专利名称:一种硒化霍山石斛培养物的生产方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养技术领域：
，具体涉及一种硒化霍山石斛培养物的生产方法。
背景技术：
硒是人体生命活动中必不可少的微量元素之一,具有明显的延缓衰老、提高机体免疫力、抗癌、抗氧化、抗辐射、抗植物病害等生理功能。我国大部分地区严重缺乏硒元素，地球表面大部分是贫硒水土，人类食物中硒含量绝大多数不能满足人体对硒的需要，因此，开发富硒产品，提高硒摄入量，对于提高人民群众的健康水平具有重要的意义。
霍山石斛Awo1SAaflefl1Si )是兰科石斛属草本植物,具有生津益胃、润肺止渴、清音明目之功效，被历代本草推崇为石斛中的上品，亦深受现代人们的青睐。但是，霍山石斛的生长对环境要求近于苛刻，加之过度采集及生境改变，野生霍山石斛资源严重枯竭。资源的枯竭已经严重制约了霍山石斛医药、保健价值的开发利用。
植物组织培养技术是生物技术的重要组成部分，已在优良品种的快速繁殖、种质资源的保存等方面被成功应用。人们采用组织培养方法，通过外植体诱导形成愈伤组织或拟原球茎或丛生芽，获得了霍山石斛无菌试管苗，栽培后可以获取石斛再生植株。然而，由于生长环境和生理性状的特殊性，试管苗从无菌且光照、温度、湿度稳定的培养容器内移出栽植时，正常光合生理 活动难以得到保证，试管苗的生长发育迟缓，病变或死亡率高，因此，在试管苗移栽驯化阶段，需要添加激素以增强试管苗的光合自养能力、抗逆能力以及移栽成活率；而且，试管苗移栽大田后，仍离不开喷洒大量农药以防治病虫害。为此，田间栽培的霍山石斛资源也非常稀少，只有极少量被移栽在霍山县长冲药材场。可见，当前急需解决快速、高效地生产无激素、无农药残留的霍山石斛的方法，以可持续利用濒危霍山石斛，服务人类健康。
愈伤组织实质上是正在生长分化的体细胞胚胎，具有植株相同的物质代谢和形态发育潜能，可用来代替原药材生产相关的活性物质。公开号为CN1762207A的发明专利采用植物组织培养方法，取铁皮石斛种子无菌试管苗诱导、原球茎诱导、原球茎驯化，再转移至培养基上培养苗生长，苗生长培养基中添加萘乙酸、亚硒酸钠以及其他必需营养素以生产富硒铁皮石斛。但不同石斛因各自生理特性和生存条件的不同，其培养方法也不相同，霍山石斛本身就是石斛属植物中最难人工培育种。
发明内容
为了实现低成本、标准化、规模化生产无激素、无农药残留的高品质霍山石斛替代物，本发明提供一种硒化霍山石斛培养物的生产方法。愈伤组织水分含量高、组织脆嫩，因此，本发明采用植物组织培养技术、光调控技术协同含有机硒的低盐培养基，生产硒化霍山石斛培养物；光不仅为植物光合作用提供辐射能，还为植物提供信号调节其发育过程，控制植物的生长发育模式。[0007]本发明的具体操作步骤如下:
一种硒化霍山石斛培养物的生产方法包括利用固体高盐培养基诱导获取霍山石斛无菌实生苗，黑暗协同低盐培养基选育获取耐硒霍山石斛愈伤组织，蓝光辅助低盐培养基驯化硒化霍山石斛愈伤组织，日光灯光照生产硒化霍山石斛培养物；干燥的硒化霍山石斛培养物中有机硒质量分数不低于5(^g/g。
硒化霍山石斛培养物的具体生产操作步骤如下:
