一种肿瘤药敏动物模型的建模方法及其用途与流程

本发明属于动物肿瘤模型领域。具体涉及一种肿瘤药敏动物模型的建模方法及其用途。

背景技术：

1、肿瘤是目前人类面临的严重的恶性疾病，在治疗时个体差异大，目前临床上主要是基于医生经验的治疗尝试，无法迅速确定最佳治疗方案，导致治疗效果不佳，因此建立可靠的临床前模型，检测个体对药物的敏感性，对于个性化治疗的发展是至关重要的。理想的临床前模型应该是可复制的、高特异性、高敏感性、快速的，并且应该充分概括原位肿瘤的生物学特征。

2、到目前为止，已经开发了几种临床前肿瘤实验模型，包括2d细胞系，患者来源的异种移植模型(pdx模型)，患者来源的外植体(pde模型)，动物模型(基因工程小鼠模型-gemms)和患者来源的类器官(pdo)。

3、2d细胞系是用于药敏研究的最简单，最实惠和最常用的模型。目前全球已经产生了数千种肿瘤细胞系，它们可以被分类为代表不同肿瘤的不同组织学亚型的组。然而，这些细胞系不能完全反映肿瘤的异质性，也不能在分子遗传学水平上完全表征。此外，比较基因组学和转录组学分析显示，细胞系与相同组织学类型的临床样本之间几乎没有相关性，细胞系的广泛传代可能会引入具有不可预测的生物学意义的遗传改变。尽管细胞系是基础研究和药物筛选的宝贵替代工具，但尚不清楚细胞系研究产生的数据在多大程度上具有临床意义。

4、pdx模型的原理是将新鲜的肿瘤组织移植到免疫缺陷型小鼠体内。在不同的研究中，pdx的成功率差异很大，但人们普遍认为，异种移植物再现了原始癌症组织的组织学和基因组图谱。但pdx模型的生成相当费时费力，其传代操作也不容易。

5、pde模型相对容易生成，因为它们代表新鲜切除的肿瘤组织的离体培养。尽管pde模型具有可行性，并且在形态和遗传上与肿瘤组织相似，但其在肿瘤研究中的应用受到限制，主要是因为其生存能力问题和短期性限制了这些外植体的潜在应用。

6、类器官技术于2009年作为一种开创性的3d原代组织培养模型被引入，并迅速发展成为一种复杂且有前景的癌症研究临床前模型。类器官是一种，来源于干细胞(多能或组织驻留)或分化的正常细胞或癌细胞的3d培养模型，它们模仿健康或癌症组织的生物学和功能特征。目前，肿瘤类器官被应用于各种癌症(胃肠道、胰腺、肝脏、前列腺等)的基础研究中。尽管文献显示，类器官作为药敏模型，具有速度快，敏感性和特异性高的特点，但其缺少肿瘤微环境，限制了类器官的临床应用。

7、由于前述模型存在的诸多问题，目前患者临床靶向治疗主要还是依赖于基因检测的结果指导临床用药。依然存在很多弊端：1.当前基因检测所需时间较长，患者用药前的等待周期大概在1-1.5个月；2.基因检测受到检测技术的限制，可能会出现假阴性或假阳性结果，出现假阳或者假阴性结果均可能会影响临床治疗效果；3.基因检测同时可能存在基因检测的覆盖率不足，基因检测技术并不能覆盖所有基因或所有区域，有些突变基因可能未被检测到。因此基因检测并不能完整的反应整个肿瘤对于药物的敏感性；4.患者对基因检测推荐药物耐药后，存在无药可用的尴尬；5.基因检测在实验实施后，存在组织不可再利用性。

8、因此亟需构建一个较传统体内模型更高效，更敏感以及性价比更高的快速药敏模型。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种肿瘤药敏动物模型的建模方法及其用途。

