一种毛蚶抗弧菌新品种的育种方法

本发明涉及海产经济贝类遗传育种，特别是一种毛蚶抗弧菌新品种的育种方法。

背景技术：

1、毛蚶(scapharca subcrenata)隶属软体动物门，双壳纲，毛蚶(scapharca)属，俗称毛蛤、麻蚶、瓦楞子，是我国重要的经济贝类，主要分布于日本、朝鲜和中国等沿海滩涂。在中国，北起鸭绿江，南至广西都有分布，20世纪80年代以莱州湾、渤海湾、辽东湾和海州湾等资源最为丰富。毛蚶肉味鲜美、营养价值和药用价值高，深受广大消费者的青睐。然而，多年来受过度捕捞、自然栖息地被破坏和海洋工程等影响，毛蚶野生种群锐减或灭绝，例如2022年山东省沿海毛蚶的养殖产量不足1万吨(2023年渔业统计年鉴)，这直接导致养殖毛蚶遗传多样性和抗逆性的显著下降，已经严重制约毛蚶育苗和养殖业的健康发展。

2、近年来，海洋环境污染加剧，海水质量逐年恶化，导致弧菌感染频发，引起毛蚶等海产贝类大规模死亡事件屡有发生。已有资料显示，每年由弧菌等病原微生物引发的贝类死亡导致的经济损失高达20-30亿元。目前尚缺乏有针对性的预防和治疗方法。此外，免疫学相关研究的滞后阻碍了毛蚶抗病品种的选育进程。因此,我们迫切需要从毛蚶自身入手,通过现代育种技术尽快培育出优质、抗病的毛蚶新品种(品系)，以满足毛蚶苗种业和养殖业的健康、可持续发展的需求。

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、本发明目的在于针对毛蚶养殖业缺乏优良品种及现有养殖品种抗病能力差、养殖死亡率高等问题，提出一种毛蚶抗弧菌新品种的育种方法。

2、为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

3、一种毛蚶抗弧菌新品种的育种方法，利用半致死浓度的副溶血弧菌胁迫成体毛蚶，对15％存活的个体进行恢复以8％留种率筛选获得抗弧菌毛蚶种贝，进行室内车间育肥将毛蚶培育至性腺发育成熟，并于诱导产卵前通过灭活的副溶血弧菌诱导毛蚶产生可遗传的免疫因子；而后诱导毛蚶产卵，获得毛蚶f1代抗弧菌品系，再将f1代采用“北育南养”的繁育和养殖技术快速将毛蚶苗种培育至性成熟；此后，每年按照胁迫筛选种贝、增强子代免疫力和“北育南养”的方式连续选育即获得遗传稳定、性状优良的毛蚶抗弧菌新品种。

4、进一步的说，

5、1)弧菌胁迫筛选抗弧菌毛蚶种贝：利用半致死浓度的副溶血弧菌胁迫成体毛蚶，待毛蚶死亡率接近85％时，停止胁迫并将毛蚶置于常规养殖海水中恢复健康，然后以8％的留种率挑选个体大、健康无损的毛蚶作为种贝繁育下一代；

6、2)利用跨代免疫致敏增强毛蚶子代免疫力：将上述获得抗弧菌毛蚶种贝培育至性腺发育成熟，并于诱导产卵前注射灭活的副溶血弧菌诱导毛蚶产生可遗传的免疫因子，然后通过阴干结合升温海水刺激方法诱导毛蚶产卵，即为，毛蚶f1代抗弧菌品系；

7、3)采用“北育南养”的繁育技术快速培育毛蚶至性成熟：将上述获得毛蚶f1代抗弧菌品系幼虫在北方育苗场室内培育至变态附着，然后将毛蚶稚贝运至南方沿海滩涂进行中间培育和养成，进而实现“北育南养”将毛蚶培育至性成熟；