(I)霍山石斛无菌实生苗的诱导:取成熟的霍山石斛果实，先用体积分数为70 75 mL/100mL的酒精水溶液漂洗3 5分钟，再用质量分数为2g/100mL的次氯酸钠水溶液浸泡20 30分钟，然后用无菌水冲洗3 5次，最后去除果皮，取出种子，将种子均匀撒在固体高盐培养基上，在温度20±2°C、光照强度2000±200勒克斯、每天光照12小时的条件下培养5 6个月，收集4 5cm高的无菌苗，即为霍山石斛无菌实生苗；所述固体高盐培养基由下列重量或体积的原料组成:鹿糖30000 mg、硝酸钾950 mg、硝酸铵825 mg、氯化隹丐220 mg、硫酸镁185 mg、磷酸二氢钾85 mg、硫酸猛8.45 mg、硫酸锌4.3 mg、硼酸3.1 mg、碘化钾0.415 mg、钥酸钠0.125 mg、硫酸铜0.0125 mg、氯化钴0.0125 mg、乙二胺四乙酸二钠
18.625 mg、硫酸亚铁13.925 mg、肌酉享50 mg、甘氨酸I mg、盐酸批P多醇0.25 mg、烟酸0.25mg、盐酸硫胺素0.05 mg、琼脂5000 6000 mg、水I L，pH值5.8 ;
(2)耐硒霍山石斛愈伤组织的选育:取长0.5 1.0厘米的霍山石斛无菌实生苗的带节茎段，插入第一固体低盐培养基中，在温度20±2°C、黑暗环境中培养30 35天，得到耐硒霍山石斛愈伤组织；
(3)硒化霍山石斛愈伤组织的驯化:取耐硒霍山石斛愈伤组织，转入第二固体低盐培养基中，在温度20±2°C、60 μ mol/m2/s光量的蓝光光照条件下培养35 45天，收集生长旺盛的翠绿色的第一愈伤组织；将第一愈伤组织转入第三固体低盐培养基中，在温度20±2 °C、60 μ mol/m2/s光量的蓝光每天光照12小时的条件下培养35 45天，收集生长旺盛的翠绿色的第二愈伤组织；将第二愈伤组织转入第四固体低盐培养基中，在温度20±2 °C、60 μ mol/m2/s光量的蓝光每天光照12小时的条件下培养35 45天，收集生长旺盛的翠绿色的第三愈伤组织；将第三愈伤组织转入第五固体低盐培养基中，在温度20±2°C、60y mol/mVs光量的蓝光每天光照12小时的条件下培养35 45天，收集生长旺盛的翠绿色的第四愈伤组织；将第四愈伤组织转入第六固体低盐培养基中，在温度20±2°C、光照强度2000 2500勒克斯、日光灯每天光照12小时的条件下培养35 45天，收集生长旺盛的翠绿色的愈伤组织，即为硒化霍山石斛愈伤组织种源；
(4)硒化霍山石斛培养物的生产:取硒化霍山石斛愈伤组织种源，转入灭菌第七固体低盐培养基中，在温度20±2°C、光照强度2000 2500勒克斯、日光灯每天光照12小时的条件下培养45 50天，得硒化霍山石斛培养物；干燥的硒化霍山石斛培养物中有机硒质量分数不低于5(^g/g。
所述第一固体低盐培养基、第二固体低盐培养基、第三固体低盐培养基、第四固体低盐培养基、第五固体低盐培养基、第六固体低盐培养基、第七固体低盐培养基均由下列重量或体积的原料组成:鹿糖20000 mg、硝酸钾80 mg、 朽1檬酸2.0 mg、硝酸韩287.0 mg、硫酸镁738.0 mg、硫酸纳53.0 mg、氯化钾65.0 mg、磷酸二氢钠19.1 mg、盐酸硫胺素0.1 mg、盐酸批卩多素0.1 mg、盐酸0.5 mg、甘氨酸3.0 mg、硫酸猛6.6 mg、硫酸锌2.7 mg、碘化钾0.75mg、硼酸 0.5 mg、琼脂 5000 6000 mg、水 I L，pH 值 5.8。
所述第一固体低盐培养基、第二固体低盐培养基中均还含有质量分数为0.lg/L的富硒酵母，第三固体低盐培养基中还质量分数为0.2g/L的富硒酵母，第四固体低盐培养基还质量分数为0.5g/L的富硒酵母，第五固体低盐培养基、第六固体低盐培养基、第七固体低盐培养基中均还含有质量分数为1.0g/L的富硒酵母。
