本公开涉及包含核酸分子的转录盒，其中所述核酸分子包含编码异四聚体衔接蛋白复合体4(adaptor protein complex 4，ap-4)的至少一个亚基的核苷酸序列；包含所述转录盒的载体；包含所述载体的药物组合物；以及用于治疗ap-4遗传性痉挛性截瘫的载体或组合物。
背景技术：
：1、遗传性痉挛性截瘫(hereditary spastic paraplegia，hsp)是一种罕见的遗传性、进行性、下肢痉挛性障碍，总发病率为每100000人中有0.5-5.5人。年轻患者的遗传性痉挛性截瘫(hsp)通常以腿部无力和痉挛(僵硬)为特征，并且可能在以后的生活中导致进一步的并发症，可能需要拐杖、助行器或轮椅的辅助。hsp有多种不同的遗传类型，例如常染色体显性、常染色体隐性、x连锁和母系遗传(线粒体)形式，其中常染色体显性形式最常见，影响75-80％的hsp患者。cn1958605中公开了多种不同的用于识别导致不同形式hsp的基因突变的诊断方法，例如由基因kiaa1840(us10519503)或zfyve26(us2017152562)突变引起的常染色体隐性hsp(ar-hsp)，或由spg3a突变引起的常染色体显性hsp。2、ap-4相关遗传性痉挛性截瘫(ap-4-hsp)，有时也称为ap-4缺陷综合征或衔接蛋白复合体4(ap-4)缺陷，是由编码ap-4衔接复合体蛋白质亚基的四个基因中的任一基因的功能缺失突变引起的[10]。ap-4-hsp本质上是常染色体隐性遗传。由ap4b1基因突变引起的ap-4-hsp有时被称为痉挛性截瘫47型(spg47)或遗传性痉挛性截瘫47(hsp47)，它会导致ap4b1蛋白水平显著下降[2]。ap-4-hsp也可能由其他三个ap-4亚基的突变引起：ap4m1突变导致有时也称为spg50或hsp50的ap-4-hsp，ap4e1突变导致有时也称为spg51或hsp51的ap-4-hsp，ap4s1突变导致有时也称为spg52或hsp51的ap-4-hsp。无论致病突变发生在哪个基因中，ap-4-hsp的特征都非常相似。ap-4-hsp通常发病于儿童早期，导致痉挛、中度至重度智力障碍、言语障碍或失语、小脑畸形、癫痫、性格害羞，严重的情况下会导致四肢瘫痪[11]。迄今为止，全球已有199名儿童被诊断为ap-4-hsp[1]，然而，相关病例很可能没有得到充分报道。ap-4-hsp是进行性的，目前尚无疾病修饰疗法。因此，需要开发新的治疗方法来改善患有ap-4-hsp的受试者的治疗效果。3、ap4b1是ap-4异四聚体的一个组成部分(图1a)。完整的ap-4复合体由两个大的衔接蛋白(ε型亚基ap4e1和β型亚基ap4b1)、一个中等衔接蛋白(μ型亚基ap4m1)和一个小的衔接蛋白(σ型ap4s1)构成。ap-4复合体在离开反式高尔基体网络(tgn)的囊泡上形成非网格蛋白相关的包被，并可能参与将蛋白质从反式高尔基体网络靶向至内体-溶酶体系统(图1b)。它还参与上皮细胞中蛋白质向基底外侧膜的分选以及神经元中蛋白质的正确不对称定位。ap-4阳性tgn来源的囊泡对于自噬体的正确空间形成至关重要，因此ap-4复合体的缺失会损害远端轴突中的自噬体形成。因此，ap-4复合体对脑的正常功能至关重要。4、腺相关病毒(aav)载体是本领域已知的，与逆转录病毒或慢病毒载体相比，具有多种优势，例如其免疫反应温和、能够感染多种细胞，并且所需dna不会整合到基因组中，从而导致其他基因的潜在破坏和敲除，而是存储在细胞中的染色体外。aav包含约4.8千碱基(kb)的单链dna基因组，包含三个基因，其编码序列两侧是反向重复序列，这是基因组复制和包装所必需的。aav和修饰的aav载体的用途是本领域已知的，并公开于wo2019/032898、wo2020041498或wo2019/028306中。aav载体已完成多项i期和ii期临床试验，用于治疗囊性纤维化和充血性心力衰竭的基因递送，并获批用于治疗脊髓性肌萎缩症的疗法。5、在我们共同待决(co-pending)的申请wo2021/205028中(其内容被全部并入本文)，我们公开了包含编码ap-4多肽的核酸分子的转录盒。6、本文公开了优化的表达载体，其包括可操作地连接到适于在哺乳动物神经元(例如运动神经元)中表达的表达调控序列(expression control sequences)的ap-4核酸分子，以及在预防或治疗与hsp相关的症状中使用修饰的表达载体递送和功能性地替换功能异常的ap-4蛋白。本公开涉及修饰载体的开发，例如aav载体、增强型aav载体，包括编码ap-4复合体的蛋白质的核酸分子。技术实现思路1、根据本发明的一个方面，提供了一种分离的核酸分子，其包含：转录盒，其在第一和第二反向重复序列之间在5’到3’方向上包含：2、i)适合于在哺乳动物神经元中表达的启动子，其中所述启动子与增强子核苷酸基序相关(associated)；3、ii)内含子核苷酸序列；和4、iii)多聚腺苷酸化(polyadenylation)信号核苷酸序列；其中5、所述盒还包含核酸分子，所述核酸分子包含编码ap-4复合体的至少一种蛋白质的核苷酸序列。6、在本发明的一个优选实施方案中，所述增强子基序是cmv增强子。7、在本发明的一个优选实施方案中，所述cmv增强子基序包含seq id no:1中的核苷酸序列或其多态性核苷酸序列变体，或由seq id no:1中的核苷酸序列或其多态性核苷酸序列变体组成。8、优选地，所述杂交内含子包含seq id no:2中的核苷酸序列或其多态性序列变体，或由seq id no:2中的核苷酸序列或其多态性序列变体组成。9、在本发明的一个优选实施方案中，所述多聚腺苷酸化信号是生长激素(gh)多聚腺苷酸化信号。10、优选地，所述gh多聚腺苷酸化信号包含seq id no:4中的核苷酸序列或其多态性序列变体，或由seq id no:4中的核苷酸序列或其多态性序列变体组成。11、在本发明的一个优选实施方案中，所述启动子是鸡β肌动蛋白启动子。12、优选地，所述鸡β肌动蛋白启动子包含seq id no:3中的核苷酸序列，或由seq idno:3中的核苷酸序列组成。13、优选地，所述鸡β肌动蛋白启动子包含seq id no:28中的核苷酸序列，或由seq idno:28中的核苷酸序列组成。14、在本发明的一个优选实施方案中，所述转录盒包含seq id no:9中的核苷酸序列，或由seq id no:9中的核苷酸序列组成。15、多态性序列变体是与参考序列有一个或更多个核苷酸碱基(例如2个、3个、4个、5个或更多个碱基)差异的序列。16、在本发明的一个优选实施方案中，所述表达盒包含核酸分子，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：17、i)如seq id no:15(ap4b1)所示的核苷酸序列或多态性序列变体；18、ii)核苷酸序列，其中所述序列由于遗传密码而与(i)中限定的核苷酸序列简并；19、iii)核酸分子，所述核酸分子的互补链在严格杂交条件下与seq id no:15(ap4b1)20、中的序列杂交，其中所述核酸分子编码与包含ap-4复合体的多肽形成复合物(complex)的多肽；21、iv)编码包含如seq id no:16(ap4b1)所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；22、v)编码包含氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中所述氨基酸序列通过添加、缺失或取代如iv)所示的至少一个氨基酸残基而被修饰，其中所述多肽与包含ap-4复合体的多肽形成复合物。23、当两条互补的核酸分子发生一定量的氢键彼此结合时，就会发生核酸分子的杂交。杂交的严格性可以根据核酸周围的环境条件、杂交方法的性质以及所用核酸分子的组成和长度而变化。有关达到特定严格性所需的杂交条件的计算，在sambrook et al.,molecular cloning:a laboratory manual(cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,ny,2001)；和tijssen,laboratory techniques in biochemistryand molecular biology—hybridization with nucleic acid probes part i,chapter2(elsevier,new york,1993)中进行了讨论。tm是核酸分子的给定链有50％与其互补链杂交时的温度。以下是一组示例性的杂交条件，但并非是限制性的：24、非常高的严格性(允许具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列进行杂交)25、杂交：5x ssc，65℃，16小时26、洗涤两次：2x ssc，室温(rt)，每次15分钟27、洗涤两次：0.5x ssc，65℃，每次20分钟28、高严格性(允许具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％同一性的序列进行杂交)29、杂交：5x-6x ssc，65℃-70℃，16-20小时30、洗涤两次：2x ssc，室温，每次5-20分钟31、洗涤两次：1x ssc，55℃-70℃，每次30分钟32、低严格性(允许具有至少50％、55％、60％、65％、70％或75％同一性的序列杂交)33、杂交：6x ssc，室温至55℃，16-20小时34、洗涤至少两次：2x-3x ssc，室温至55℃，每次20-30分钟。