜为弧形橡胶膜，包括一个开口和一个凸面；弹性膜的开口与上罩内的气密固定；所述弹性膜的凸面远离上罩的顶部；所述弹性膜位于孢子储存盒的前方；

49、所述滚轮固定在上罩外部，所述滚轮由一根细绳缠绕,细绳的另一端固定在弹性膜的凸面顶端。

50、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

51、1.高效选育抗稻曲病品种：通过结合杂交选育、病圃单株选择、雾化接种抗性鉴定以及品质性状分析等多个步骤，本方法能够高效地选育出具有抗稻曲病性状的水稻新品种。不仅能提高水稻产量，还能减少病害对农作物产量的影响。

52、2.抗性与品质的综合考虑：本发明的抗稻曲病水稻新品种选育方法在选育过程中不仅关注抗稻曲病性状，还特别强调对水稻的品质性状进行分析。通过综合考虑抗性和品质两个关键因素，确保选育出的水稻品种不仅在抗病性方面具有优势，还能够满足市场和消费者对高质量食品的需求。

53、3.利用自然感病环境增强选择效果：在病圃单株选择步骤中，利用自然感病的条件下进行杂交后代的筛选，更真实地模拟了实际病害环境，从而增强了对抗稻曲病性状的选择效果。这有助于确保选育出的品种在实际生产环境中具有稳定的抗病性。

54、4.改进的雾化接种方法提高鉴定准确性：通过改进的雾化接种方法，在稻曲病抗性鉴定时，能够更精确地模拟病原体的感染过程，提高了抗性鉴定的准确性和可靠性。这有助于筛选出真正具有抗稻曲病能力的水稻品种。

55、5.综合考虑营养与抗性：通过每隔2代逐渐增加施氮肥的量，使水稻在不同营养条件下生长，更好地模拟了实际种植环境，同时加强了水稻的稻曲病抗性。这种综合考虑可以产生适应不同生长环境的水稻品种。

56、综上所述，本发明提供的抗稻曲病水稻新品种选育方法在提高抗病性的同时，注重品质性状，采用改进的雾化接种方法和综合选择策略，能够获得具有抗病性和优质性状的水稻新品种，为农业生产提供了有益的解决方案。

57、本技术的这些方面或其他方面在以下实施例的描述中会更加简明易懂。应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本技术。