所述富硒酵母的生产菌株为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cereFisiae),保藏号 CGMCC 0539 ;富硒酵母按照专利号 01100600.5 的生产方法培养获得，为淡黄色或淡黄棕色的颗粒或粉末，总硒为67(Γ730μ g/g，其中无机硒不得过总硒量的15.0%。
与现有技术相比，本发明方法具有如下优点:
(I)本发明实现了低成本、标准化、规模化地生产无激素、无农药残留的高品质霍山石斛替代物，不仅保护了濒危霍山石斛种质资源，而且为可持续利用霍山石斛资源提供了新途径；
(2)本发明通过光调控技术联合含有机硒的低盐培养基，选育耐硒霍山石斛愈伤组织，再采用日光灯光照联合有机硒生产硒化霍山石斛培养物，高效简单、过程可控；
(3)本发明 生产出的硒化霍山石斛培养物兼有有机硒与霍山石斛的双重作用，产品质量高，提高霍山石斛产业竞争力，增加霍山石斛经济效益。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步地说明。
实施例1:
一种硒化霍山石斛培养物的具体生产操作步骤如下:
步骤1、霍山石斛无菌实生苗的诱导:取成熟的霍山石斛果实，先用体积分数为70mL/100mL的酒精水溶液漂洗5分钟，再用质量分数为2g/100mL的次氯酸钠水溶液浸泡30分钟，然后用无菌水冲洗3次，最后去除果皮，取出种子，将种子均匀撒在固体高盐培养基上，在温度20±2°C、光照强度2000±200勒克斯、每天光照12小时的条件下培养6个月，收集4 5cm高的无菌苗，即为霍山石斛无菌实生苗；
所述固体高盐培养基由下列重量或体积的原料组成:蔗糖30000 mg、硝酸钾950mg、硝酸铵825 mg、氯化|丐220 mg、硫酸镁185 mg、磷酸二氢钾85 mg、硫酸猛8.45 mg、硫酸锌4.3 mg、硼酸3.1 mg、碘化钾0.415 mg、钥酸钠0.125 mg、硫酸铜0.0125 mg、氯化钴
0.0125 mg、乙二胺四乙酸二钠18.625 mg、硫酸亚铁13.925 mg、肌醇50 mg、甘氨酸I mg、盐酸吡哆醇0.25 mg、烟酸0.25 mg、盐酸硫胺素0.05 mg、琼脂5000 mg、水I L，pH值5.8 ;
步骤2、耐硒霍山石斛愈伤组织的选育:取长0.5-1.0厘米的霍山石斛无菌实生苗的带节茎段，插入第一固体低盐培养基中，在温度20±2°C、黑暗环境中培养30天，得到耐硒霍山石斛愈伤组织；
步骤3、硒化霍山石斛愈伤组织的驯化:取耐硒霍山石斛愈伤组织，转入第二固体低盐培养基中，在温度20±2°C、60ymol/m2/s光量的蓝光光照条件下培养35天，收集生长旺盛的翠绿色的第一愈伤组织；将第一愈伤组织转入第三固体低盐培养基中，在温度20±2°C、60y mol/mVs光量的蓝光每天光照12小时的条件下培养35天，收集生长旺盛的翠绿色的第二愈伤组织；将第二愈伤组织转入第四固体低盐培养基中，在温度20±2°C、60 μ mol/m2/s光量的蓝光每天光照12小时的条件下培养35天，收集生长旺盛的翠绿色的第三愈伤组织；将第三愈伤组织转入第五固体低盐培养基中，在温度20±2°C、60ymOl/m2/s光量的蓝光每天光照12小时的条件下培养35天，收集生长旺盛的翠绿色的第四愈伤组织；将第四愈伤组织转入第六固体低盐培养基中，在温度20±2°C、光照强度2000勒克斯、日光灯每天光照12小时的条件下培养35天，收集生长旺盛的翠绿色的愈伤组织，即为硒化霍山石斛愈伤组织种源；