8、4)毛蚶抗弧菌新品种选育：将上述获得培育至性成熟个体按照步骤1)、2)和3)连续选育，待遗传稳定后，获得遗传稳定、性状优良的毛蚶抗弧菌新品种。

9、上述步骤1中成体毛蚶为野生成体毛蚶，或，具有抗病性的成体毛蚶；其中，具有抗病性的成体毛蚶为经步骤1)胁迫成体毛蚶，而后进行养殖获得的f1代的成体。

10、所述步骤1)将成体毛蚶置于终浓度3×107cfu/ml副溶血弧菌的海水养殖槽中胁迫，待毛蚶死亡率接近85％时，停止胁迫并将毛蚶置于常规养殖海水中恢复健康，然后以8％的留种率挑选个体大、健康无损的毛蚶作为种贝繁育下一代。

11、所述步骤2)对上述筛选的毛蚶种贝养育的水体以0.5-1.0℃/天的速率升温，每连续升温2℃后稳定1天，当养殖水温升至23℃时，停止升温并保持水温稳定在23±0.5℃，直至毛蚶性腺完全发育成熟，而后对每只性腺发育成熟的毛蚶注射3×108cfu的热灭活副溶血弧菌，阴干6小时后置于加有25℃过滤海水的孵化池中诱导产卵排精，建立毛蚶f1代抗弧菌新品系。

12、所述热灭活副溶血弧菌为将副溶血弧菌于液体培养基中培养至菌株浓度为3×108cfu，而后将悬液于80℃水浴锅中处理30分钟即获得热灭活副溶血弧菌。

13、所述副溶血弧菌为pl2菌株，其由青岛农业大学馈赠，同时文献lin,j.,ning,j.,lu,x.,chen,m.,cao,w.,wang,c.,2020.transcriptomic analysis and expression ofc-type lectins in response to vibrio parahaemolyticus challenge in scapharcasubcrenata.fish&shellfish immunology.106,365-373.中由相应描述。

14、所述步骤3)将上述获得毛蚶f1代抗弧菌新品系幼虫在北方育苗场室内培育至变态附着，待毛蚶苗种生长到10～15万粒/斤后，采用冷藏车运输或保温箱加冰空运方式运到南方沿海，然后将毛蚶苗种均匀播撒在软泥滩上养殖，待毛蚶苗种在软泥滩上养殖3个月规格可达600～800粒/斤，将毛蚶大规格苗种转移至附近池塘底播养殖，翌年4月上旬可将毛蚶大规格苗种培育至性成熟，用于胁迫处理和繁育下一代。

15、所述南北运输过程中运输温度控制在15℃或以下，运输时间在20小时内为宜。

16、上述毛蚶的副溶血弧菌半致死浓度为设置终浓度为5×103cfu/ml、5×104cfu/ml、5×105cfu/ml、5×106cfu/ml、5×107cfu/ml、5×108cfu/ml的副溶血弧菌浸泡感染成体毛蚶，常规海水养殖作为对照组，每组设置3个重复，每个重复60枚成体毛蚶，实验持续4天，确定成体毛蚶96小时副溶血弧菌半致死浓度为3×107cfu/ml。

17、上述有效致敏成体毛蚶的灭活副溶血弧菌注射浓度为设置3×105cfu、3×106cfu、3×107cfu、3×108cfu、3×109cfu的灭活副溶血弧菌注射组，注射pbs作为对照组，每组设置3个重复，每个重复60枚成体毛蚶，实验持续4天，通过细胞吞噬和凋亡、免疫酶活及基因表达等指标变化，确定有效致敏成体毛蚶的灭活副溶血弧菌注射浓度，经确定浓度为3×108cfu。

18、本发明所具有的优点：

19、(1)本发明采用胁迫育种和现代分子辅助育种相结合的育种技术方案，实现了目标性状的精准育种，显著增强了毛蚶抗弧菌新品系的抗弧菌性状。

20、(2)利用跨代免疫致方法显著提高子代的抗弧菌能力，可培育出广谱抗弧菌的毛蚶新品种，显著提高了养殖毛蚶抗弧菌感染的能力。

21、(3)本发明采用“北育南养”的毛蚶苗种繁育和养殖技术，充分利用南方沿海滩涂水温高、饵料充足、敌害生物少的优势，可显著提高毛蚶的生长速度，毛蚶抗弧菌新品系养殖12个月达到性成熟，可用于繁育下一代，显著缩短了育种周期。