专利名称:掌状叶大黄的茎尖培养法的制作方法
本发明是有关掌状叶大黄(以下说明的掌状叶大黄是日本药典第十次修正此记载的Rheum palmatum linne′，Rheum offic-inale Baillon，Rheum tanguticum Maximowicz Rheum coreanum Nakai，以及介于这些种之间的杂种，但不包括Rheum undulatum L.Rheum rhaponticum L)的茎尖养法、更确切地说是关于可行的掌状叶大黄的培养增殖的方法。
蓼科大黄属(Rheum)是生长于欧亚大陆各地植物群，根据叶身形状不同而分为圆叶大黄和掌状叶大黄，自花不亲合而多要通过种间杂交，种子的特性是具有仅通过营养繁殖来保持共同的性质。而圆叶大黄是用于果酱等食品，掌状叶大黄则广泛地用作以泻甙(senn-oside)A，B，C，D，蒽醌类、丹宁类等为药效成份的生药。
可是，大黄存在属有1个问题，就是如上所述由于多是种间杂交等原因，所以就不可能大量地以及常年稳定地获得具有一定质量的大黄。因而很早以来采用营养增殖法的方法以及作为这种植物的组织培养法而为公所周知的茎尖培养法等就一直在进行研究。例如沃尔基氏等(D，G、A、Walkey ＆ K、A、MatheWs)就提出过有关圆叶大黄中的R、rhaponticum Timpertey Early的茎尖培养法(Plant Science Letters，14，287…290(1979)。沃尔基氏等的方法之特征是;在加有激动素及β吲哚基乙酸的培养基上进行茎尖培养。
然而本发馀人通过对掌状叶大黄施于同样的方法试验，结果发现生长点细胞没有增殖而枯死。一般认为这是由于圆叶大黄和掌状叶大黄种类的不同而对生长激素的要求不同所致。
本发明从上述的观点出发而旨在于提供可行的具有药效成份的掌状叶大黄的培养增殖的方法。
另外，本发明的另一目的就是通过在一定条件下的培养能够通过均一而且理想的育苗，保种而获得稳定的含有一定质量的有效成份的大黄。
达成上述之目的的本发明之茎尖培养法所具有的特征是采用含有有苄腺嘌呤或者是其的核苷(苄腺苷)和萘乙酸或者是β吲哚基乙酸的培养基，来进行新芽的形成和增殖，然后在只含有萘乙酸或者β吲哚基乙酸中任何一种来作为生长激素的培养基上来让其生根。
有关本发明所具有的特征是基于经过反复多种的试验之结果而形成的，以下对此给予详细地说明。
当有在以下的说明里，对于广义的生长激素这个词，主要是作用于形态生长的就称态生长激素，而主要是作用于分化促进的就称分化促进激素，这样来便于使用。这些词虽然可能说能够符合多数研究者的意见，但是本发明人认为在说明本发明时是有效而且是比较合理的用语。
所谓的本发明之茎尖培养法是指适用于无菌取出生长点，培养(新芽形成、增殖、生根)、及幼苗栽培。
无菌取出生长点大黄的生长点存在于根茎最上部，一般是生长期(4月下旬至10月上旬)用刀具把根茎部切断，除去露出部、灭菌、水洗后在解剖显微镜下用刀具取出。
培养培养工程是按新芽(叶片，叶柄，幼芽愈合体素)形成，增殖(分化)以及生根的顺序三个工程来进行。这些各个工程都是根据适宜的培养方法以及适宜各个工程的培养基的选择来决定适当的培养条件。
培养基是由一般的基础培养基也就是在无机盐组成里含有碳(C)源，维他命类等有机物主要成份的含成培养基加上特定的形态生长激素及分化促进而形成的。
本发明的特征是在上述新牙形成、增殖(分化)的前二个工程里、是使用萘乙酸或者β吲哚基乙酸的任何一种来作为形态生长激素，而作为分化促进激素则使用苄基腺嘌呤，苄基腺嘌呤是可以以核苷即苄腺甙代替使用。
上述萘乙酸的浓度一般可在1.1×10-5-4.2×10-5mol/l范围内使用，较好的范围是2.1×10-5-4.2×10-5mol/l，最适宜的使用约为2.1×10-5mol/l。而在1.1×10-5mol/l以下分蘖度就不允分，在4.2×10-5mol/l以上，特别在5.3×10-5mol/l就有出现药害的倾向。
β吲哚基乙酸一般可在1.7×10-5-6.7×10-4mol的范围使用，但是新牙的形态生长的程度，比采用萘乙酸的场合低。
苄基腺嘌呤(或者是核苷)的浓度一般在8.8×106-5.6×105mol/l的范围内是有效的，而最适合的使用浓度为3.4×105mol/l。如果在5.6×105mol/l以上就会有1/100以上的比例出现抽苔(形成花芽，并可看到植物衰退)。
当有与本发明相对比，作为形态生长激素所选择的有β吲哚丁酸，赤霉素、2，4-二硝基苯氧基乙酸，还有作为分化促进激素则选择动力精，包括这些与上述的萘乙酸，β吲哚基乙酸以及苄嘌呤把组合进行了试验，而在本发明所特定的生长激素的组合以外的则如后面表1所示未发现有新牙形成。
