一种谱系示踪小鼠模型及其构建方法和应用与流程

本发明属于生物工程，涉及一种用于特异性标记cyp2e1阳性的中央静脉区肝细胞的谱系示踪小鼠模型及其构建方法和应用，尤其涉及在建立(例如四氯化碳诱导的)急性药物性肝损伤小鼠模型中的应用，以及在研究肝损伤和再生过程中pc肝细胞群细胞命运中的应用(追踪在急性药物性肝损伤后损伤区域附近残余的pc肝细胞的细胞命运转归，阐明驱动pc肝细胞再生的机制)，以及在筛选用于治疗急性药物性肝损伤的药物中的应用。

背景技术：

1、肝脏是最具再生能力的实体器官，在哺乳动物中执行各种维持生理稳态所必需的关键功能。组织学上，肝脏由称为肝小叶的结构和功能单位组成。每个肝小叶呈六边形排列，中间有一条中央静脉，六角各有门静脉三联管(门静脉、肝动脉和胆管)。在功能上，血流沿门静脉-中央静脉方向上存在代谢梯度，反映了一种代谢功能分区(benhamouche s等人.apc tumor suppressor gene is the“zonation-keeper”of mouse liver[j].developmental cell,2006,10(6):759-770.)。根据该代谢功能分区，肝小叶大致分为两个主要的区域：门静脉(pv)周围(pp)和中央静脉区(cv)周围(pc)区域(jungermann k等人.functional specialization of different hepatocyte populations[j].physiological reviews,1989,69(3):708-764.)，或进一步划分为三个区域(1区、2区和3区)(colnot s等人.liver zonation[j].molecular pathology of liver diseases,2011:7-16.)，或详细阐述为九个区域层(halpern d等人.we face,i tweet:howdifferent social media influence political participation through collectiveand internal efficacy[j].journal of computer-mediated communication,2017,22(6):320-336.)。由于这些功能分区的存在，肝脏病变经常表现出特定区域损伤的模式，最常见的是pp区或pc区损伤(ben-moshe s等人.spatial heterogeneity in the mammalianliver[j].nature reviews gastroenterology&hepatology,2019,16(7):395-410.)。pc肝细胞(中央静脉区周围肝细胞)高表达药物和外源物质代谢解毒相关的酶，如细胞色素p450家族系统(kietzmann t.metabolic zonation of the liver:the oxygen gradientrevisited[j].redox biology,2017,11:622-630.)。对乙酰氨基酚、抗结核药物(利福平)、四氯化碳(ccl4)和乙醇等化合物通常被细胞色素p450家族2亚家族e成员1(cyp2e1)代谢为有毒中间体，导致药物性和酒精性肝损伤，主要发生在pc区。此外，由于脂肪合成相关基因也以pc区域分布为主，脂肪性肝病，包括非酒精性和酒精性脂肪性肝病，脂肪变性也通常始于pc区(brunt,e.m.(2007).pathology of fatty liver disease.modern pathology 20,s40-s48；chalasani,n.,等人.(2008).relationship of steatosis grade and zonallocation to histological features of steatohepatitis in adult patients withnon-alcoholic fatty liver disease.journal of hepatology 48,829-834)。一些pc肝细胞也是肝细胞癌发展的重要来源细胞(ang chow,h.,等人.(2019).lgr5+pericentralhepatocytes are self-maintained in normal liver regeneration and susceptibleto hepatocarcinogenesis.proceedings of the national academy of sciences 116,19530-19540)，并且疟疾虫肝脏期在pc肝细胞中的复制更为显著(ng,s.,等人.(2014).hypoxia promotes liver-stage malaria infection in primary human hepatocytesin vitro.disease models&mechanisms 7,215-224)。鉴于pc区相关病理与常见肝脏疾病的临床相关性，阐明pc区特异性损伤后肝脏再生的机制至关重要。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种用于特异性标记cyp2e1阳性的中央静脉区肝细胞的谱系示踪小鼠模型的构建方法，其包括以下步骤：

2、1)将cyp2e1-dreert2基因型小鼠与h11-tdtomato基因型小鼠交配产生子代小鼠；

3、2)从步骤1)获得的所述子代小鼠中鉴定得到cyp2e1-dreert2和h11-tdtomato双阳性的小鼠，命名为cyp2e1-dreert2；h11-tdtomato小鼠，即作为用于特异性标记cyp2e1阳性的中央静脉区肝细胞的谱系示踪小鼠模型。

4、在一些实施方式中，步骤1)中所述cyp2e1-dreert2小鼠为cyp2e1-e(2a-dreert2-wpre-pa)5小鼠。

5、在一些实施方式中，步骤1)中所述h11-tdtomato小鼠为h11-e(cag-rsr-tdtomato)1小鼠。

6、在一些实施方式中，步骤2)中所述cyp2e1-dreert2和h11-tdtomato双阳性的小鼠是指dre基因+/-，且tdtomato基因+/-或tdtomato基因+/+的小鼠，其中+/-表示杂合，+/+表示纯合。

7、本发明另一方面提供一种用于特异性标记cyp2e1阳性的中央静脉区肝细胞的谱系示踪小鼠模型，其由上述的方法构建获得。

8、上述的用于特异性标记cyp2e1阳性的中央静脉区肝细胞的谱系示踪小鼠模型在建立急性药物性肝损伤小鼠模型中的应用也属于本发明的内容。

9、本发明再一方面还提供一种急性药物性肝损伤小鼠模型的建立方法，其包括以下步骤：

10、s1：对上述提及的cyp2e1-dreert2；h11-tdtomato小鼠进行腹腔注射他莫昔芬(tamoxifen，tam)；

11、s2：注射所述他莫昔芬5-7天后，向所述cyp2e1-dreert2；h11-tdtomato小鼠腹腔注射药物，得到所述急性药物性肝损伤小鼠模型。

12、在一些实施方式中，步骤s1中，所述他莫昔芬的注射量为1-3mg/kg小鼠体重。

13、在一些实施方式中，步骤s1中，所述cyp2e1-dreert2；h11-tdtomato小鼠的年龄为6-8周龄。

14、在一些实施方式中，步骤s2中，所述药物选自以下中的一种或多种：四氯化碳、对乙酰氨基酚、抗结核药物(利福平)、酒精和毒物。

15、在一些实施方式中，所述药物为ccl4，其剂量为0.5-1μl/g小鼠体重。

16、本发明再一方面还提供一种急性药物性肝损伤小鼠模型，其由上述的方法建立。

17、上述的用于特异性标记cyp2e1阳性的中央静脉区肝细胞的谱系示踪小鼠模型，或上述的急性药物性肝损伤小鼠模型在研究肝损伤和再生过程中pc肝细胞群细胞命运中的应用，或在筛选用于治疗急性药物性肝损伤的药物中的应用也属于本发明的内容。

18、基于以上技术方案提供的谱系示踪小鼠模型可以特异性标记cyp2e1阳性的中央静脉区肝细胞(本文中也称cyp2e1+pc肝细胞)，进而可以在由该谱系示踪小鼠模型建立的急性药物性肝损伤小鼠模型中追踪急性药物性肝损伤后损伤区域附近剩余pc肝细胞的细胞命运或细胞动态性行为，并且可以进一步分析pc肝细胞分子病理的时空动态改变以及驱动pc细胞再生的分子机制。因此，本发明提供的小鼠模型可有助于发现促进肝脏再生的新靶点，从而为药物损伤性肝病的临床治疗提供新的干预措施，恢复肝脏内源性的再生和功能的重建，减少对原位肝移植的依赖，挽救更多肝病患者的生命，将具有重要的理论和现实意义。