一种用于研究藻类液态分泌物对拟南芥生长影响的培养基的制备方法

本发明属于生物，具体涉及一种用于研究藻类液态分泌物对拟南芥生长影响的培养基的制备方法及采用该培养基研究藻类液态分泌物对拟南芥生长影响的方法。

背景技术：

1、环境中的微生物对植物的生长发育有较大影响，主要是依赖其生长过程中产生的分泌物，多为液态，成分复杂。目前，大多数探究属于蓝藻门的铜绿微囊藻在生长对数期所产的蓝藻胞外分泌物(extracellular exudates of microcys tis aeruginosa,mae)对植物生长影响的研究需要将植物直接暴露在分泌物中(例如，郑桂来.2010.铜绿微囊藻与马来眼子菜、金鱼藻间的化感作用及其机理研究[d].云南大学.)。然而，该实验体系存在很多问题。首先，由于高等植物的个体较大，直接将其暴露在分泌物中对mae体积总量需求极大，尤其是在开展剂量-效应实验时，对分泌物及实验空间的需求量更高。该体系对资源存在极大浪费，获得的实验结果较为不稳定，不利于快速、有效的获得实验数据。例如，使用水培法种植菹草，一个浓度处理实验约需3-5升水培液，1～3升mae(薛赛莲.水培方法:cn201611170344.2[p].2017-05-10.)。其次，暴露实验使用的植物大多不是模式生物，不便于在基因和蛋白层面上开展相关作用机制的研究。最后，mae中包含的藻类培养基成分，容易对实验结果产生干扰。有效解决以上问题，将有助于高效、准确的观察mae对植物产生的效应，有利于从组学层面解析产生该效应的相关机制。

2、拟南芥(arabidopsis thaliana)作为公认的模式植物，具有植株个体小、形态特征简取、生长发育周期短等优点(lavenus j,goh t,roberts i,et al.2013.lateral rootdevelopment in arabidopsis:fifty shades of auxin[j].trends in plant science；马俊杰,郭凤丹,王兴军,等.2019.生长素合成、运输和信号转导调控植物胚胎早期发育[j].植物生理学报,55(05):547-557.)。目前，研究人员在拟南芥基因、蛋白等分子水平方面的研究极为深入，获得了完备的基因库数据和多种用于研究生长发育机制的突变体。因此，拟南芥在化合物对植物生长发育影响效应的研究中具有较大的利用潜力，是开展mae对植物产生效应及其机理研究的理想材料。除此之外，由于拟南芥个体小，采用拟南芥开展暴露实验对mae总量的需求较小。例如，开展一个浓度处理实验仅需0.1～0.3升mae，在14天内即可完成一个实验周期，获得大量平行数据，非常有利于获得稳定的实验结果。

3、目前，基于拟南芥开展的液态化合物效应研究往往以直接通过浇灌、喷洒等方法将化合物淋洒到种植于土壤基质中的拟南芥幼苗上，这会改变液态微生物分泌物中效应成分的生物有效性，进而影响进一步的实验。例如，张慧娟、蒋明发明的壬二酸诱导拟南芥对灰霉病抗性的专利中，使用壬二酸水溶液对拟南芥进行灌根和喷洒的方法进行处理(张慧娟，蒋明.壬二酸诱导拟南芥对灰霉病抗性的应用及其方法:cn202010393262.4[p].2021-11-19.)。虽然基于拟南芥开展的研究可以使用固体培养基。例如，傅淑、杨广等发明的拟南芥培养装置(傅淑，杨广，刘昭霞，等.一种促进油菜生根的培养基:cn201810874255.9[p].2018-11-20.)及刘寒冬发明的诱导拟南芥愈伤组织的专利中(刘寒冬.高效诱导哥伦比亚型拟南芥愈伤组织的方法及诱导培养基:cn201510824482.7[p].2018-05-29.)，但是上述利用固体培养基、液体化合物的方法均难以观察到拟南芥生长发育早期植株表型变化，尤其是根系发育的变化。因此如何克服现有技术的不足是生物技术领域亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种用于研究藻类液态分泌物对拟南芥生长影响的培养基的制备方法，并利用该培养基研究藻类液态分泌物对拟南芥生长影响。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种用于研究藻类液态分泌物对拟南芥生长影响的培养基的制备方法，包括如下步骤：