35、在本发明的一个优选实施方案中，所述表达盒包含核酸分子，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：36、i)如seq id no:17(ap4e1)所示的核苷酸序列或多态性序列变体；37、ii)核苷酸序列，其中所述序列由于遗传密码而与(i)中限定的核苷酸序列简并；38、iii)核酸分子，所述核酸分子的互补链在严格杂交条件下与seq id no:17(ap4e1)中的序列杂交，其中所述核酸分子编码与包含ap-4复合体的多肽形成复合物的多肽；39、iv)编码包含如seq id no:18(ap4e1)所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；40、v)编码包含氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中所述氨基酸序列通过添加、缺失或取代如iv)所示的至少一个氨基酸残基而被修饰，其中所述多肽与包含ap-4复合体的多肽形成复合物。41、在本发明的一个优选实施方案中，所述表达盒包含核酸分子，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：42、i)如seq id no:19(ap4m1)所示的核苷酸序列或多态性序列变体；43、ii)核苷酸序列，其中所述序列由于遗传密码而与(i)中限定的核苷酸序列简并；44、iii)核酸分子，所述核酸分子的互补链在严格杂交条件下与seq id no:19(ap4m1)中的序列杂交，其中所述核酸分子编码与包含ap-4复合体的多肽形成复合物的多肽；45、iv)编码包含如seq id no:20(ap4m1)所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；46、v)编码包含氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中所述氨基酸序列通过添加、缺失或取代如iv)所示的至少一个氨基酸残基而被修饰，其中所述多肽与包含ap-4复合体的多肽形成复合物。47、在本发明的一个优选实施方案中，所述表达盒包含核酸分子，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：48、i)如seq id no:21(ap4s1)所示的核苷酸序列或多态性序列变体；49、ii)核苷酸序列，其中所述序列由于遗传密码而与(i)中限定的核苷酸序列简并；50、iii)核酸分子，所述核酸分子的互补链在严格杂交条件下与seq id no:21(ap4s1)中的序列杂交，其中所述核酸分子编码与包含ap-4复合体的多肽形成复合物的多肽；51、iv)编码包含如seq id no:22(ap4s1)所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；编码包含氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中所述氨基酸序列通过添加、缺失或取代如iv)所示的至少一个氨基酸残基而被修饰，其中所述多肽与包含ap-4复合体的多肽形成复合物。52、在本发明的一个优选实施方案中，所述盒适合于在运动神经元中表达。53、在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含seq id no:15所示的核苷酸序列或其多态性序列变体，或由如seq id no:15所示的核苷酸序列或其多态性序列变体组成。54、在本发明的一个优选实施方案中，提供了核苷酸序列或其多态性序列变体，其编码包含如seq id no:16所示的氨基酸序列的多肽。55、在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含seq id no:17所示的核苷酸序列或其多态性序列变体，或由如seq id no:17所示的核苷酸序列或其多态性序列变体组成。56、在本发明的一个优选实施方案中，提供了核苷酸序列或其多态性序列变体，其编码包含如seq id no:18所示的氨基酸序列的多肽。57、在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含seq id no:19所示的核苷酸序列或其多态性序列变体，或由如seq id no:19所示的核苷酸序列或其多态性序列变体组成。58、在本发明的一个优选实施方案中，提供了核苷酸序列或其多态性序列变体，其编码包含如seq id no:20所示的氨基酸序列的多肽。59、在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸分子包含seq id no:21所示的核苷酸序列或其多态性序列变体，或由如seq id no:21所示的核苷酸序列或其多态性序列变体组成。60、在本发明的一个优选实施方案中，提供了核苷酸序列或其多态性序列变体，其编码包含如seq id no:22所示的氨基酸序列的多肽。61、本文公开的多肽的氨基酸序列可能因一个或更多个取代、添加、缺失、截短而不同，这些取代、添加、缺失、截短可以以任何组合存在。优选的变体包括那些通过保守氨基酸取代而不同于参考多肽的变体。此类取代是用具有相似特征的另一种氨基酸取代给定氨基酸。以下非限制性氨基酸列表被视为保守取代(相似)：a)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷氨酰胺；d)精氨酸和赖氨酸；e)异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和缬氨酸；f)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。最优选的是保留或增强与参考多肽相同的生物功能和活性的变体(该变体变化自该参考多肽)。在一个实施方案中，多肽与本文所示的全长氨基酸序列或核苷酸序列具有至少70％的同一性，甚至更优选至少75％的同一性，更优选至少80％、85％、90％、95％的同一性和至少99％的同一性。62、在本发明的一个替代优选实施方案中，所述启动子是组成型启动子(constitutive promoter)。63、在本发明的另一个替代实施方案中，所述启动子是调控型启动子，例如诱导性启动子或细胞特异性启动子。64、在本发明的一个优选实施方案中，所述启动子选自由鸡β肌动蛋白(cba)启动子、鸡β肌动蛋白杂交(cbh)启动子、cag启动子、jet启动子、神经元和神经胶质特异性启动子(包括突触蛋白1(synapsin 1)、hb9、mep229和gfap启动子序列)，以及ap-4亚基特异性启动子区(包括ap4b1、ap4e1、ap4m1和ap4s1)组成的组。65、在本发明的一个优选实施方案中，所述启动子是如seq id no:9所示的鸡β肌动蛋白杂交(cbh)启动子。66、在本发明的一个替代优选实施方案中，所述启动子是如seq id no:28所示的鸡β肌动蛋白杂交(cbh)启动子。67、在本发明的一个替代优选实施方案中，所述启动子是包含seq id no:5中的核苷酸序列或由seq id no:5中的核苷酸序列组成的jet启动子。68、在本发明的一个替代优选实施方案中，所述启动子是包含seq id no:6中的核苷酸序列或由seq id no:6中的核苷酸序列组成的hsyn启动子。69、在本发明的一个替代优选实施方案中，所述启动子是包含seq id no:7中的核苷酸序列或由seq id no:7中的核苷酸序列组成的mep229启动子。70、在本发明的一个替代优选实施方案中，所述启动子是包含seq id no:8中的核苷酸序列或由seq id no:8中的核苷酸序列组成的ap4b1启动子。71、“启动子”或“转录启动子”是本领域公认的，为清楚起见，包括以下特征，这些特征仅作为示例提供，而并非限制性的。增强子元件是顺式作用核酸序列，通常位于基因转录起始位点的5’端(增强子也可以位于基因序列的3’端，甚至位于内含子序列中)。增强子(例如cmv增强子)的作用是增加增强子所连接的基因的转录速率(rate)。增强子活性对已被证明能特异性结合增强子元件的反式作用转录因子(多肽)有响应性。转录因子的结合/活性(请参见eukaryotic transcription factors,by david s latchman,academic press ltd,san diego)对多种生理/环境信号有响应性，其可以是组成型的或可调控的，也可以是细胞/组织特异性的。启动子元件还包括所谓的tata框和rna聚合酶起始选择(ris)序列，其功能是选择转录起始位点。这些序列还结合多肽，其功能包括促进rna聚合酶的转录起始选择。