步骤4、硒化霍山石斛培养物的生产:取硒化霍山石斛愈伤组织种源，转入灭菌第七固体低盐培养基中，在温度20 ± 2 °C、光照强度2000勒克斯、日光灯每天光照12小时的条件下培养50天，得硒化霍山石斛培养物；所述硒化霍山石斛培养物的干燥成品中有机硒含量为 50.67Pg/g。
所述第一固体低盐培养基、第二固体低盐培养基、第三固体低盐培养基、第四固体低盐培养基、第五固体低盐培养基、第六固体低盐培养基、第七固体低盐培养基均由下列重量或体积的原料组成:鹿糖20000 mg、硝酸钾80 mg、朽1檬酸2.0 mg、硝酸韩287.0 mg、硫酸镁738.0 mg、硫酸纳53.0 mg、氯化钾65.0 mg、磷酸二氢钠19.1 mg、盐酸硫胺素0.1 mg、盐酸批卩多素0.1 mg、盐酸0.5 mg、甘氨酸3.0 mg、硫酸猛6.6 mg、硫酸锌2.7 mg、碘化钾0.75mg、硼酸 0.5 mg、琼脂 5000 mg、水 I L，pH 值 5.8。
所述第一固体低盐培养基、第二固体低盐培养基中均还含有质量分数为0.lg/L的富硒酵母，第三固体低盐培养基中还质量分数为0.2g/L的富硒酵母，第四固体低盐培养基还质量分数为0.5g/L的富硒酵母，第五固体低盐培养基、第六固体低盐培养基、第七固体低盐培养基中均还含有质量分数为1.0g/L的富硒酵母。富硒酵母的生产菌株为中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的酿酒酵母iSeiccheiromycGS cerevisiae),保藏号CGMCC0539。
表I
权利要求
1.一种硒化霍山石斛培养物的生产方法，其特征在于:包括利用固体高盐培养基诱导获取霍山石斛无菌实生苗，黑暗协同低盐培养基选育获取耐硒霍山石斛愈伤组织，蓝光辅助低盐培养基驯化硒化霍山石斛愈伤组织，日光灯光照生产硒化霍山石斛培养物；干燥的硒化霍山石斛培养物中有机硒质量分数不低于5(^g/g ;所述硒化霍山石斛培养物的具体生产操作步骤如下: (1)霍山石斛无菌实生苗的诱导:取成熟的霍山石斛果实，先用体积分数为70 75mL/100mL的酒精水溶液漂洗3 5分钟，再用2g/100mL的次氯酸钠水溶液浸泡20 30分钟，然后用无菌水冲洗3 5次，最后去除果皮，取出种子，将种子均匀撒在固体高盐培养基上，在温度20±2°C、光照强度2000±200勒克斯、每天光照12小时的条件下培养5 6个月，收集4 5cm高的无菌苗，即为霍山石斛无菌实生苗；所述固体高盐培养基由下列重量或体积的原料组成:鹿糖30000 mg、硝酸钾950 mg、硝酸铵825 mg、氯化韩220 mg、硫酸镁.185 mg、磷酸二氢钾85 mg、硫酸猛8.45 mg、硫酸锌4.3 mg、硼酸3.1 mg、碘化钾0.415 mg、钥酸钠0.125 mg、硫酸铜0.0125 mg、氯化钴0.0125 mg、乙二胺四乙酸二钠18.625 mg、硫酸亚铁13.925 mg、肌醇50 mg、甘氨酸I mg、盐酸卩比卩多醇0.25 mg、烟酸0.25 mg、盐酸硫胺素 0.05 mg、琼脂 5000 6000 mg、水 I L，pH 值 5.8 ; (2)耐硒霍山石斛愈伤组织的选育:取长0.5 1.0厘米的霍山石斛无菌实生苗的带节茎段，插入第一固体低盐培养基中，在温度20±2°C、黑暗环境中培养30 