2、本发明提供了一种构建肿瘤药敏动物模型的方法，包括如下步骤：

3、a)取肿瘤组织样本，得到组织标本；

4、b)将组织标本切块得到组织块，或者将组织标本消化为单细胞，培养得到肿瘤类器官；

5、c)将组织块或类器官移植到动物眼前房内，待眼前房移植物内出现新生血管，即可。

6、进一步地，所述肿瘤组织包括肝癌组织，肺癌组织，结肠癌组织，胃癌组织，胰腺癌组织，甲状腺癌组织，头颈肿瘤组织，甲状旁腺瘤组织，肾上腺肿瘤组织，胆管细胞癌组织，乳腺癌组织。

7、进一步地，步骤b)中，所述组织块大小为(0.5-2)mm×(0.5-2)mm×(0.5-2)mm；移植量为1-3块。

8、进一步地，将组织块移植到动物眼前房内，经过3-5天后动物眼前房移植物内出现新生血管。

9、进一步地，步骤b)中，肿瘤类器官的制备方法如下：

10、1)将组织标本剪成组织碎块，使用组织消化液消化肿瘤细胞组织，得到肿瘤组织单细胞；

11、2)使用基质胶重悬细胞，接种并培养，待类器官增殖密度达到50％以上后，收集。

12、进一步地，步骤1)中组织消化液为终浓度为0.5mg/ml胶原酶xi和0.2mg/ml的dna酶的advanced dmem f12溶液；

13、步骤2)中采用培养类器官培养基为加入添加有1％vol/vol的青霉素及链霉素双抗溶液，1％vol/vol l-丙氨酰-l-谷氨酰胺，10mmol/l 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)溶液，2％vol/vol b27培养基补充剂，1％vol/vol n2培养基补充剂，1.25μmol/ln-乙酰-l-半胱氨酸，100ng/ml表皮细胞生长因子(egf)，25ng/ml重组人r-spondin 1蛋白，100ng/ml成纤维细胞生长因子10(fgf10)，10mmol/l烟酰胺，和10.5μmol/l y-27632小分子抑制剂的dmem/f12溶液；

14、所述基质胶为matrigel基质胶；培养条件为在37℃、5％co2环境中进行培养。

15、进一步地，选取大小为(5-30)μm*(5-30)μm的类器官移植到动物眼前房；移植量1-3片类器官；移植类器官后，经过14-17天移植物内出现新生血管。

16、进一步地，所述动物为小鼠、大鼠或兔子；优选为小鼠。

17、本发明还提供了一种上述的方法制备得到的动物模型。

18、本发明还提供了一种上述的动物模型在药物筛选、药物毒性试验或免疫治疗试验中用途。

19、本发明提供了一种肿瘤药敏动物模型的建模方法及其用途，该模型以患者手术或穿刺组织本，或组织构建的肿瘤类器官到小鼠眼前房中，快速构建肿瘤药敏模型，该建模方法成功率高，建模速度快。

20、本发明方法所得到的模型通过使用活体成像技术，可以快速、动态地实时观测靶向药物肿瘤增殖(主要是肿瘤体积变化)和血管形成(新生血管的数量以及血管直径变化)的影响，实现了快速药物筛选，以寻找肿瘤治疗的最佳药物，可以为患者个体化精准医疗提供强有力的支持和保障。

21、本发明模型具有高敏感性，可以对药效进行动态无损评价，解决了药物筛选周期长和可靠性低等问题，为临床肿瘤治疗提供了新的指导模型。

22、本发明可以为医生提供立体的肿瘤形态和血管分布信息，有助于制定更为精准的治疗方案。此外，通过体外构建肿瘤的类器官模型以及眼前房内肿瘤的再植，可以实现肿瘤的再利用。同时，该模型还可以用于探索肿瘤干细胞直接或间接转化分新生血管的机制，寻找逆转血管转分化的关键靶点，为开发相关靶向药物提供体内模型支持。

23、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

24、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。