72、如本文所用，当包含启动子序列的第一核酸和编码多肽的第二核苷酸序列共价连接，从而使得第二核酸分子的表达或转录处于包含调控序列(regulatory sequence)的第一核酸分子的控制之下时，它们被称为“可操作地”连接。如果希望编码序列被翻译成功能蛋白，则如果在5’调控序列中诱导启动子导致编码序列的转录和mrna的产生，则两个dna序列被称为可操作地连接。因此，如果启动子区域能够影响该dna序列的转录，使得所得转录物(transcript)被翻译成所需的蛋白质或多肽，则启动子区域将可操作地连接到编码序列。73、根据本发明的另一方面，提供了包含根据本发明的转录盒的表达载体。74、病毒通常用作外源基因递送的载体。常用的载体包括重组修饰的有包膜或无包膜的dna和rna病毒，例如杆状病毒科(baculoviridiae)、细小病毒科(parvoviridiae)、小rna病毒科(picornoviridiae)、疱疹病毒科(herpesveridiae)、痘病毒科(poxviridae)、腺病毒科(adenoviridiae)、小核糖核酸病毒科(picornnaviridiae)或逆转录病毒科(retroviridae)，例如慢病毒(lentivirus)。还可以使用嵌合载体，其利用每个亲本载体特性的有利元素(参见例如feng,et al(1997)nature biotechnology 15:866-870)。此类病毒载体可以是野生型，也可以通过重组dna技术修饰为复制缺陷型、条件复制型或复制能力型(replication competent)。条件复制型病毒载体用于在特定细胞类型中实现选择性表达，同时避免不良的广谱感染。条件复制载体的示例在pennisi，e.(1996)science 274:342-343；russell，and sj(1994)eur.j.of cancer 30a(8):1165-1171中有所描述。75、优选的载体来源于腺病毒、腺相关病毒或逆转录病毒基因组。76、在本发明的一个优选实施方案中，所述表达载体是基于病毒的表达载体。77、在本发明的一个优选实施方案中，所述基于病毒的载体是腺相关病毒[aav]。78、在一个优选的实施方案中，所述基于病毒的载体选自由以下组成的组：aav2、aav3、aav6、aav13；aav1、aav4、aav5、aav6、aav9和rhaav10。79、在本发明的一个优选实施方案中，所述基于病毒的载体是aav9。80、在本发明的一个优选实施方案中，所述基于病毒的载体是增强型aav9载体，例如php-b载体。81、在本发明的一个优选实施方案中，所述aav载体基于单链aav病毒。82、在本发明的一个替代实施方案中，所述aav载体基于自互补的(self-complementary)aav病毒。83、自然存在的aav血清型通常包含单链基因组，该基因组在自然感染期间被复制以形成双链aav病毒基因组。这是aav复制和表达的限速步骤。包含适合立即表达和复制的正义和反义基因组链的重组形式的aav被称为自互补aav。基于病毒的载体可以包含编码卡那霉素抗性的基因，或者为了治疗可以缺少编码卡那霉素抗性的基因。84、在本发明的一个优选实施方案中，所述基于病毒的载体包含seq id no:10所示的核苷酸序列。85、在本发明的一个优选实施方案中，所述基于病毒的载体包含seq id no:11所示的核苷酸序列。86、在本发明的一个优选实施方案中，所述基于病毒的载体包含seq id no:12所示的核苷酸序列。87、在本发明的一个优选实施方案中，所述基于病毒的载体包含seq id no:13所示的核苷酸序列。88、在本发明的一个优选实施方案中，所述基于病毒的载体包含seq id no:14所示的核苷酸序列。89、在本发明的一个优选实施方案中，所述基于病毒的载体包含seq id no:23所示的核苷酸序列。90、在本发明的一个优选实施方案中，所述基于病毒的载体包含seq id no:24所示的核苷酸序列。91、在本发明的一个优选实施方案中，所述基于病毒的载体包含seq id no:25所示的核苷酸序列。92、在本发明的一个优选实施方案中，所述基于病毒的载体包含seq id no:26所示的核苷酸序列。93、在本发明的一个优选实施方案中，所述基于病毒的载体包含seq id no:27所示的核苷酸序列。94、优选地，选自由seq id no 10-14和23-27组成的组的所述基于病毒的载体序列缺少卡那霉素抗性基因，并且两侧为5’和3’反向末端重复(inverted terminal repeat，itr)序列。如现有技术中已知的，只有itr之间的序列被包装到临床病毒载体中并递送给患者。重组aav内编码的(两侧为itr的)转基因随后作为游离体(episome)存在于转导细胞(例如非分裂神经元细胞)的细胞核中并提供长期表达。95、在本发明的一个替代优选实施方案中，所述基于病毒的载体是慢病毒载体。96、根据本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其包含根据本发明的表达载体和赋形剂或载剂(carrier)。97、本发明的表达载体组合物以药学上可接受的制剂形式施用。此类制剂通常可含有药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载剂和辅助治疗剂。本发明的表达载体组合物可通过任何常规途径施用，包括注射或随时间逐渐输注。98、本发明的表达载体组合物以有效量施用。“有效量”是指单独或与其他剂量(dose)一起产生所需反应的表达载体的量。在治疗疾病的情况下，所需反应是抑制疾病的进展。这可能仅涉及暂时减缓疾病的进展，但更优选的是，它涉及永久停止疾病的进展。这可以通过常规方法进行监测。当然，这些量将取决于所治疗的特定病症、病症的严重程度、患者个体参数(包括年龄、身体状况、体型和体重)、治疗持续时间、并行治疗的性质(如果有)、具体的施用途径以及医疗从业者的知识和专业范围内的类似因素。这些因素对于本领域的普通技术人员来说是众所周知的，并且可以通过常规实验来解决。通常优选使用单个组分或其组合的最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而，本领域的普通技术人员应当理解，患者可能由于医学原因、心理原因或几乎任何其他原因而坚持要求较低剂量或可耐受剂量。99、上述方法中使用的表达载体组合物优选是无菌的，并且含有有效量的根据本发明的表达载体，以在适合施用于患者的重量或体积单位中产生所需的反应。施用于受试者的载体剂量可以根据不同的参数选择，特别是根据所用的施用方式和受试者的状态。其他因素包括期望的治疗期。如果受试者在所应用的初始剂量下反应不足，则可以在患者耐受所允许的范围内采用更高的剂量(或通过不同的、更局部的递送途径实现实际上更高的剂量)。本领域的普通技术人员将知道用于施用载体组合物的其他方案，其中剂量、注射时间表、注射部位、施用方式等与前述方案不同。向人类以外的哺乳动物施用组合物(例如，出于测试目的或兽医治疗目的)在与上述基本相同的条件下进行。本文所用的受试者是哺乳动物，优选是人类，并且包括非人类灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物。100、本发明的表达载体组合物在施用时以药学上可接受的量和药学上可接受的组合物施用。术语“药学上可接受的”是指不干扰活性剂生物活性的有效性的无毒物质。此类制剂通常可含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载剂和可选的其他治疗剂(例如，通常用于治疗特定疾病适应症的那些)。当用于药物时，盐应该是药学上可接受的，但非药学上可接受的盐可方便地用于制备其药学上可接受的盐，并且不排除在本发明的范围之外。此类药理学和药学上可接受的盐包括但不限于由以下酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。此外，药学上可接受的盐可以制备为碱金属或碱土盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。101、含有根据本发明的表达载体的药物组合物可含有合适的缓冲剂，包括盐中的乙酸、盐中的柠檬酸、盐中的硼酸和盐中的磷酸。药物组合物还可以可选地含有合适的防腐剂，例如：苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。102、表达载体组合物可以方便地以单位剂量形式存在，并且可以通过药学领域中众所周知的任何方法制备。所有方法都包括将活性剂与构成一种或更多种辅助成分的载体结合的步骤。制剂可以根据已知方法使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂也可以是无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如作为1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受溶剂包括水、林格氏溶液(ringer’s solution)和等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油(fixed oil)通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的固定油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。