4、步骤(1)，固体培养基的配制：配制溶质浓度为1/2ms固体培养基5倍的固体培养基，调节ph至5.8；

5、步骤(2)，藻类液态分泌物的提取：将培养得到的藻液4℃离心后，使用0.45μm玻璃纤维滤膜对离心得到的上清液进行抽滤，然后过滤除菌，得到藻类液态分泌物；所述的藻类液态分泌物的浓度为1×107～2×107cells/ml；

6、步骤(3)，预热：对步骤(1)获得的固体培养基及步骤(2)获得的藻类液态分泌物分别进行预热；

7、若藻类液态分泌物需要稀释，则采用步骤(2)培养藻液的培养基进行稀释到目标浓度后，再进行预热；

8、预热温度不超过60℃；预热时长低于1小时；

9、预热后，藻类液态分泌物的温度应高于固体培养基的温度；

10、预热后的固体培养基应为液体状态；

11、步骤(4)，培养基的混合：

12、将预热后的固体培养基加入至预热后的稀释或不稀释的藻类液态分泌物中，混合均匀后，静置，即得用于研究微生物液态分泌物对拟南芥生长影响的培养基；

13、其中，预热后的固体培养基与预热后的稀释或不稀释的藻类液态分泌物的体积比为1：4。

14、进一步，优选的是，步骤(2)中，所述的藻类液态分泌物为蓝藻胞外分泌物。

15、进一步，优选的是，步骤(2)中，所述的藻类液态分泌物为铜绿微囊藻胞外分泌物；

16、所述的铜绿微囊藻采用hgz-145培养基于25±1℃下培养，每天摇动藻液2-3次，每隔3-5天对藻液进行转接，转接至新的hgz-145培养基中；

17、取藻液于4℃下以6000转/分钟的转速离心10分钟，然后取上清液，使用0.45μm玻璃纤维滤膜对离心得到的上清液进行抽滤，再使用0.22μm孔径的薄膜滤菌器过滤除菌，得到藻类液态分泌物。

18、进一步，优选的是，步骤(2)中，铜绿微囊藻培养时，光暗周期比为12l:12d；转接三次以上再进行藻类液态分泌物的提取。

19、进一步，优选的是，hgz-145培养基在使用前在121℃高温高压灭菌锅中灭菌30min。

20、进一步，优选的是，步骤(3)中，hgz-145培养基在121℃高温高压灭菌锅中灭菌30min后，利用灭过菌的hgz-145培养基对藻类液态分泌物进行稀释。

21、一种研究藻类液态分泌物对拟南芥生长影响的方法，采用上述用于研究藻类液态分泌物对拟南芥生长影响的培养基的制备方法制得的用于研究藻类液态分泌物对拟南芥生长影响的培养基，包括如下步骤：

22、在无菌环境，先使用消毒水冲洗拟南芥种子，再使用无菌水清洗多次后，将拟南芥种子均匀地点在培养基中，封口放入4℃环境中春化，两天后再放入培养箱中光照培育，观察光照培育的拟南芥表型，并进行分析，从而获得研究藻类液态分泌物对拟南芥生长影响结果。

23、进一步，优选的是，使用无菌水清洗3次；培育温度为恒温22℃，光暗周期比为16l:8d。

24、进一步，优选的是，研究藻类液态分泌物对拟南芥生长影响包括藻类液态分泌物对拟南芥作用的剂量-效应关系研究、藻类液态分泌物对拟南芥作用效应时间稳定性研究和藻类液态分泌物对拟南芥作用效应热稳定性研究。

25、不含糖和琼脂的1/2ms固体培养基的溶质及其浓度如下：硝酸钾950mg/l，硝酸铵825mg/l，磷酸二氢钾85mg/l，硫酸镁185mg/l，氯化钙220mg/l，碘化钾0.415mg/l，硼酸3.1mg/l，硫酸锰11.15mg/l，硫酸锌4.3mg/l，钼酸钠0.125mg/l，硫酸铜0.0125mg/l，氯化钴0.0125mg/l，乙二胺四乙酸二钠18.625mg/l，硫酸亚铁13.925mg/l，肌醇50mg/l，甘氨酸1mg/l，盐酸硫胺素0.05mg/l，盐酸吡哆醇0.25mg/l，烟酸0.25mg/l；ph为6.0。

26、步骤(1)中，拟南芥固体培养基需以实际使用浓度的5倍配制，琼脂、蔗糖浓度也应是实际浓度的5倍(添加量均为50g/l)，高于5倍则不利于高温消毒后的培养基保持液态形态。

27、步骤(2)中，为保证藻类液态分泌物不因高温高压灭菌条件下失活或者变性，需要将藻类液态分泌物在无菌操作环境中使用无菌针筒和0.22μm液相滤头进行过滤除菌；

28、优选，步骤(2)中，过滤时使用0.45μm玻璃纤维滤膜，灭菌时使用0.22μm孔径的薄膜滤菌器。

29、步骤(3)中，预热时长需低于1小时，温度控制在60℃以内，过长的保温时间和过高的温度可能导致其变性；本发明对步骤(3)稀释倍数不做限制，本领域技术人员可根据实际需求进行稀释；本领域技术人员应当知晓，稀释后的藻类液态分泌物的浓度范围为(0％，100％)，注：100％表示未稀释。

30、步骤(3)中，应使用已灭菌的步骤(2)培养藻液的培养基对藻类液态分泌物按比例进行稀释，因为步骤(2)培养藻液的培养基是用于培养藻液的培养基，提取到的藻类液态分泌物中含有该培养基的组分，所以不能使用灭菌的去离子水对藻类液态分泌物进行稀释。稀释后的藻类液态分泌物可先将其放入烘箱保温，使其温度不至于太低从而影响组分的均匀，使用时再将其从烘箱取出。注：稀释后，mae在培养基中的最终浓度不宜高于80％，否则容易导致培养基混合不均，培养基凝固不均匀。

31、步骤(4)中，混合时，应将固体培养基倒入藻类液态分泌物中，不能反过来，以防止混合时固体培养基中的琼脂组分遇冷凝固，导致混合不均匀影响实验结果。

32、本发明步骤(1)～步骤(4)均需要在超净工作台中进行。

33、本发明中，为避免长时间在超净工作台中操作导致藻类液态分泌物和固体培养基失温，应尽量减少上述材料在超净工作台中的时间，及时混合(宜在3～5分钟内将材料混合并完成倒板)；为避免称量溶液体积过程中称量容器温度过低导致溶液失温，应使用塑料材质或提前将玻璃材质的称量容器加热；操作人员戴消过毒的线手套避免混合培养基过程中被烫伤。

34、通过调整固体培养基、藻类液态分泌物、去离子水和培养基的比例，可开展藻类液态分泌物对植物作用的“剂量-效应”关系研究。

35、要点：在混合藻类液态分泌物与固体培养基时，使用已灭菌的步骤(2)培养藻液的培养基对藻类液态分泌物按比例进行稀释(如表1)，再将固体培养基与稀释液按1：4的比例混合以得到不同稀释度的培养基。

36、表1培养藻液的培养基对藻类液态分泌物按比例进行稀释的成分配制体积

37、

38、研究微生物液态分泌物对拟南芥生长影响时，可通过设计合理的对照以排除步骤(2)培养藻液的培养基(即hgz-145培养基)对实验结果的干扰。

39、要点：排除步骤(2)培养藻液的培养基对实验结果的干扰，应选用去离子水作为阴性对照，与添加了步骤(2)培养藻液的培养基的处理组进行比对(如表2)。通过将添加不同总量步骤(2)培养藻液的培养基的对照组与添加藻类液态分泌物的处理组进行对比，可以探究步骤(2)培养藻液的培养基是否对拟南芥生长发育产生了影响。

