一种利用葛根叶片、根须直接诱导葛根不定根方法及培养基配方

本发明涉及生物，尤其涉及一种利用葛根叶片、根须直接诱导葛根不定根的方法及培养基配方。

背景技术：

1、葛根(pueraria lobata)为豆科蝶形花亚科葛属多年生落叶藤本植物。是中药药用植物之一。全世界的葛属植物有30种左右。野葛，能加快血流循环和血液流动，有退热、透疹、升阳止泻、解酒等功效。目前，已从葛根中识别出70多种植物化学物质，按照其化学成分可分为异黄酮、三萜皂苷、香豆素和生物碱等几大类，一般认为异黄酮和三萜皂苷是葛根的主要活性成分。其中，异黄酮类主要为葛根素、染料木素、芒柄花素等。

2、葛根素因其有效的各种药理活性被广泛研究，其中包括心脏保护、血管舒张、心血管保护、抗炎、抗氧化、神经保护、减轻疼痛、促进骨形成、抑制酒精摄入、抗癌、肝保护、雌激素活性。实验和临床研究报道，葛根素也被广泛用于心血管疾病；糖尿病及其并发症；骨坏死和癌症的治疗。

3、除此之外，葛根素可延缓胃排空，减缓酒精的吸收速率，降低肠壁通透性，保护胃肠道黏膜。同时，葛根素还可以调节乙醇代谢相关酶的活性，如乙醇脱氢酶和醛脱氢酶，选择性灭活细胞色素，从而减少自由基的产生，减轻肝细胞损伤。葛根素可提高体内抗氧化酶的活性，降低肝损伤引起的组织中的氧化应激。

4、随着对葛根资源的开发利用以及不科学的采挖使野葛资源遭到严重破坏，一些优良的资源正在减少和消失。目前，葛根素主要从栽培的葛根中获得，生产成本大，种植周期长、产量低。另外，因种植品种单一，资源保护、品种选育研究滞后，导致病虫害增加、种性退化、品质、抗性以及产量都不断下降。根器官的离体培养是解决这一问题的有效手段之一，不定根由于生长速率快并且次生代谢产物生产能力稳定，不受环境条件制约，再加上它没有无“重毒副”和农药残留，在产品的开发方面更有优势，近几年来越来越受到市场关注。葛根含有丰富的酚类物质，在诱导过程中极易褐化，严重影响不定根的诱导与分化。

5、因此，有必要提供一种葛根不定根诱导培养方法及培养基配方，用以解决上述问题。

技术实现思路

1、根据上述提出的技术问题，而提供一种利用葛根叶片、根须直接诱导葛根不定根方法及培养基配方。本发明提供的培养基配方，能有效避免葛根不定根诱导过程中的褐化现象；并以葛根叶片、根须为材料直接进行不定根直接诱导，大大缩短了不定根的诱导时间，有效保持了亲本的优良性状，避免品种混杂和病毒在植株体内积累，并且不受季节限制等诸多优点。

2、本发明采用的技术手段如下：

3、一种利用葛根叶片、根须直接诱导葛根不定根方法，其特征在于，以葛根叶片、根须作为外植体进行不定根诱导，培养在含有0.5～5.0mg/l iba、20～30g/l蔗糖，7g/l琼脂，ph为5.5～6.5的ms培养基中。

4、进一步地，具体包括如下步骤：

5、s1、种子建立无菌苗：每升培养基称取20g ms培养基粉，30g蔗糖，7g琼脂，加入1l水中，搅拌均匀灭菌后用于种子成苗培养基；

6、种子冲洗去掉表面泥沙，在无菌水中浸泡4小时，用体积分数75％的酒精涮洗30s，用无菌水涮洗3次，再用5.5％的次氯酸钠溶液浸泡6分钟，用无菌水涮洗5次，无菌滤纸吸干表面水分，用无菌镊子插入培养基进行培养，(25±1)℃条件下12h光照培养30d，得到葛根无菌苗；

7、s2、不定根诱导培养基的配置：每升培养基称取20g ms培养基粉，20～30g蔗糖，7g琼脂，加入1l水中，搅拌均匀后加入0.5～5.0mg/l iba，调节ph至5.5～6.5，搅拌均匀后灭菌，得到诱导不定根培养基；

8、s3、不定根诱导：选用步骤s1中生长30d以上的无菌苗叶片、根须，

9、无菌刀划伤叶片，将叶片的背面紧贴步骤s2中得到的培养基进行培养，诱导形成不定根；

10、无菌刀划伤根须，将根须置于步骤s2中得到的培养基进行培养，诱导形成不定根。

11、进一步地，所述步骤s2中，每升培养基称取20g ms培养基粉，30g蔗糖，7g琼脂，加入1l水中，搅拌均匀后加入1.5mg/l iba或者4.0mg/l iba，调节ph至6.0，搅拌均匀后灭菌，得到诱导不定根培养基。

12、进一步地，所述步骤s3中的培养条件为：20～30℃条件下，暗培养30天。

13、进一步地，叶片不定根诱导率为≥45％。根须不定根诱导率为≥85％。

14、本发明还提供了一种利用葛根叶片、根须直接诱导葛根不定根的培养基配方，该培养基为ms培养基，含有0.5～5.0mg/l iba、20～30g/l蔗糖，7g/l琼脂，ph为5.5～6.5，培养时采用20～30℃条件下，暗培养。

15、本发明还提供了一种利用葛根叶片、根须直接诱导葛根不定根，采用上述的直接诱导葛根不定根方法培养生成。

16、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

17、1、本发明利用葛根叶片、根须直接诱导葛根不定根，叶片不定根诱导率为≥45％，根须不定根诱导率为≥85％。

18、2、本发明以葛根叶片、根须直接诱导葛根不定根为研究对象，通过统计诱导率及观察不定根生长变化情况，探明不定根生长及动态变化规律，利用iba激素调控，促进叶片、根须诱导不定根。

19、3、本发明获得的葛根不定根，可用于悬浮培养，生产葛根素。

20、本发明与现有技术中的一般先以外植体诱导愈伤组织，再用愈伤组织诱导不定根的方法相比，具有不定根诱导快速，重复性高，生产周期短，效率高，取材方便，可工厂化生产，同时不受自然灾害的影响等优点，为生产葛根素等生理活性物质提供新方法，以及葛根的合理开发利用提供新思路，可有效保护野生中草药资源，为传统中草药的现代化发展提供机遇。

21、基于上述理由本发明可在诱导葛根不定根技术领域广泛推广。

技术特征：

1.一种利用葛根叶片、根须直接诱导葛根不定根方法，其特征在于，以葛根叶片、根须作为外植体进行不定根诱导，培养在含有0.5～5.0mg/l iba、20～30g/l蔗糖，7g/l琼脂，ph为5.5～6.5的ms培养基中培养。

2.根据权利要求1所述的利用葛根叶片、根须直接诱导葛根不定根方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的利用葛根叶片、根须直接诱导葛根不定根方法，其特征在于，所述步骤s2中，每升培养基称取20g ms培养基粉，30g蔗糖，7g琼脂，加入1l水中，搅拌均匀后加入1.5mg/l iba或者4.0mg/l iba，调节ph至6.0，搅拌均匀后灭菌，得到诱导不定根培养基。

4.根据权利要求2所述的利用葛根叶片、根须直接诱导葛根不定根方法，其特征在于，所述步骤s3中的培养条件为：20～30℃条件下，暗培养30天。

5.根据权利要求2所述的利用葛根叶片、根须直接诱导葛根不定根方法，其特征在于，叶片不定根诱导率为≥45％。根须不定根诱导率为≥85％。

6.一种利用葛根叶片、根须直接诱导葛根不定根的培养基配方，其特征在于，该培养基为ms培养基，含有0.5～5.0mg/l iba、20～30g/l蔗糖，7g/l琼脂，ph为5.5～6.5，培养时采用20～30℃条件下，暗培养。

7.一种利用葛根叶片、根须直接诱导葛根不定根，其特征在于，采用如权利要求1～5任意一项权利要求所述的直接诱导葛根不定根方法培养生成。

技术总结
本发明提供一种利用葛根叶片、根须直接诱导葛根不定根方法及培养基配方。本发明属于生物技术领域，利用葛根叶片、根须作为外植体直接进行不定根诱导，培养在含有0.5～5.0mg/L IBA、20～30g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为5.5～6.5的MS培养基中培养。本发明与现有技术中，一般先以外植体诱导愈伤组织，再用愈伤组织诱导不定根的方法相比，具有不定根诱导快速，重复性高，周期短，取材方便，同时不受自然灾害的影响等优点。

技术研发人员：刘长斌,邱彦红,朱锦,张宗申,薛永常
受保护的技术使用者：大连工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/5/16