适合口服、皮下、静脉内、肌肉内等施用方式的载剂制剂可以在remington’spharmaceutical sciences,mack publishing co.,easton,pa中找到。103、根据本发明的另一方面，提供了用作药物的根据本发明的表达载体。104、根据本发明的另一方面，提供了用于治疗受试者的ap-4遗传性痉挛性截瘫的根据本发明的表达载体。105、优选地，所述受试者是儿科受试者。106、儿科受试者包括新生儿(0-28天)，婴儿(1-24个月)，幼儿(2-6岁)和青春期前儿童(7-14岁)。107、在本发明的一个优选实施方案中，所述ap-4-hsp是spg47108、在本发明的一个优选实施方案中，所述ap-4-hsp是spg50。109、在本发明的一个优选实施方案中，所述ap-4-hsp是spg51。110、在本发明的一个优选实施方案中，所述ap-4-hsp是spg52。111、痉挛性截瘫(spastic paraplegia，spg)与遗传性痉挛性截瘫(hsp)互换使用，因此spg47是hsp47，spg50是hsp50，spg51是hsp51，spg52是hsp52。112、根据本发明的另一方面，提供了用根据本发明的表达载体转染的细胞。113、在本发明的一个优选实施方案中，所述细胞是神经元。114、在本发明的一个优选实施方案中，所述神经元是运动神经元。115、根据本发明的另一方面，提供了一种治疗或预防ap-4遗传性痉挛性截瘫的方法，包括施用治疗有效量的根据本发明的表达载体以预防和/或治疗遗传性痉挛性截瘫。116、在本发明的优选方法中，所述ap-4-hsp是痉挛性截瘫47型(spg47)。117、在本发明的优选方法中，所述ap-4hsp是痉挛性截瘫50型(spg50)。118、在本发明的优选方法中，所述ap-4hsp是痉挛性截瘫51型(spg51)。119、在本发明的优选方法中，所述ap-4hsp是痉挛性截瘫52型(spg52)。120、根据本发明的另一方面，提供了一种测量治疗受试者的遗传性痉挛性截瘫的疗效的方法，其中所述受试者用本发明的表达载体或药物组合物治疗，所述方法包括：121、a)在施用根据本发明的表达载体或根据本发明的药物组合物之前，测量从患有遗传性痉挛性截瘫的受试者获得的生物样品中的神经丝l(neurofilament l，nfl)的水平，并且122、b)将所述水平与施用根据本发明的表达载体或药物组合物后从患有遗传性痉挛性截瘫的受试者获得的生物样品中的nfl水平进行比较，其中123、i)如果该nfl水平与步骤a)中获得的水平相比较低，则暂停使用表达载体或组合物的治疗，或124、ii)如果该水平与步骤a)中的水平基本相同，则继续利用根据本发明的表达载体或组合物进行治疗。125、在本发明的一个优选方法中，所述表达载体选自由seq id no 10、11、12、13、14、23、24、25、26和27组成的组。126、在本发明的一个优选方法中，b)中的所述样品是在施用后1、2、3、4、5或6天或1、2、3或4周之间获得的。127、根据本发明的另一方面，提供了一种测量患有遗传性痉挛性截瘫受试者的遗传性痉挛性截瘫治疗效果的方法，其中所述受试者用根据本发明的表达载体或药物组合物治疗，所述方法包括：128、a)测量从患有遗传性痉挛性截瘫并用所述表达载体或组合物治疗的受试者获得的生物样品中的神经丝l(nfl)水平，以及129、b)将所述水平与对照受试者的水平进行比较。130、在根据本发明的优选方法中，所述表达载体选自由seq id no 10、11、12、13、14、23、24、25、26和27组成的组。131、在本发明的优选方法中，a)中的所述样品是在用根据本发明的表达载体或药物组合物治疗后1、2、3、4、5或6天或1、2、3或4周之间获得的132、在本发明的优选方法中，所述方法还包括步骤c)，其中当从患有遗传性痉挛性截瘫的受试者获得的生物样品中的所述水平与从所述对照受试者获得的生物样品中的nfl水平相同或比其更低时，治疗有效并且暂停。133、在本发明的优选方法中，所述方法还包括步骤c)，其中当从患有遗传性痉挛性截瘫的受试者获得的生物样品中的所述水平高于从所述对照受试者获得的生物样品中的nfl水平时，治疗无效并且继续利用根据本发明的表达载体或药物组合物进行治疗。134、贯穿本技术说明书和权利要求书的描述，措辞“包含”和“含有”(“comprise”和“contain”)及其变体(例如“comprising”和“comprises”)，表示“包括但不限于”，并不旨在(且不会)排除其他部分、添加剂、组分、要素(integers)或步骤。“基本由……组成”表示具有基本要素但包括不会对基本要素的功能产生实质性影响的要素。135、贯穿本技术说明书和权利要求书的描述，除非上下文另有要求，否则单数形式包括复数形式。当使用不定冠词时，除非上下文另有要求，否则本说明书应理解为同时考虑复数和单数。136、与本发明的特定方面、实施方案或实施例结合描述的特征、要素、特性、化合物、化学部分或基团应理解为适用于本文描述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非存在不相容的情况。137、现在将仅通过实施例并参考以下附图来描述本发明的实施方案：138、图1–ap4复合体和功能：(a)ap4异四聚体复合体示意图，由大的β型和ε型衔接蛋白(β4和ε4，称为ap4b1和ap4e1)、中等μ型衔接蛋白(apμ4，称为ap4m1)和小σ型衔接蛋白(apσ4，称为ap4s1)构成。(b)ap4复合体功能示意图：1)ap4异四聚体被募集到反式高尔基体网络(tgn)，进而募集其运载物(cargo)蛋白，包括atg9。2)网格蛋白阴性囊泡(clatherinnegative vesicles)从tgn出芽。3)ap4复合体从囊泡中脱落并循环回tgn以进一步形成囊泡。4)剩余的囊泡与驱动蛋白(kinesin motor proteins)结合，并沿微管以顺行方向运输到细胞外围或远端神经元区室。5)atg9囊泡组装，促进自噬体形成；139、图2–ap4b1基因替代(ap4b1 gene replacement)的基因治疗载体的设计和验证。(a)已设计并就位的aav和lv示意图。(b)用表达gfp(+gfp)或hap4b1(+aav-hap4b1)的质粒转染后，对照(wt)或ap4b1敲除(ko)hela细胞裂解物的代表性蛋白质印迹。hap4b1在ko细胞系中的表达恢复了缺失的ap4b1蛋白表达。ap4b1表达的恢复也会将ap4e1亚基蛋白水平的表达恢复到wt水平。(c)在ap4b1-/-hela细胞中验证表达v5标记ap4b1的aav。(d)使用300000vg/细胞aav9-v5_hap4b1治疗10天后，用皮质神经元标记物map2(红色通道)和v5(绿色通道)一抗染色的非转基因大鼠皮质神经元。(e)非疾病对照成纤维细胞(ctrl)和spg47患者成纤维细胞(未经治疗(ut)和用不断增加的量的lv-v5_hap4b1治疗)的代表性蛋白质印迹，显示在患者突变细胞系中hap4b1表达的恢复(虚线左侧)。用400000vg/细胞aav9病毒载体治疗的非转基因大鼠皮质神经元的代表性蛋白质印迹：aav9-v5_spg47(hap4b1)；aav9-spg47(hap4b1)；aav9-gfp；未转导细胞；140、图3–使用atg9a作为读出指标(readout)来评估ab4b1基因替代的效果。(a)表明在crispr产生的hela敲除细胞模型中atg9a异常定位至tgn反式高尔基体网络(tgn)。在ap4b1-/-hela细胞中，atg9a异常定位在转染编码ap4b1的aav9构建体后得到恢复(b)。lv转导患者细胞的代表性蛋白质印迹显示hap4b1表达得到恢复和v5标记的检测(c)，在(d)中量化。转导的患者细胞也显示atg9a表达得到恢复(e)，在(f)中量化。数据以平均值+/-平均值的标准误差(sem)表示，n＝3。数据通过单因素方差分析(anova)进行分析，然后相对于ctrl进行事后dunnett多重比较检验。星号表示p≤0.05(*)；p<0.0001(****)；ns＝不显著。(g)慢病毒载体(lv)介导的在spg47患者原代成纤维细胞中的atg9a异常定位校正。用lv-v5_hap4b1治疗后，标有白色星号的spg47患者细胞显示异常定位的atg9a得到恢复；141、图4–概念验证研究1：生化和解剖学评估。目的是评估aav9-cbh-ap4b1基因替代对ap4b1-/-中发现的关键生化和解剖学缺陷的影响。(a)研究设计。根据基因治疗递送的两种主要范式，在p1小鼠中注射aav9：通过小脑延髓池内(intra-cisterna magna，icm)进行脑脊液内(intra-csf)递送或通过面部静脉进行静脉内(iv)递送。(b)研究中使用的样品量。(c)小脑延髓池内仅递送aav9-v5和递送aav9-v5-hap4b1在转导cns的所有区域方面优于静脉内递送。通过qpcr确定大脑、脊髓和小脑中的病毒生物分布。每个组织n＝3，结果显示为平均值±sem。142、图5–在诱导cns的所有区域的hap4b1 mrna表达方面，小脑延髓池内递送aav9-v5-hap4b1优于静脉内递送。大脑、脊髓和小脑中hap4b1 cdna的rt-qpcr。每种组织n＝3，结果显示为平均值±sem。143、图6–aav9-cbh-hap4b1基因疗法介导ap4b1-/-小鼠模型中的脑重量不足的恢复。用aav9空(empty)对照(v5)或表达v5标记的hap4b1病毒的aav9治疗小鼠。hom＝ap4b1-/-。144、图7.icm递送aav9-v5-hap4b1恢复小鼠cns中的ap4e1蛋白水平，且优于静脉内递送。蛋白质提取物的蛋白质印迹显示，在用icm注射aav9-v5-hap4b1治疗的小鼠中，小鼠大脑(a)和脊髓(b)中的ap4e1水平得到恢复。静脉内递送仅在脊髓中诱导可检测到的ap4e1恢复。每个组织n＝3，定量数据显示为平均值±sem。145、图8.ap4b1(-/-)小鼠脑中atg9a的异常定位(mislocalised atg9a)、侧脑室增大及胼胝体(corpus callosum)厚度减小。小脑切片中的atg9a免疫染色显示，ap4b1(-/-)小鼠的浦肯野(purkinje)细胞层和深部小脑核中出现异常定位和表达增加(a)。在ap4b1(-/-)小鼠的neun染色的冠状脑切片中，用虚线突出显示侧脑室。图表显示与wt动物相比，侧脑室面积的变化倍数的量化结果。n＝3，通过kolmogorov-smirnov检验分析。***p≤0.001(b)。用苏木精和伊红(h&e)染色的冠状切片显示ap4b1(-/-)小鼠的胼胝体厚度减少。图表显示(相对于切片厚度标准化的)胼胝体厚度的量化结果，其作为与wt动物相比的变化倍数。数据显示为平均值±sem，n＝3，通过kolmogorov-smirnov检验分析。*p<0.05(c)。比例尺：150μm(a)；500μm(c)。mo＝分子层，pc＝浦肯野细胞层，gr＝颗粒细胞层，dcn＝深部小脑核，h&e＝苏木精和伊红，atg9a＝自噬相关蛋白9a，cc＝胼胝体。146、图9.aav9介导的ap4b1基因替代使ap4b1-/-小鼠模型中的(a)胼胝体厚度和(b)侧脑室增大得以恢复。147、图10.spg47小鼠模型中的aav9基因替代ap4b1恢复小脑和脑干中atg9a的正常定位。148、图11.ap4b1(-/-)小鼠表现出后肢紧抱(hindlimb clasp)。显示了代表性的非紧抱(wt)和紧抱(ap4b1(-/-))图像(a)。3月龄时表现出后肢紧抱的wt和ap4b1(-/-)小鼠的百分比(b)。aav9-cbh-ap4b1治疗降低ap4b1-/-中的紧抱表型。149、图12.野生型小鼠的预试安全性研究。用经icm递送的aav9-cbh-ap4b1治疗的小鼠在长达6个月的时间内没有出现任何副作用迹象。在脑、脊髓和外周器官中评估了mrna转基因表达(a)和病毒基因组分布(b)。aav基因治疗对小鼠的体重和功能性运动协调性没有不良影响，在治疗后4周(b)和6个月(c)用转棒仪(rotarod)测量。n＝5150、图13展示了ap4b1内源性启动子序列；151、图14在mep229、ap4和hsyn启动子的控制下，hela细胞中的gfp表达。术语“mock”表示没有gfp表达的对照。如图所示，检测到了所有三个启动子下的表达。对每个样品使用三个重复(three replicas)进行实验。数据以平均值+sd表示。152、图15：经aav9-cbh-hap4b1治疗的小鼠在最高达180天体重随年龄增加。治疗在～p60。(雌性仅至165天)。153、图16：接受治疗的小鼠的后肢紧抱。a.显示未治疗的和仅v5(v5_only)治疗的spg47小鼠(ap4b1-/-)的紧抱严重程度随时间的进展。野生型小鼠在此期间没有表现出后肢紧抱进展。所有3个治疗组均显示后肢进展严重程度减轻。b和c是分别从120日龄或135日龄的一个时间点提取的紧抱数据。两张图都清楚地显示了所有治疗后后肢紧抱严重程度的减轻。154、图17：治疗后4个月(～p180)转棒仪跌落延迟时间(rotarod latency to fall)。155、图18：脑提取后的脑重量。注射后2个月的雌性(～p120)。注射后4个月的雄性(～p180)。156、图19：注射后4个月的初步胼胝体变薄分析(仅雄性)。a图显示胼胝体(cc)处于相对冠状位置。在位置1和位置8之间每隔一个切片取样进行cc分析。b显示了穿过脑时cc宽度的变化。与野生型cc厚度相比，spg47仅v5(v5_only)组显示cc厚度减小，该数据表明这种表型可以通过高剂量(high-dose)治疗恢复。此处的cc宽度测量值已针对每个脑切片进行标准化。c和d是从单个位置提取的数据，显示相同的结果。157、图20aav9-ap4b1基因替代对脑脊液(csf)和血浆中神经丝l(nfl)水平的影响。ap4b1-/-小鼠在p1时通过小脑延髓池用aav9-hap4b1载体治疗。wt：野生型，ut：未治疗的ap4b1-/-，v5：用对照空载体治疗的ap4b1-/-，cbh：用aav9-cbh-ap4b1治疗的ap4b1-/-，syn：用aav9-synapsin 1-ap4b1治疗的ap4b1-/-。158、seq id no汇总表159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、材料和方法178、道德声明179、所有动物体内实验均经谢菲尔德大学伦理审查小组委员会(university ofsheffield ethical review sub-committee)、英国动物程序委员会(uk animalprocedures committee,london,uk)批准，并根据《1986年动物(科学程序)法》(animal(scientific procedures)act 1986)在项目许可证40/3739下进行。c57bl/6j-ap4b1em5lutzy/j小鼠和非转基因c57bl/6j小鼠饲养在受控设施中，采用12小时黑暗/12小时光照周期(早上7点开启/晚上7点关闭)，可自由进食和饮水。报告本研究时遵循了arrive指南(arrive guidelines)。180、病毒载体构建181、主要的临床载体paav-cbh-hap4b1-kan(seq id no 11)由genewiz合成。简而言之，将cbh启动子(seq id no 9)、目的基因(hap4b1 seq id 15)和人生长激素(hgh)poly(a)信号(seq id no 4)克隆到genewiz质粒骨架中的两个aav2反向末端重复序列(itr)之间。cbh启动子最初由grey sj,et al.2011设计和描述为一种新型、增强型鸡β肌动蛋白(cba)启动子的杂交形式。cbh能够提供高水平、泛神经元表达(ubiquitous neuronalexpression)，包括运动神经元(gray et al 2011)。cbh启动子由三部分构成：cmv增强子(seq id no 1)、鸡β肌动蛋白启动子(seq id no 3)以及由cba内含子1和小鼠细小病毒(minute virus of mice，mvm)vp内含子形成的杂交内含子(seq id no 2)。与标准cmv增强子相比，seq id no 1中详述的cmv增强子含有18bp缺失。5’itr和cbh启动子、cbh启动子和hap4b1、hap4b1和hgh poly(a)信号以及hgh poly(a)信号和3’itr之间存在短接头序列。质粒骨架还含有3’itr下游的f1噬菌体复制起点、其下游的卡那霉素抗性基因以及5’itr上游紧邻的高拷贝数(puc)复制起点。完整质粒由6443bp构成，其中包装成aav9的区域包含3895bp。182、初步安全性研究——p1小鼠的小脑延髓池递送病毒基因治疗构建体。183、出生后第1天(p1)野生型c57bl/6j小鼠用异氟烷麻醉。诱导发生在5％异氟烷、3lo2/分钟的腔室中。注射期间，通过面罩以1-2％异氟烷、0.3l o2/分钟维持麻醉约5分钟。小脑延髓池使用wee-sight透照式静脉定位仪(transilluminator vein finder)(phillips)定位。使用含有33号汉密尔顿(hamilton)注射器和自动灌注泵的立体定位仪将病毒载体直接注射到p1小鼠(每组n＝15)的小脑延髓池中。溶液以每分钟1μl的流量施用；每只动物施用的最大溶液体积为5μl。每只动物接受的最大剂量为5×10 10个总载体基因组。实验时间表如下：184、第1天–出生后第0天，出生当天(p0)–采用脚垫纹身用于识别目的185、第2天–出生后第1天(p1)–在异氟烷麻醉下，向小脑延髓池注射最多5μl的病毒载体或媒介物(vehicle)溶液。186、第29天(或第170天)–出生后第28天(p28)或p168(注射后6个月)–动物在终末麻醉下进行灌注，并收集组织样品进行分析。187、在p1小鼠中通过小脑延髓池递送病毒基因治疗构建体作为概念验证。188、随后进行一项研究，以评估我们的治疗性病毒载体通过小脑延髓池注射后在缺乏内源性ap4b1的转基因小鼠(ko c57bl/6j-ap4b1em5lutzy/j)的中枢神经系统(cns)中介导转基因表达的能力。小鼠按照之前描述的安全性研究通过小脑延髓池注射。