一种高效的山桐子组织培养快繁方法与流程

本发明属于山桐子培养，特别涉及一种高效的山桐子组织培养快繁方法。

背景技术：

1、山桐子，又名油葡萄，属大风子科山桐子属高大落叶乔木，树形优美，秋日果实深红色，花单性，雌雄异株或杂性，圆锥状下垂，是优良的园艺观赏树种。山桐子单株产果量高，全果含油，油脂品质高，兼具多种保健功能，是重要的木本油料物种，被誉为树上“油仓”。

2、随着科学的进步，组织培养技术日趋成熟。由于山桐子具有较高的经济价值，所以，目前已有不少生产者使用组织培养技术来培育山桐子植株，并且取得了不错的效果，而且，山桐子组织培养方法以及培养基类型在行业内也已并非商业秘密，所有生产者均可轻松获得。

3、然而，采用现有的组织培养方法培育山桐子植株的过程中，不少组织并不能成功发育成山桐子植株，而且部分成功发育的山桐子植株也并不能成功结果。经深入研究，我们发现，目前的山桐子组织培育过程中，在初期缺乏有效地筛分放大，导致出现问题的组织并不能及时被发现以及剔除，此部分组织在培养基中，不仅自身最终不能发育成植株，而且还会释放毒素，影响其周边的组织的正常生长发育。

技术实现思路

1、本发明提供一种高效的山桐子组织培养快繁方法，用于解决现有的山桐子组织培养技术在培育山桐子植株时的成功率比较低的技术问题。

2、本发明通过下述技术方案实现：一种高效的山桐子组织培养快繁方法，包括：

3、步骤1：采摘三月份的山桐子植株新生的幼嫩枝芽，随后对所述幼嫩枝芽进行水培以及消毒处理；

4、步骤2：将水培和消毒处理之后的所述幼嫩枝芽切割成若干外植体，并对若干所述外植体进行编号以及消毒；

5、步骤3：在透明的培养容器中装入诱导愈伤组织培养基，所述培养容器的内部设置有若干网状隔片，若干所述网状隔片将所述培养容器的内部空间均分为若干个子腔室，在每个子腔室中分别置入一所述外植体，所述培养容器的外壁还设置有与若干所述子腔室一一对应的灯珠；

6、步骤4：使用摄像头实时采集每个所述子腔室中的外植体的图像信息，并将所述图像信息传递至计算机，利用图像处理技术处理所述图像信息，以判断所述外植体的切口处是否发生褐变，在某一所述外植体的切口发生褐变时，所述计算机驱动对应的所述灯珠点亮，在所述灯珠点亮时，工作人员将对应的所述子腔室中的外植体以及该外植体周围的诱导愈伤组织培养基取出，灯珠未点亮的子腔室中的外植体保留并长出愈伤组织；

7、步骤5：将所述培养容器中的所述诱导愈伤组织培养基更换为诱芽培养基，以利用所述诱芽培养基培养所述愈伤组织；

8、步骤6：使用所述摄像头间歇性采集每个所述子腔室中的组织的图片信息，并将所述图片信息传递至所述计算机，利用图像处理技术处理所述图片信息，以判断所述组织发育情况，在某一组织发育出现问题时，所述计算机驱动对应的所述灯珠点亮，在所述灯珠点亮时，工作人员将对应的所述子腔室中的所述组织取出，灯珠未点亮的子腔室中的组织保留并发育出侧芽；

9、步骤7：将所述培养容器中的所述诱芽培养基更换为增殖培养基，以利用所述增殖培养基培养所述侧芽，从而使得所述侧芽发育成长为丛生植株；

10、步骤8：将所述丛生植株从所述培养容器中取出并转接到生根基质，以使所述丛生植株生根。

11、进一步地，为了更好的实现本发明，所述培养容器的中部设置有网板，以将所述培养容器的内部空间分隔为上腔室和下腔室，所述网状隔片位于所述上腔室中，以将所述上腔室分隔为若干所述子腔室；

12、所述培养容器的底部连通设置进液管和出液管，所述进液管配置有进液阀门，所述出液管配置有出液阀门；

13、所述步骤5中，将所述诱导愈伤组织培养基更换为诱芽培养基的方法，包括：

14、步骤5.1：开启所述出液阀门，所述诱导愈伤组织培养基经所述出液管导出，随后关闭所述出液阀门；

15、步骤5.2：开启所述进液阀门，将所述诱芽培养基经所述进液管导入所述培养容器中，随后关闭所述进液阀门。

16、进一步地，为了更好的实现本发明，在所述步骤5.1和所述步骤5.2之间还包括：

17、步骤5.3：利用无菌水第一次稀释所述诱导愈伤组织培养基，随后将第一次稀释后的所述诱导愈伤组织培养基注入所述培养容器，使得所述组织在第一次稀释后的所述诱导愈伤组织培养基中浸泡1小时，随后开启所述出液阀门，使得第一次稀释后的所述诱导愈伤组织培养基从所述出液管导出，随后关闭所述出液阀门；

18、步骤5.4：利用无菌水再次稀释所述诱导愈伤组织培养基，随后将再次稀释后的所述诱导愈伤组织培养基注入所述培养容器，使得所述组织在所述再次稀释后的所述诱导愈伤组织培养基中浸泡1小时，随后开启所述出液阀门，使得所述再次稀释后的所述诱导愈伤组织培养基从所述出液管导出，随后关闭所述出液阀门；

