阿霉素和拉帕替尼在构建斑马鱼心脏毒性损伤模型中的应用及药物筛选方法

本发明属于生物医药、动物模型构建，具体涉及阿霉素和拉帕替尼在构建斑马鱼心脏毒性损伤模型中的应用及药物筛选方法。

背景技术：

1、阿霉素(dox)属蒽环类家族，是临床上常用的一种广谱抗肿瘤药物，有效对抗白血病、乳腺癌等多种癌症。据估计，约50-60％的癌症患者在治疗过程中使用过至少一种蒽环类药物。拉帕替尼(lap)是一种酪氨酸激酶抑制剂，通常与蒽环类药物阿霉素联合使用，能显著增强抗肿瘤效果，并提升晚期her2阳性乳腺癌患者的生存率。目前针对该联合化疗用药对乳腺癌患者在怀孕期间其胎儿潜在的心脏毒性风险研究比较少见。

2、现有研究主要聚焦于lap和dox联合治疗对成年、尤其是老年转移性乳腺癌女性患者的心脏毒性。然而，约7％至10％的乳腺癌诊断发生在40岁以下的女性身上，其中一部分女性处于怀孕期。妊娠相关乳腺癌的发病率在1：3,000至1：10,000之间，约占所有乳腺癌案例的3％。遗憾的是，预计未来几年妊娠相关乳腺癌的发病率将上升，而终止妊娠似乎并不会改善患者的预后。因此，评估lap和dox联合化疗对胎儿心脏的潜在毒性副作用变得尤为重要。然而，由于伦理和临床样本采集的限制，有关lap和dox在人类中诱发的潜在胎儿心脏毒性研究非常有限。因此，开发相应的动物模型系统成为解决这一医学需求的有效手段。

3、动物模型是进行人类疾病研究的重要工具，利用动物模型能直观的体现人类疾病的病理生理改变，进行疾病机制研究。同时动物模型也是筛选活性药物，进行药物研发的重要工具。啮齿类动物生物体特点与人类接近，实验结果具有代表性，但啮齿类动物普遍存在体格大、成本高、周期长的缺点。斑马鱼(danio rerio)是一种体型小巧的热带脊椎动物，其基因组与人类有高达87％的相似度。在心脏电生理和心律方面，斑马鱼与人类展现出了极高的保守性，它的平均心率约为每分钟100次跳动(bpm)，这与人类平均60-90bpm的心率相比更为接近，远低于小鼠约500bpm的心率。这使得斑马鱼在心脏毒性的研究中应用更为广泛。王雪等人通过选用受精后3天(3dpf)的斑马鱼幼鱼发现阿霉素和连翘苷组合使用能够用于构建阿霉素相关的斑马鱼心脏毒性损伤模型，并发现心率减慢的表型，蔡月琴等人通过选用受精后2天(2dpf)的转基因血管荧光斑马鱼发现了一种阿霉素诱导斑马鱼血管内皮损伤模型的建立方法，这些研究均通过水溶性给药处理斑马鱼，实验方法便捷，易于高通量进行。但是这些发明心脏表型较为单一，本发明提供了全面的心脏指标，包括心率、射血分数、肌小节结构、心肌细胞数量、心肌凋亡以及电镜图像，从而更好地证明模型的成功构建和心脏毒性的各个方面。

4、丝裂原活化蛋白激酶(mapk)的p38亚群是一种被细胞应激激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。由于p38 mapk在细胞对外部应激信号和炎症细胞因子的反应中起着关键作用，它已成为医学研究中一个有吸引力的靶点。通常p38 mapk抑制剂主要用于治疗促炎疾病，用于吸入治疗阻塞性或炎症性肺疾病，如慢性阻塞性肺病和哮喘。此外，p38 mapk抑制剂还有些新应用，用于预防和治疗神经系统的退行性疾病，如痴呆、阿尔茨海默病和亨廷顿舞蹈病以及用于胃肠道疾病领域，如溃疡性结肠炎。目前尚未发现p38 mapk抑制剂在心脏毒性领域的应用。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了阿霉素和拉帕替尼在构建斑马鱼心脏毒性损伤模型中的应用及药物筛选方法。

2、本发明采用斑马鱼胚胎系统，建立了一个以lap(拉帕替尼)和dox(阿霉素)联合化疗引发的胎儿心脏毒性模型，该模型展现出剂量依赖性并深入探讨了其背后的病理机制。本发明揭示了氧化应激的升高和mapk信号通路的激活是lap和dox联合化疗中的关键病理事件，这些发现为胎儿心脏保护靶点的开发提供了潜在的途径。

3、本发明首次发现dox和lap组合使用能够用于构建阿霉素相关的斑马鱼心脏毒性损伤模型并筛选出一种能够缓解心脏毒性的药物。

4、术语说明：

5、hpf(hours post fertilization)：指受精后的小时数。

6、dox(doxorubicin)：阿霉素。

7、lap(lapatinib)：拉帕替尼。

8、本发明技术方案如下：

9、一种用于建立斑马鱼心脏毒性损伤模型的组合物，包括阿霉素和拉帕替尼。

10、根据本发明优选的，所述组合物中组分的浓度为阿霉素(20-100)μm，拉帕替尼(5-30)μm。

11、进一步优选的，所述组合物中组分的浓度为阿霉素20μm，拉帕替尼20μm。

12、根据本发明优选的，建立斑马鱼心脏毒性损伤模型所用的斑马鱼为24hpf斑马鱼。

13、根据本发明优选的，斑马鱼为ab系野生型斑马鱼。

14、阿霉素和拉帕替尼在建立斑马鱼心脏毒性损伤模型中的应用。

15、根据本发明优选的，所述应用中，阿霉素的浓度为(20-100)μm，拉帕替尼的浓度为(5-30)μm。

16、进一步优选的，所述应用中，阿霉素的浓度为20μm，拉帕替尼的浓度为20μm。

17、根据本发明优选的，所述应用中，建立斑马鱼心脏毒性损伤模型所用的斑马鱼为24hpf的斑马鱼。

18、根据本发明优选的，所应用中，斑马鱼为ab系野生型斑马鱼。

19、一种斑马鱼心脏毒性损伤模型的建立方法，包括如下步骤：

20、将斑马鱼随机分组，分别为模型组和对照组，模型组为加入含阿霉素和拉帕替尼的培养水溶液中，对照组与模型组相比不含阿霉素和拉帕替尼，其他均相同，培养40-48h，检测指标为射血分数、心率和舒张末期心室横截面积；模型组和对照组相比，射血分数显著下降，心率显著减慢，舒张末期心室横截面积显著缩小，斑马鱼心脏毒性损伤模型构建成功，否则不成功。

21、根据本发明优选的，所述方法中，斑马鱼为24hpf的斑马鱼。

22、根据本发明优选的，所述方法中，斑马鱼为ab系野生型斑马鱼。

23、根据本发明优选的，所述方法中，含阿霉素和拉帕替尼的培养溶液中，含阿霉素浓度为(20-100)μm，拉帕替尼的使用浓度为(5-30)μm。

24、进一步优选的，所述方法中，含阿霉素和拉帕替尼的培养水溶液中，含阿霉素浓度为20μm和拉帕替尼的浓度为20μm。

25、根据本发明优选的，所述方法中，培养水溶液中含有：5mm nacl、0.17mm kcl、0.33mm cacl2、0.33mm mgso4，ph 7.2。

26、根据本发明优选的，所述方法中，每组斑马鱼的数量为8-20条。

27、根据本发明优选的，所述方法中，培养的条件为28.5℃，光照/黑暗周期为14h/10h。

28、根据本发明优选的，所述方法中，射血分数、心率、心室横截面积是通过视频成像的方法检测。

29、根据本发明优选的，所述方法中，射血分数、心率、舒张末期心室横截面积显著的统计学依据方法是单因素方差分析。

30、根据本发明优选的，所述方法中，检测指标还包括心肌细胞核、心肌凋亡、心肌肌小节和/或线粒体。

31、进一步优选的，模型组和对照组相比，肌小节结构被破坏、心肌细胞核减少、心肌凋亡增加、线粒体损伤。

32、上述方法建立的斑马鱼心脏毒性损伤模型在筛选具有预防/治疗阿霉素所致的心脏毒性损伤活性药物中的应用

33、一种利用上述方法建立的斑马鱼心脏毒性损伤模型筛选具有预防/治疗阿霉素所致的心脏毒性损伤活性药物的方法，包括如下步骤：

34、将斑马鱼随机分组，分别为对照组、模型组和治疗组，对照组为加入不含阿霉素和拉帕替尼的培养水溶液中，模型组为加入含阿霉素和拉帕替尼的培养水溶液中，治疗组加入含阿霉素、拉帕替尼及待测样品的培养水溶液，培养40-48h，检测射血分数、心率和舒张末期心室横截面积；模型组和对照组相比，射血分数显著下降，心率显著减慢，舒张末期心室横截面积显著缩小，斑马鱼心脏毒性损伤模型构建成功，否则不成功；判断模型构建成功后，治疗组与模型组相比，射血分数显著上升、心率显著升高并且舒张末期心室横截面积显著扩大表明斑马鱼心脏毒性损伤得到缓解，待测药物具有预防/治疗阿霉素所致的心脏毒性损伤活性，否则没有活性。

35、根据本发明优选的，所述方法中，斑马鱼为24hpf的斑马鱼。

36、根据本发明优选的，所述方法中，每组斑马鱼的数量为8-20条。

37、根据本发明优选的，所述方法中，培养的条件为28.5℃，光照/黑暗周期为14h/10h。

38、根据本发明优选的，所述方法中，斑马鱼为ab系野生型斑马鱼。

39、根据本发明优选的，所述方法中，含阿霉素和拉帕替尼的培养溶液中，含阿霉素浓度为(20-100)μm，拉帕替尼的使用浓度为(5-30)μm。

40、进一步优选的，所述方法中，含阿霉素和拉帕替尼的培养水溶液中，含阿霉素浓度为20μm和拉帕替尼的浓度为20μm。

41、根据本发明优选的，所述方法中，培养水溶液中含有：5mm nacl、0.17mm kcl、0.33mm cacl2、0.33mm mgso4，ph 7.2。

42、根据本发明优选的，所述方法中，射血分数、心率、心室横截面积是通过视频成像的方法检测。

43、根据本发明优选的，所述方法中，射血分数、心率、舒张末期心室横截面积显著性的统计学依据方法是单因素方差分析。

44、sb203580在制备缓解dox和lap联合用药导致的心脏毒性药物中的应用。

45、有益效果

46、1、本发明首次发现阿霉素和拉帕替尼组合使用能够用于构建阿霉素相关的斑马鱼心脏毒性损伤模型，本发明提供了一种新的斑马鱼心脏毒性损伤模型，本发明提供的模型是通过使用阿霉素和拉帕替尼的联合用药来构建的，本发明提供的模型对于研究心脏毒性具有重要意义，尤其是在抗肿瘤药物阿霉素所引发的心脏毒性方面。

47、2、本发明不仅建立了模型，还深入探讨了心脏毒性的病理机制，特别是氧化应激的升高和mapk信号通路的激活这两个关键病理事件，为未来的治疗和预防策略提供了新的见解。

48、3、本发明提供的斑马鱼心脏毒性损伤模型包含了心脏功能的多个指标，能够更好地说明模型的成功构建和心脏毒性的各个方面。

49、4、本发明建立的斑马鱼心脏毒性模型，只出现心功能减退的表现，各处理组斑马鱼未出现体长，以及全身水肿等异常，排除了阿霉素可能造成的肾毒性损伤的发生，使该模型能够特异用于阿霉素心脏毒性相关研究，摒除了其他脏器功能变化的干扰。

50、5、本发明通过水溶性给药途径处理斑马鱼幼鱼，方法便捷，处理周期短，药物用量少，效果明显，有效提高实验效率，适用于高通量药物筛选。

51、6、本发明提供的模型能够筛选出具有预防或治疗阿霉素所致心脏毒性损伤活性的药物，这为心脏毒性的治疗提供了一个新的工具。