使用了两种病毒载体：一种表达人ap4b1(spg47)基因全长拷贝的aav9和一种表达v5标记而没有除此之外的编码序列的aav9作为病毒对照。接受aav9-hap4b1病毒载体的小鼠注射了两种不同剂量(分别为2×1010个载体基因组的低剂量和4×1010个载体基因组的高剂量)，而接受aav9-v5的小鼠仅注射了高剂量(4×1010个载体基因组)。研究中还包括另外两组：未治疗的ko c57bl/6j-ap4b1em5lutzy/j和未治疗的wt c57bl/6j-ap4b1em5lutzy/j。与未治疗的小鼠相比，通过行为参数的改善来评估经治疗的小鼠的表型的恢复，这将在下文中详细描述。189、基因分型和种群维持190、c57bl/6j-ap4b1em5lutzy/j小鼠由jackson实验室使用crispr-cas9介导的小鼠ap4b1基因外显子1内76bp区域的缺失所构建。该区域的缺失导致移码突变和截短的mrna转录物。wt序列(缺失部分以小写字母标示)：ttggcgacgatgccataccttggctctgaggacgtggtgaaggaactgaagaaggctctgtgtaaccctcatattcaggctgataggctgcgctaccggaatgtcatccagcgagttattaggtatcaccaacctaccatagaa。191、小鼠基因分型是根据charles river laboratories优化的方案进行的。通过向由尾尖或耳部组织提取的基因组dna中加入20μl的quickextracttmdna提取溶液(lucigen)，并在热循环仪中65℃孵育15分钟，随后98℃孵育2分钟，进行小鼠基因分型。基因分型pcr在20μl体积反应中进行，作为wt和ko等位基因的分离反应。反应由以下组成：5μl 5x即用型预混反应液(master mix ready to load)(含有7.5mm mgcl2，solisbiodyne)、500nm各基因分型引物–p1+p2用于wt等位基因扩增，p1+p3用于ko等位基因扩增–(p1:5’-tcgcccgaggacccaagaa-3’(seq id no 29)；p2:5’-cctatcagcctgaatatgagggttaca-3’(seq id no 30)；p3:5’-gctggatgacattccggtatatg–3’(seq id no 31))和1μl来自quickextracttm方案的基因组dna。根据表1所示的热曲线进行降落pcr(touchdown pcr)。经过pcr和琼脂糖凝胶电泳(2％琼脂糖凝胶，在tris-乙酸-edta缓冲液中)后，wt和ko等位基因pcr产物分别在约254bp和约203bp处可见。192、将杂合子小鼠一起繁殖，产生纯合wt(ap4b1+/+)、纯合ko(ap4b1-/-)和杂合(ap4b1+/-)同窝仔。193、表1–c57bl/6j-ap4b1em5lutzy/j基因分型的降落pcr条件pcr条件194、195、rt-qpcr用于人和鼠ap4b1表达分析。196、rt-qpcr如下进行：使用2μl总rna(在无核酸酶水中稀释至浓度为10ng/μl)，5μl的2x quantifast sybr green rt-pcr master mixhap4b1(正向：5’–ctggtgaacgatgagaatgt-3’(seq id no 32)；反向：5’–gacccagcaactctgttaaa-3’(seq idno 33)，map4b1(正向：5’–ctgtgctaggctcccacatc–3’24(seq id no 34)；反向：5’–tggcactggcctttaccatt–3’(seq id no 35)和18s(正向：5’gtaacccgttgaaccccat 3’(seqid no 36)；反向：5’ccatccaatcggtagtagcg 3’(seq id no 37)引物(浓度均为1μm)、0.1μlquantifast rt mix和h2o至最终体积为10μl。在50℃下进行10分钟的初始逆转录步骤，在95℃下进行5分钟的变性步骤之后，通过39个循环扩增cdna，每个循环95℃10秒，然后在60℃下进行10秒的组合退火/延伸步骤。接着在65℃下进行31秒的一个循环，然后进行熔解曲线分析。所有rt-qpcr均在bio-rad c1000 touchtm热循环仪上进行。使用bio-rad cfxmanager软件分析信号强度，并使用δδct方法确定相对基因表达值，使用18s rrna为参考基因。197、旷场(open field)198、对6、9和12个月龄的小鼠进行旷场分析。遵循herranz-martin及其同事8制定的方案进行。将小鼠放置在一个尺寸为60cm×40cm×25cm的半透明盒子中。盒子底部用永久性墨水标记出5×3的方形网格。活动性以每只小鼠在10分钟内越过网格线的数量来衡量。要记录越过网格线，要求动物的四只爪子都越过网格线。评估在最低光照条件下进行，每只动物之间用70％乙醇清洁仪器。在每个时间点为每只动物记录一轮。199、转棒仪200、使用ugo basile 7650加速转棒仪(设置为在300秒内从3rpm加速至37rpm)测量运动功能。转棒仪训练连续3天进行，每天两次。随后，此测试于上午晚些时候以每两周一次(特性研究)或每月一次(概念验证研究)进行。每次评估时，对小鼠进行两次测试，每次测试之间至少休息5分钟。以跌落延迟时间(以秒为单位)测量的最佳表现用于分析。记录转棒仪活动的最小阈值为3秒。201、步态分析202、使用catwalktm步态分析系统7.1版评估ap4b1-ko和wt小鼠的步态参数。对3、6、9和12个月龄的小鼠进行测试。将小鼠放在完全黑暗的仪器上，记录它们的步态模式。记录每只小鼠六次非强迫跑动(run)，并选出三次进行分析。待分析的跑动是基于不存在行为异常(例如嗅探、探索和站立(rearing))并且小鼠运动连贯且没有明显的加速、减速或偏离直线的情况而选择的。使用noldus软件处理步态数据。手动确定肢体，自动计算步态参数。将参数值传输到graphpad prism进行统计分析。203、抗体204、本研究中使用的一抗是小鼠抗α-微管蛋白(mouse anti-α-tubulin)(1:5000；sigma)、小鼠抗gapdh(1:10000；millipore)、兔抗v5(1:1000；abcam)、兔抗β4(由j.hirst提供的内部非商业抗体)(1:400)、兔抗atg9a(1:1000；abcam)、羊抗tgn46(bio-rad)、抗map2。205、用于蛋白质表达分析的蛋白质提取和蛋白质印迹分析。206、在终末麻醉状态下从小鼠采集组织，并在液氮中速冻。使用杜恩斯匀浆器(douncehomogeniser)在冰冷的含有1x蛋白酶抑制剂混合物(sigma-aldrich)的ripa缓冲液(50mmtris-hcl ph 7.4；1％v/v np-40；0.5％w/v脱氧胆酸钠；0.1％v/v sds；150mm nacl；2mmedta)中将组织匀浆。使用bca测定法(thermo scientific piercetm)测定裂解液蛋白浓度。将40μg蛋白裂解液通过在4x上样缓冲液(10ml缓冲液含有：240mm tris-hcl ph 6.8；8％w/v sds；40％甘油；0.01％溴酚蓝；10％β-巯基乙醇)存在下加热至100℃持续5分钟而使之变性。将预备用于量化atg9a蛋白水平的裂解液加热至50℃，因为沸腾会导致atg9a聚集并丢失信号。然后将裂解液上样到4-20％梯度mini-tgxtm预制聚丙烯酰胺凝胶(bio-rad)上。凝胶在运行缓冲液(25mm tris、192mm甘氨酸、0.1％ sds、ph 8.3)中在180v下运行约50分钟，或直到染料前端到达凝胶底部。分离的蛋白质通过电泳转移到已预先浸泡在甲醇中的immobilon-p pvdf膜(millipore)上。蛋白质转移在转移缓冲液(25mm tris、192mm甘氨酸、5％v/v甲醇)中以250ma进行1.5小时或以40ma进行过夜。膜在5％奶/tbs-t中封闭1小时。将一抗稀释在5％的奶/tbs-t或5％的bsa/tbs-t中，并与膜一起在4℃下孵育过夜。一抗孵育后，将膜在tbs-t缓冲液中清洗3次，每次15分钟。将二抗抗鼠hrp(1:3000)和抗兔hrp(1:3000)在5％的奶/tbs-t中稀释，并在室温下与膜一起孵育2小时。二抗孵育后，将膜在tbs-t缓冲液中清洗3次，每次15分钟，然后在pbs中最后清洗15分钟。使用ecl prime蛋白质印迹检测试剂(ecl prime western blotting detection reagent，amersham)和g-box成像系统(syngene)使蛋白质条带可视化。使用image j软件对蛋白质条带进行密度计分析。207、蛋白质印迹分析使用以下方案进行：如上所述提取细胞裂解液。在10孔4-12％bis-tris预制凝胶上每泳道加载40μg蛋白质。凝胶在2-(n-吗啉)乙磺酸(mes)缓冲液中运行并湿转法转移到硝酸纤维素膜上(100ma恒定电流过夜)。将膜在5％的奶/tbs-t中封闭1小时。在室温下加入一抗2小时(5％ bsa中的抗ap4b1 1:400)，然后在pbs-t中洗涤4次，每次15分钟。