35天，得到耐硒霍山石斛愈伤组织； (3)硒化霍山石斛愈伤组织的驯化:取耐硒霍山石斛愈伤组织，转入第二固体低盐培养基中，在温度20±2°C、60 μ mol/m2/s光量的蓝光光照条件下培养35 45天,收集生长旺盛的翠绿色的第一愈伤组织；将第一愈伤组织转入第三固体低盐培养基中，在温度20±2°C、.60ymol/m2/S光量的蓝光每天光照12小时的条件下培养35 45天，收集生长旺盛的翠绿色的第二愈伤组织；将第二愈伤组织转入第四固体低盐培养基中，在温度20±2°C、.60ymol/m2/S光量的蓝光每 天光照12小时的条件下培养35 45天，收集生长旺盛的翠绿色的第三愈伤组织；将第三愈伤组织转入第五固体低盐培养基中，在温度20±2°C、.60 μ mol/m2/s光量的蓝光每天光照12小时的条件下培养35 45天，收集生长旺盛的翠绿色的第四愈伤组织；将第四愈伤组织转入第六固体低盐培养基中，在温度20±2°C、光照强度2000 2500勒克斯、日光灯每天光照12小时的条件下培养35 45天，收集生长旺盛的翠绿色的愈伤组织，即为硒化霍山石斛愈伤组织种源； (4 )硒化霍山石斛培养物的生产:取硒化霍山石斛愈伤组织种源，转入灭菌第七固体低盐培养基中，在温度20±2°C、光照强度2000 2500勒克斯、日光灯每天光照12小时的条件下培养45 50天，得硒化霍山石斛培养物；干燥的硒化霍山石斛培养物中有机硒质量分数不低于5(^g/g ； 所述第一固体低盐培养基、第二固体低盐培养基、第三固体低盐培养基、第四固体低盐培养基、第五固体低盐培养基、第六固体低盐培养基、第七固体低盐培养基均由下列重量或体积的原料组成:鹿糖20000 mg、硝酸钾80 mg、朽1檬酸2.0 mg、硝酸韩287.0 mg、硫酸镁.738.0 mg、硫酸钠53.0 mg、氯化钾65.0 mg、磷酸二氢钠19.1 mg、盐酸硫胺素0.1 mg、盐酸批口多素0.1 mg、盐酸0.5 mg、甘氨酸3.0 mg、硫酸猛6.6 mg、硫酸锌2.7 mg、碘化钾0.75mg、硼酸 0.5 mg、琼脂 5000 6000 mg、水 I L，pH 值 5.8 ;所述第一固体低盐培养基、第二固体低盐培养基中均还含有0.lg/L的富硒酵母，第三固体低盐培养基中还含有0.2g/L的富硒酵母，第四固体低盐培养基还含有0.5g/L的富硒酵母，第五固体低盐培养基、第六固 体低盐培养基、第七固体低盐培养基中均还含有1.0g/L的富硒酵母。
专利摘要
本发明公开了一种硒化霍山石斛培养物及其生产方法。该方法包括诱导获取霍山石斛无菌实生苗，黑暗协同低盐培养基选育获取耐硒霍山石斛愈伤组织，蓝光辅助低盐培养基驯化硒化霍山石斛愈伤组织，日光灯光照生产硒化霍山石斛培养物；按本发明所描述的方法生产的硒化霍山石斛培养物的干燥成品中有机硒质量分数不低于50μg/g，本发明提供的方法可实现低成本、标准化、规模化生产无激素、无农药残留的高品质霍山石斛替代物，硒化霍山石斛培养物产品具有霍山石斛与有机硒的活性品质，可在医药、保健品中应用。
文档编号A01H4/00GKCN102835317 B发布类型授权 专利申请号CN 201210366731
公开日2013年8月28日 申请日期2012年9月28日
发明者杨思林 申请人:安徽省华信生物药业股份有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan