一种利用多重叠加诱变水曲柳生长点定向获得抗旱突变体的方法

本发明涉及植物组织诱变，特别是涉及一种利用多重叠加诱变水曲柳生长点定向获得抗旱突变体的方法。

背景技术：

1、水曲柳(fraxinus mandschurica)是属于木犀科(oleaceae)白蜡属(fraxineae)的落叶大乔木，东北三大硬阔树种之一。水曲柳具有观赏性高、材质优良、纹理美观等优点，但由于其分布范围和种群数量急速减少。究其原因，传统育种工作耗时耗力，获得可利用的有效遗传变异、培育新品种的周期长，因此利用物理诱变和化学诱变技术人工诱发遗传变异是创制新种质、选育新品种的重要手段。

2、常压室温等离子体(atmospheric room temperature plasma，artp)诱变是近年来新研发的一种新型育种方式，能够在室温条件和正常大气压下产生富含活性粒子的等离子体射流，引起植物细胞膜通透性和蛋白结构的改变，造成损伤。这些改变使得细胞中dna分子启动不完全修复机制，产生可遗传性的基因突变以适应环境。利用经过多轮artp诱变，结合新型牛血清白蛋白/十六烷基三甲基溴化铵偶联高通量筛选，摇瓶培养18h内，突变体的ha产量提高42.9％，孔板培养提高了菌株培养的密度和通量，并最终经过3轮artp迭代诱变和筛选，使ha产量提高了28.7％(李凡,周娜娜,张媛等.artp诱变筛选高产透明质酸菌株[j].当代化工,2023,52(10):2466-2470.)。artp技术对黑木耳菌株进行3轮迭代诱变，采用issr分子标记技术对诱变菌株进行遗传差异分析，发现与出发菌株黑威单片相比，诱变菌株d3-56和d3-60多糖含量提高48.40％和60.83％，artp诱变影响了黑木耳菌丝体的多糖化合物的代谢(李庆伟,李文,周益帆等.采用常压室温等离子体诱变技术选育高产多糖黑木耳菌株[j].食用菌学报,2023,30(03):11-18.)。目前，artp诱变技术已广泛应用于包括细菌、放线菌、真菌、酵母、微藻等在内的四十余种微生物的诱变育种工作中，近年来还可用于研究动物及动物饲料生物催化转化和发酵技术，但在农作物和林木遗传育种方面的报道还较少，利用artp等离子体诱变的方法进行马铃薯诱变育种，辐照处理30min时诱变率最高，达到13.33％，提高了马铃薯artp的诱变率，改良马铃薯品种特征特性，创制新种质资源和育种中间材料(韩忠才,张胜利,徐飞等.一种提高马铃薯artp诱变率的方法[p].吉林省：cn117158312a,2023-12-05.)，水稻种子经过artp诱变仪处理后，再利用试剂盒检测发芽后的活性氧含量，且基于ccgg位点的甲基化敏感扩增多态性msap方法，检测幼苗甲基化水平，针对表型变异明显的突变体，进行基因组和转录组测序，通过与野生型对比，探索诱变后的水稻植株的基因组变化规律，计算突变率，选择优良植株(丁志杰,刘维,张川.一种基于artp的分类式水稻诱变育种装置及方法[p].江苏省：cn115633634a,2023-01-24.)。可用于种子繁育困难和生长缓慢的植物来创制新种质。

3、甲基磺酸乙酯(ethyl methylsulfone，ems)诱变为化学诱变，ems是烷化剂中的强效诱变剂之一，具有诱变效率高、负作用小、易操作、诱变作物产生突变的范围广和不易使染色体畸变等优点，ems诱变育种多年来在花卉和农作物中成绩显著，而在木本植物诱变育种中的研究却起步较晚，但也取得了一定的成果，现ems诱变已被广泛地用来构建突变体库，在哺乳动物、拟南芥、水稻、小麦等植物中利用ems诱变技术构建了突变体库，它们在功能基因组学研究中发挥了重要作用，ems溶液浓度和处理时间在变化的同时，实验材料会出现不同的表型特征，诱变处理时通常以0.1mol/l的磷酸缓冲液(ph＝5.8)或者2％的dmso配置不同浓度的ems溶液，通过浸泡法、滴液法和共培养法等方法对实验材料进行诱变。设计不同ems浓度和处理时间的梯度，以辣木(moringa olifera)的种子作为实验材料，得出最佳诱变条件为1.1％ems处理10h，在该条件下辣木种子的相对出苗率为58.60％，相对成苗率为57.07％，并且能保持相对较高的突变率，得到新表型的辣木(张慧,阮明菊,王韦等.辣木甲基磺酸乙酯(ems)诱变及表型变异的初步研究[j].云南农业大学学报(自然科学),2022,37(02):302-310.)。采取浸泡的方法对加杨(populus×canadensis moench)愈伤组织进行处理，实验表明当ems浓度相同时，杨树胚性愈伤组织的芽分化率随处理时间的增加而降低；在处理时间相同时，杨树胚性愈伤组织的芽分化率随处理浓度的增加而降低，胚性愈伤组织经逐级耐盐定向筛选后获得的变异体，由ems诱变并定向耐盐筛选可以获得耐盐性较强的变异体(陈丽,董举文,唐寅等.ems诱变处理定向筛选杨树耐盐突变体研究[j].上海农业学报,2007(03):86-91.)。