19、步骤5.5：将无菌水注入所述培养容器，使得所述组织在无菌水中浸泡15分钟，而后开启所述出液阀门，使得无菌水从所述出液管导出，随后关闭所述出液阀门。

20、进一步地，为了更好地实现本发明，所述步骤7中，将所述诱芽培养基更换为增殖培养基的方法，包括：

21、步骤7.1：开启所述出液阀门，使得所述诱芽培养基经所述出液管导出，随后关闭所述出液阀门；

22、步骤7.2：开启所述进液阀门，将所述增殖培养基经所述进液管导入所述培养容器中，随后关闭所述进液阀门。

23、进一步地，为了更好地实现本发明，在所述步骤7.1和所述步骤7.2之间还包括：

24、步骤7.3：利用无菌水第一次稀释所述诱芽培养基，随后将第一次稀释后的所述诱芽培养基注入所述培养容器，使得所述侧芽在第一次稀释后的所述诱芽培养基中浸泡1小时，随后开启所述出液阀门，使得第一次稀释后的所述诱芽培养基从所述出液管导出，随后关闭所述出液阀门；

25、步骤7.4：利用无菌水再次稀释所述诱芽培养基，随后将再次稀释后的所述诱芽培养基注入所述培养容器，使得所述侧芽在所述再次稀释后的所述诱芽培养基中浸泡1小时，随后开启所述出液阀门，使得所述再次稀释后的所述诱芽培养基从所述出液管导出，随后关闭所述出液阀门；

26、步骤7.5：将无菌水注入所述培养容器，使得所述侧芽在无菌水中浸泡15分钟，而后开启所述出液阀门，使得无菌水从所述出液管导出，随后关闭所述出液阀门。

27、进一步地，为了更好地实现本发明，所述步骤4中，所述利用图像处理技术处理所述图像信息，具体为：

28、分析所述外植体的切口处以及靠近所述切口的所述诱导愈伤组织培养基的颜色变化情况，在切口处以及靠近所述切口的所述诱导愈伤组织均转变为褐色时，判定发生褐变发生。

29、进一步地，为了更好地实现本发明，所述步骤4中，将所述子腔室中的外植体以及该外植体周围的诱导愈伤组织培养基取出的方法，包括：

30、使用勺子将所述外植体以及所述外植体周围的所述诱导愈伤组织培养基一并舀走。

31、进一步地，为了更好地实现本发明，所述步骤6中，所述利用所述图像处理技术处理所述图片信息，具体为：

32、分析所述组织萌发的侧芽的透明度以及黄化程度，在所述侧芽的透明度达到百分之三十时，判定所述侧芽玻璃化，在所述侧芽颜色由绿色转变为黄色或者侧芽上出现黄色斑点时，判定所述侧芽黄化。

33、进一步地，为了更好地实现本发明，所述步骤6中，所述摄像头采集所述图片信息的间隔时间为5分钟。

34、进一步地，为了更好地实现本发明，所述步骤6中，所述工作人员将对应的所述子腔室中的所述组织取出，包括：

35、使用勺子将所述组织以及所述组织周围的所述诱芽培养基一并舀走。

36、本发明相较于现有技术具有以下有益效果：

37、(1)本发明提供的高效的山桐子组织培养快繁方法在愈伤组织生成过程中以及侧芽生成过程中，均使用摄像头进行监测，借助图像处理技术，准确无误地判定愈伤组织生成时的外植体切口褐变情况以及侧芽生成过程中的组织病变与否，从而帮助生产者在山桐子组织培养初期及时发现出现问题的组织，并且通过给外植体组织编号，从而能精确地定位出现问题的外植体以及组织，并且方便工作人员及时清除培养基中的问题组织，而且，在愈伤组织生成期间出现问题的外植体连同其周围的诱导愈伤组织培养基一并取出而从培养基中移除，这样，则可以最大化地降低出现问题的外植体对诱导愈伤组织培养基的污染，进而保证其余仍留在培养基中的外植体能正常发育。该方法相较与常规的山桐子组织培养方法而言，在培育前期即可准确且及时地发现出现问题的组织，并且尽快除去出现问题的组织，不仅可保证正常组织正常发育，而且可避免出现问题的组织培育成山桐子植株而造成的时间成本浪费，提高山桐子植株组织培养的效率。

38、另外，该方法中，在培育的不同阶段，采用更换不同培养基(具体为从诱导愈伤组织培养基更换为诱芽培养基，以及从诱芽培养基更换为增殖培养基)的方式来满足组织不同阶段生成发育所需影响，这样，在外植体发育成丛生植株的整个过程均是在一个培养容器中进行，再次期间，不需要使用工具夹取组织，从而可有效避免组织被工具夹伤的风险，进一步保证组织正常发育形成丛生植株，进而提高山桐子植株组织培养的成功率。

39、(2)本发明提供的方法中，在更换培养基时，首先是利用被稀释的前培养基浸泡组织，而后再利用无菌水浸泡而实现清洗组织，最后再将更换后的培养基加入，这样，可使得组织能够更顺利地适应新培养基，现有技术中，则是通过将组织从旧的培养基移植到新的培养基，组织的生长环境(培养基)瞬间变化，部分组织难以快速适应而出现黄化、玻璃化以及发育受阻等问题，采用本发明提供的上述方法，则可以有效避免组织所处环境时间产生较大程度的变化的情况，从而避免组织因培养基突变而引起的问题。

40、再者，无菌水浸泡组织15分钟，组织依然会正常的新陈代谢，消耗组织内的养分，在这15分钟内，组织内的旧养分消耗殆尽，所以组织处于饥饿状态，当使用新的培养基浸泡组织时，组织能够更加快速且有效地吸收新培养基中的营养成分。