40、表2藻类液态分泌物浓度各梯度处理的阴性对照(藻液培养基对照)中各配制成分的体积

41、 藻类液态分泌物浓度梯度 藻类液态分泌物 步骤(2)培养藻液的培养基 固体培养基 去离子水 80％ - - 20ml 80ml 25％ - 25ml 20ml 55ml 8％ - 8ml 20ml 72ml 2.5％ - 2.5ml 20ml 77.5ml 0.8％ - 0.8ml 20ml 79.2ml

42、设计藻类液态分泌物稳定性实验，为后期分泌物中效应物的分离、鉴定打下基础。

43、开展藻类液态分泌物时间稳定性和热稳定性实验，观察经过以上处理后的藻类液态分泌物是否仍然能对拟南芥产生效应，由此进一步推断藻类液态分泌物中效应化合物的可能的种类。例如，时间稳定性较差(-20℃下保存一个月后丧失效应)，说明效应化合物的稳定性不足，不能通过冷冻的方式进行长期储存；热稳定性较差(60℃下加温6小时后丧失效应)，说明化合物在高温下会发生降解、变性或蒸发，有可能是挥发性物质或者蛋白质、多肽类化合物.

44、要点1：时间稳定性实验。将藻类液态分泌物在无菌条件下，于-20℃冰箱中保存一个月，随后观察处理后的藻类液态分泌物是否仍然能对拟南芥产生和未处理过的藻类液态分泌物一样的效应。如果效应丧失，则说明分泌物中产生效应的化合物容易在水中发生水解或分解过程，不能长期储存。

45、要点2：热稳定性实验。将藻类液态分泌物在无菌条件下，于60℃下加温6小时(该温度为常规天然化合物效应物研究中，对天然化合物进行浓缩的常用温度及处理时间)，随后观察处理后的藻类液态分泌物是否仍然能对拟南芥产生和未处理过的藻类液态分泌物一样的效应。如果效应丧失，则说明分泌物中产生效应的化合物在高温下会发生降解、变性或蒸发，有可能是挥发性物质或者蛋白质、多肽类化合物，不能用常规的天然产物分离技术路线进行分离。

46、本发明将液态蓝藻胞外分泌物以特定方法混合到固体培养基中，通过设计阴性对照以排除铜绿微囊藻液体培养基对实验结果的干扰，通过调整胞外分泌物和培养基的比例以开展分泌物对植物作用的“剂量-效应”研究，通过设计稳定性实验以推测胞外分泌物中产生作用组分的化学稳定性。该发明所设计的培养方法可以广泛地应用于其他探究微生物分泌物对拟南芥生长影响的类似研究中。

47、本发明与现有技术相比，其有益效果为：

48、本发明制备方法中所使用的固体培养基为适合拟南芥生长培养的，营养元素齐全的1/2ms固体培养基，通过将藻类液态分泌物添加到固体培养基中，使得拟南芥种子可以直接在含有藻类液态分泌物的固体培养基中生长，让研究人员可以研究藻类液态分泌物在拟南芥生长前期对植株生长产生的效应，为后面开展相关机制研究提供有力保障。

49、首先，经研究，相比现有方法，本发明改变了1/2ms的浓度倍数，是现有方法的5倍，这是为了在保证了营养元素含量不变，种类齐全的前提下能当加入藻类液态分泌物后也具有良好的固体成型效果；进一步在此基础上开展藻类液态分泌物对拟南芥侧根发育影响的相关研究。其次，经研究，相比现有方法，本发明通过阴性对照藻培养实验排除了mae中存在的铜绿微囊藻培养基可能对实验结果产生的影响。通过比较铜绿微囊藻培养基含量不同的处理之间，光照培养第7天的拟南芥侧根数据，以及含有不同浓度铜绿微囊藻胞外分泌物培养基处理组(表1)与铜绿微囊基处理组之间(表2)，光照培养第7天的拟南芥侧根数据，可探究铜绿微囊藻培养基是否会影响实验结果。

50、综上所述，本发明通过混合藻类液态分泌物和固体培养基来探究藻类液态分泌物对拟南芥发育的影响，其中的“剂量-效应”研究设计为该分泌物的生态风险评价提供了有效依据，其中用于探究藻类液态分泌物稳定性的实验设计为进一步分离该分泌物中实际效应物质的后续实验提供了重要指导。