在室温下在5％的奶-tbs-t中加入二抗30分钟。在pbs-t中洗涤膜5次，每次5分钟，然后在pbs中洗涤30分钟。用ecl prime蛋白质印迹检测试剂(amersham)对膜进行显影。208、细胞培养209、人胚肾(hek)293t细胞、hela-m/hela-ap4b1-/-细胞(由j.hirst博士赠予)和人成纤维细胞系在37℃、5％ co2下在生长培养基中培养，培养基由杜氏改良伊格尔培养基(dulbecco’s modified eagle’s medium，dmem，sigma)组成，其中补充有10％v/v胎牛血清(fbs,sigma,mi,us)和1％v/v青霉素(100u/ml)和链霉素(100u/ml)(lonza,basel,switzerland)。210、对于原代皮层神经元培养，基本按照(krichevsky等人，2001)所述，从野生型和c57bl/6j-ap4b1em5lutzy/j怀孕小鼠中收获e18非转基因大鼠胚胎和e16小鼠胚胎。非常简单来说，将皮层解剖并在37℃下在不含钙或镁的hbss(gibco)中的0.25％胰蛋白酶中消化15分钟，并用三支火烧的具有连续减小的管口的巴斯德移液管在研磨介质(trituratingmedium)中手动解离。然后将解离后的皮层神经元接种于多聚-d-赖氨酸(sigma)涂层板上，并保持在补充有2％ b27(life technologies)、0.5mm glutamax(life technologies)和100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素(lonza)的neurobasal培养基(life technologies)中。211、ap4b1敲除hela细胞(hela-ap4b1-/-)由j.hirst博士提供，其产生过程描述于文献9中。212、来自spg47患者、杂合子家族成员和年龄匹配的纯合野生型对照的ap4b1缺陷型人成纤维细胞由henry houlden博士和ivy pin-fang chen博士赠送。213、质粒和病毒构建体的生产214、如上所述创建的aav2-itr转基因转移质粒在neb stable大肠杆菌细胞(newengland biolabs)中扩增，并使用qiagen plasmid plus试剂盒纯化。腺病毒辅助基因(phelper)和rep-cap基因(paav2/9)以反式提供，并通过plasmid factory商购获得。假型aav9病毒载体是按照文献6中描述的方案内部生产的。215、实施例1216、人ap4b1 cdna开放阅读框的大小(2,800bp)意味着简单的基因替代选项在技术上是可行的，并且适用于典型的病毒递送方法，例如使用插入限制为约4000bp的单链腺相关病毒(aav)。我们设计了aav载体以实现治疗水平的转基因表达(图2a)：1)开发了表达盒，涉及0.8kb cbh启动子和130bp sv40 poly a以驱动人ap4b1的表达。cbh启动子已被报道可在啮齿动物和非人类灵长类动物中介导有效转基因表达；2)表达n端v5病毒表位标记的人ap4b1 cdna的载体，允许在没有合适的抗ap4b1抗体的情况下在体外和体内检测ap4b1恢复；3)慢病毒载体表达的v5标记ap4b1构建体可在aav9无法有效转导的细胞类型(例如成纤维细胞)中进行体外功效验证。经蛋白质印迹、rt-qpcr和免疫细胞化学测定，所有构建体均已表明在hela细胞(图2b、c)、原代大鼠皮质神经元(图2d)和人成纤维细胞(图2e)中转染或转导后可有效表达病毒运载物。病毒构建体可有效恢复crispr生成的ap4b1敲除hela细胞系和缺乏内源性ap4b1的spg47患者成纤维细胞中ap4b1蛋白的表达(图2b、c、e)。spg47患者成纤维细胞中v5标记ap4b1的表达还可恢复atg9a的过度表达和异常定位(图3)。217、实施例2218、为了选择使aav9-cbh-hap4b1疗法在ap4b1-/-小鼠模型中疗效最佳的适当的递送途径，我们设计了体内实验来测试中枢神经系统(cns)疾病基因疗法的两种主要递送模式(图4)：cns内递送vs静脉内递送。事实上，aav9已被证明可以穿过血脑屏障(bbb)，尤其是在新生儿中施用时，并且已在成功的临床前(valori et al.,2010)和临床(mendell et al.,2017)cns疾病研究中通过静脉内递送，从这种微创递送途径中获得了强大的治疗潜力。然而，脑脊液(csf)内递送可立即进入cns，从而增加了到达疾病靶细胞的机会，因此它也被用于在试图治疗神经退行性疾病的临床前(iannitti et al.,2018)和临床(miller et al.,2020；mueller et al.,2020)研究中提供基因治疗。219、基于此，我们着手评估通过在小脑延髓池中(小脑延髓池内,icm)注射而递送到scf中，或通过在面静脉中(静脉内,iv)而进行静脉内注射的aav9-hap4b1在ap4b1-/-p2/p3中的治疗效果。作为病毒对照组，我们使用相同的递送途径仅注射了aav9-v5(缺少hap4b1转基因，但含有相同的cbh启动子、v5标记和poly-a信号)，并且我们还保留了野生型(wt)以及未治疗的纯合动物。考虑到我们对ap4b1-/-小鼠模型的内部表征确定雄性纯合子具有更强的疾病表型，我们决定集中资源仅在雄性身上进行此实验。本实验中使用的以下病毒载体要么是内部生产的，要么外包给cro(vectorbuilder)：aav9-v5 only；aav9-v5-hap4b1；和aav9-未标记的hap4b1。图4b汇总了本次实验中招募和牺牲的幼崽数量。220、用pbs灌注后，对组织进行处理以进行生化或组织学分析。221、为了进行生化测试，将cns组织分为大脑、小脑和脊髓，以便更好地了解在独特且明确的区域中治疗的潜力。222、我们首先使用结合在poly-a序列中的引物，通过对组织提取的基因组dna进行qpcr来跟踪病毒在接受治疗的小鼠的cns中的生物分布，结果汇总在图4c中。经qpcr测定，尽管注射是在新生儿中进行的，并且aav9能够穿过bbb，但通过小脑延髓池递送aav9-v5only和aav9-v5-hap4b1在转导所有研究的cns区域方面远优于静脉内递送。223、在生物分布之后，我们利用与hap4b1转基因结合的引物对组织提取的rna进行rt-qpcr，以评估所研究组织中hap4b1转基因的mrna表达，结果汇总在图5中。与从病毒基因组生物分布获得的结果一致，在所分析的所有cns区域中，aav9-cbh-hap4b1的小脑延髓池注射在诱导hap4b1的mrna表达方面均具有显著优势。224、spg47功能丧失假说有大量证据支持，因为ap4复合体的所有其他3个亚基(ap4m1、ap4s1和ap4e1)的突变都会破坏四聚体蛋白的正常功能，并导致与spg47非常相似的临床表现。因此，其任何亚基的丧失似乎都会导致ap4缺陷症，其主要特征是早发性进行性痉挛性截瘫和智力障碍。为了研究icm或iv递送是否恢复了ap-4复合体的功能，我们从cns组织中提取了蛋白质，并进行了蛋白质印迹法检测另一个ap-4亚基ap4e1的蛋白质表达水平。结果汇总在图7中。在ap4b1-/-纯合子未治疗小鼠和用aav9-v5 only治疗的动物中，ap4e1表达缺失，但icm施用aav9-v5-hap4b1成功恢复了所分析的所有cns区域中的ap4e1蛋白水平，效率为wt水平的约25％(大脑)、约16％(小脑)和约36％(脊髓)。静脉内递送aav9-v5-hap4b1未在大脑和小脑中诱导可检测的ap4e1表达恢复，而在脊髓中诱导了比icm注射要小的恢复。225、在收集了组织的生化分析的大量数据后，我们继续进行组织学分析，即检查aav9-hap4b1对ap4b1-/-脑冠状切片中胼胝体厚度和侧脑室增大的影响，这是spg47的另一个重要标志(图8)。图9中汇总的结果清楚地表明，ap4b1基因替代导致胼胝体厚度和侧脑室增大的恢复。226、然后，我们继续研究aav9-hap4b1是否会纠正atg9a异常定位，这是ap-4神经退行性疾病的明确分子标志。使用抗atg9a对脑切片进行免疫荧光标记，结果汇总在图10中。正如预期的那样，与wt同窝小鼠相比，纯合子小鼠的atg9a在所有分析的cns区域中均显示异常定位。icm递送aav9-hap4b1成功纠正了小脑和脑干中的这种表型(图10)。使用cbh和synapsin启动子测试了基因替代方法。227、有趣的是，我们的基因治疗方法纠正了ap4b1-/-小鼠模型中观察到的紧抱表型。数据汇总在图11中。228、实施例3229、研究spg47小鼠模型中aav9_cbh_hap4b1基因治疗的剂量反应研究。230、spg47 ko小鼠(ap4b1-/-)在大约p60左右通过小脑延髓池递送用aav9_cbh_hap4b1或aav9_cbh_v5_empty载体治疗。递送了3种不同剂量的aav9_cbh_hap4b1——低剂量(6×10e10 vg)、中剂量(8×10e10 vg)和高剂量(1×10e11 vg)。小鼠在2个月和4个月龄时被处死。每周评估小鼠体重和紧抱表型，并在2个月时取组织进行生化分析，并在4个月时固定大脑进行解剖分析(胼胝体和侧脑室大小(lateral vertical size))和atg9a积累分析(表1)。