4、由于单种诱变方法往往会使突变体产生抗性，或得到的诱变突变体性能不够稳定，在实际应用中往往采用2种或多种诱变方式相结合的方法进行诱变，融合多种方法的复合诱变具有更加稳定、更高效的选育突变体等优点。采用ems+uv+artp叠加诱变方法，选育出了产霉酚酸的优良短密青霉菌菌株sa-2，大幅度地提高了菌株发酵效价，其发酵效价普遍高于国内已报道的其他菌株(张萍,石彦鹏,牛春等.霉酚酸高产菌株短密青霉菌sa-2的选育[j].生物资源,2022,44(04):411-416.)。利用了紫外线能导致dna结构发生变化形成胸腺嘧啶二聚体的优势，于是对第一次诱变生长后的细胞再一次进行紫外照射叠加诱变，使突变的小单孢菌细胞染色体dna分子或牢固地稳定下来或再度突变，所以其产生抗生素的正负变率十分明显，叠加诱变使小单孢菌除具有复合诱变的协同效应外，再叠加诱变一次，巩固了诱变效果，使正诱变率明显提高，诱变株生产能力也比较稳定，收到明显效果(管玉霞,孙甲贤,王静等.小单孢菌叠加诱变与发酵过程的研究[j].中国生物工程杂志,2011,31(04):77-82.)。近年来叠加诱变育种在微生物上的研究颇有成效，林木中的研究则相对较少。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种利用多重叠加诱变水曲柳生长点定向获得抗旱突变体的方法，通过本发明提供的方法中artp-ems多重叠加诱变育种技术，极大的缩短了育种周期，提高了育种效率，定向筛选获得抗旱突变体，对水曲柳的新品种选育具有重要意义。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种利用多重叠加诱变定向获得水曲柳抗旱突变体的方法，包括以下步骤：

4、1)将水曲柳种胚进行artp诱变处理，得到处理种胚；

5、2)将所述步骤1)得到的处理种胚进行生长点诱导，得到生长点；

6、3)将所述步骤2)得到的生长点进行ems诱变处理，得到处理生长点；

7、所述ems诱变处理的条件包括：时间为4h，ems处理浓度为0.4％，为质量百分含量；

8、4)将所述步骤3)得到的处理生长点进行芽诱导培养及生根培养，得到再生植株；

9、5)将所述步骤4)将再生植株进行土培，对得到的土培苗进行干旱胁迫，获得水曲柳抗旱突变体。

10、优选的，所述步骤1)artp诱变处理的条件包括：时间为20min，功率为240w，气流量为12slm，载片距离为2mm。

11、优选的，所述步骤2)生长点诱导使用的培养基为：wpm+0.8mg/ltdz+30g/l蔗糖+7g/l琼脂。

12、优选的，所述步骤2)水曲柳生长点的获取方法包括：

13、将所述处理种胚进行暗培养3d，切下胚轴放在生长点诱导使用的培养基中，培养18d，得到生长点。

14、优选的，所述生长点诱导的条件包括：温度为25℃，先暗培养10d后再光培养8d；所述光照培养包括：12h光照，12h黑暗。

15、优选的，所述步骤4)芽诱导培养使用的培养基包括：wpm+1.0mg/l ga3+0.025mg/ltdz+30g/l蔗糖+7g/l琼脂。

16、优选的，所述步骤4)生根培养使用的生根培养基包括：wpm+30g/l蔗糖+7g/l琼脂。

17、优选的，所述芽诱导培养的条件包括：温度为25℃，光照培养15-18d，12h光照，12h黑暗；

18、所述生根培养的条件包括温度为25℃，光照培养30d，12h光照，12h黑暗。

19、优选的，所述步骤5)土培的条件包括：温度为25℃，时间为30-40d，12h光照，12h黑暗。

20、优选的，所述步骤5)干旱胁迫的条件包括：采用质量百分含量为20％的peg6000溶液进行干旱胁迫，时间为2d。

21、本发明的有益效果为：

22、本发明通过对artp诱导后的种胚进行生长点诱导，再对生长点进行ems诱变，对诱变后组织进行增殖培养及生根培养，即获得水曲柳突变材料，整个过程均在无菌条件下完成。诱变后的植株具有株高、叶型及叶色等突变表型。结合干旱胁迫对诱变效果进行评价，定向筛选获得抗旱突变体，建立了artp-ems多重叠加诱变处理水曲柳生长点的体系。本发明的建立将丰富水曲柳的种质资源，为进一步通过多重叠加诱变获得水曲柳抗逆突变体提供了技术支撑。