231、表1232、233、重量和紧抱234、经治疗的小鼠对体重增加没有不良影响(见图15)。紧抱数据显示，未经治疗的spg47小鼠和经仅v5治疗的小鼠(对照)的后肢紧抱严重程度随时间推移而加重。野生型小鼠没有随着年龄的增长而出现紧抱表型。所有3种剂量的治疗均显示随时间推移后肢紧抱严重程度进展减缓(见图16)。低剂量治疗在120天时间点可使后肢紧抱严重程度恢复86％。中剂量治疗恢复76％，高剂量治疗恢复55％。235、转棒仪跌落延迟时间236、6个月龄时(注射后4个月)的转棒仪表现数据。该数据显示，中剂量和高剂量治疗均有可能使这种表型恢复。参见图17。237、脑重量238、这里我们测量了处死小鼠解剖后立即测量的脑重量。治疗后2个月，在雌性中，经治疗的小鼠(仅v5)的脑重量与野生型相比显著降低。该数据表明，当用所有3种剂量治疗时，这种脑重量表型得到恢复(见图18a)；低剂量治疗的恢复为98％，中剂量治疗的恢复为85％，高剂量治疗的恢复为96％。注射后4个月测量雄性小鼠的脑重量显示出类似的数据模式。(见图18b)。239、胼胝体变薄分析240、在接受治疗的小鼠的脑中，对8个固定位置的胼胝体进行了测量。胼胝体厚度在这些位置上有所不同。与野生型(蓝色数据集)相比，spg47对照治疗小鼠(仅v5)的胼胝体厚度降低(橙色数据集)。aav9_cbh_hap4b1高剂量治疗小鼠的胼胝体厚度恢复到野生型水平(见图19)。241、实施例4：242、aav9-ap4b1基因替代对脑脊液(csf)和血浆中神经丝l(nfl)水平的影响。如图19所示，用aav9-cbh-ap4b1和aav9-synapsin 1-ap4b1载体治疗的ap4b1-/-小鼠的nfl水平降低至与野生型相似的水平，无论是在csf还是血浆中。与野生型相比，未治疗(intreated)的小鼠的水平提高。这表明该载体可以有效降低缺失ap4b1的患者的神经丝水平。243、参考文献244、1.harvard spg47 registry,managed by dr darius ebrahimi-fakhari,accessed october 2020.2bauer,p.et al.mutation in the ap4b1 gene causehereditary spastic paraplegia type47(spg47).neurogenetics 13,73-76,doi:10.1007/s10048-012-0314-0.(2012).245、3.laughlin,c.a.,tratschin,j.d.,coon,h.&carter,b.j.cloning ofinfectious adeno-associated virus genomes in bacterial plasmids.gene 23,65–73(1983).246、4.gray,s.j.et al.optimizing promoters for recombinant adeno-associated virus-mediated gene expression in the peripheral and centralnervous system using self-complementary vectors.hum.gene ther.22,1143–1153(2011).247、5.davies,a.k.et al.ap-4vesicles contribute to spatial control ofautophagy via rusc-dependent peripheral delivery of atg9a.nat.commun.9,(2018).248、6.lukashchuk,v.,lewis,k.e.,coldicott,i.,grierson,a.j.&azzouz,m.aav9-mediated central nervous system–targeted gene delivery via cisterna magnaroute in mice.mol.ther.-methods clin.dev.3,15055(2016).249、7.kim,s.,yu,n.k.&kaang,b.k.ctcf as a multifunctional protein ingenome regulation and gene expression.exp.mol.med.47,e166(2015).250、8.herranz-martin,s.et al.viral delivery of c9orf72 hexanucleotiderepeat expansions in mice leads to repeat-length-dependent neuropathology andbehavioural deficits.dis.model.mech.10,859–868(2017).251、9.frazier,m.n.et al.molecular basis for the interaction betweenadaptor protein complex 4(ap4)β4and its accessory protein,tepsin.traffic 17,400–415(2016).252、10.behne r,teinert j,wimmer m,d′amore a,davies ak,scarrott jm,eberhardt k,brechmann b,chen ip,buttermore ed,barrett l,dwyer s,chen t,hirstj,wiesener a,segal d,martinuzzi a,duarte st,bennett jt,bourinaris t,houldenh,roubertie a,santorelli fm,robinson m,azzouz m,lipton jo,borner ghh,sahin m,ebrahimi-fakhari d.adaptor protein complex 4deficiency:a paradigm ofchildhood-onset hereditary spastic paraplegia caused by defective proteintrafficking.hum mol genet.2020 jan 15；29(2):320-334.doi:10.1093/hmg/ddz310.pmid:31915823；pmcid:pmc7001721.253、11.ebrahimi-fakhari d,teinert j,behne r,wimmer m,d′amore a,eberhardtk,brechmann b,ziegler m,jensen dm,nagabhyrava p,geisel g,carmody e,shamshadu,dies ka,yuskaitis cj,salussolia cl,ebrahimi-fakhari d,pearson ts,saffari a,ziegler a,s,volkmann j,wiesener a,bearden dr,lakhani s,segal d,udwadia-hegde a,martinuzzi a,hirst j,perlman s,takiyama y,xiromerisiou g,vill k,walker wo,shukla a,dubey gupta r,dahl n,aksoy a,verhelst h,delgado mr,kremlikova pourova r,sadek aa,elkhateeb nm,blumkin l,brea-fernández aj,dacruz-d,smol t,ghoumid j,miguel d,heine c,schlump ju,langen h,baetsj,bulk s,darvish h,bakhtiari s,kruer mc,lim-melia e,aydinli n,alanay y,el-rashidy o,nampoothiri s,patel c,beetz c,bauer p,yoon g,guillot m,miller sp,bourinaris t,houlden h,robelin l,anheim m,alamri as,mahmoud aah,inaloo s,habibzadeh p,faghihi ma,jansen ac,brock s,roubertie a,darras bt,agrawal pb,santorelli fm,gleeson j,zaki ms,sheikh si,bennett jt,sahin m.defining theclinical,molecular and imaging spectrum of adaptor protein complex 4-associated hereditary spastic paraplegia.brain.2020 oct 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