培养一般是在适于植物细胞内的PH5.6进行。培养法有采用培养瓶的静止培养，转换培养以及让氧气不断地流入液体培养基里而进行的容器培养等均可适宜地进行选择。特别是有关新牙形成多要求采用滤纸交联上的培养，而关于增殖(分化)则多要采用琼脂培养基的转换培养。
以下就生根工程加予叙述。本工程是在只含植物生长激素中的形态生长激素的上述基础养基，也就是在只加有萘乙酸或者是β吲哚基乙酸中的任何一种培养基上进行培养。通常的是，增殖用的培养基是采用萘乙酸作为生根的培养基时就添加萘乙酸，如是采用β吲哚基乙酸的话则添加β吲哚基乙酸，在缺减苄腺嘌呤的培养基上进行生根培养。
在生根工程里，培养基不含有分化促进激素，在新牙形成及增殖工程所用的形态生长激素和在本工程所用的形态生长激素之间所特定的一定的关系是本工程的特征，也就是说在生根工程所用的培养基(称作生根培养基)，在增殖工程中所用的将养基(称作增殖培养基)是含有β吲哚基乙酸的场合就可以采用萘乙酸或者是β吲哚基乙酸的任何一种，而增殖培养基是含有萘乙酸的场合。生根培养基就只适合采用萘乙酸，在这种场合下如果使用β吲哚基乙酸其结果就不能生根而最终枯死。
另外，生根工程的培养不适于在滤纸交联上，通常如采用琼脂培养基进行可以获得很高的良好的生根效率。
幼苗栽培通过上述培养生根后的幼小植物在土盆内经过中至在石中温室栽培使植物体充实之后(约1个月)，在土盆内移植到培养土中进行幼苗调节(约1-3个月)。
从农学的观点来看，如上述在发牙所用的培养即在土盆内采用，蛭不争取让根得到充实之后再移到培养土里的方法在其方法适当，培育成之后的幼苗照旧在上述土盆里于栽培园圃进行适宜育苗之后后就分给栽培农厂。
以下就本发明的实施例对照比较进行说明。
(1)无菌取出生长点从掌状叶大黄Rheum Palmatum系的北海大黄(在北海道大学药学付属药用植物园通过营增殖法多化繁衍)的生长期根茎部头部，遵照沃尔基氏等的方法取出生长点。灭菌是通过70%的乙醇3分钟，1%的次氯酸8分钟，水洗3分钟来进行。
(2)新芽形成在下述表1所示的基础培养基(在认无机盐组成的Murachige-Skoog培养基加上有机物)加上生长激素(实施例1.2)来进行新芽形成。还有作为比较例1-8是在上述基础培养基加上其它的生激素所进行的试验。
培养是把表1.2的培养基的PH调整到5.6，加入插入有滤纸交联的三角烧瓶，在120℃加压灭菌20分钟，再把由上述方法无菌取出的生长点于22℃栽置在滤纸交联上，进行16个小时的照明(光度4000Lux)。还有萘乙酸由于在水溶液或者琼脂培养基中很容易通过光来分解，所以在调整PH后添加，进行加压灭菌。
表2的结果表明在实施例1里新芽形成良好而且粗壮，而在实施例2里实施例，相比只有1/10左右的新芽形成，在比较例2里新芽没有形成而多数形成花芽开花，在其它的比较例里则没有发现新芽的形成。
以上的试验是在4月上旬-5月上旬重复3次所获得同一结果，还有从4月中旬到10上旬就实施例1的培养基上的新牙做了8次试验、新牙的形成获得成功，也就是说历经整个大黄的繁殖期的茎尖培是可能的。
(3)增殖(分化)以在表2的实施例1所得的新牙作为对象，采用如表3.4所示在表1的基础培养基加上苄腺嘌呤、萘乙酸、β吲哚基乙酸的增殖培养未进行培养(实施例1-1-1-8、2-1-2-3)以及(比较例1-1-1-5)。培养法除了在0.8%琼脂培养基上进行外，其它与实施例1相同。结果于表3.4表示，此外，采用动力精作为分化促进激素时、以及用β吲哚基乙酸、萘乙酸、β吲哚基丁酸、赤霉素2-4-二亚硝基苯氧基乙酸作为形态生长激素时都未发现有新牙的形成，而且17日之后全部枯死。
(4)生根分别于表示了的实施例1-1-1-8增殖的新牙，一部分是作为增殖用而继续培养，其它一部分是从表3的实施例1-1及1-7的培养基移到采用去除苄腺吟的生根培养基A、B进行生根培养。培养法除了是在0.8%琼脂培养基上进行之外，其它与实施例1相同。
各实施例的新牙除了实施例1-1的以外均在3-4星期之间生了根。实施例1-1的新牙有1/10的比例抽苔，同时在上述生根培养基B上三周之内没有生根，3周后移植到新调整之后的新鲜的生根培养B，2周之后发现生根。
还有在滤纸交联上进行生根时已确认根毛发育不好，而且根毛很快就会枯死。
此外，在实施例2-1及2-2培养基上把增殖的新牙群分成一个一个细小的新牙，添加β吲哚基乙酸4.6×10-5M，在除去苄腺嘌呤的生根培养基上进行培养，3至4周之后生根并显示出把上部的生长。
发明效果本发明如上所述是通过采用含有苄腺哚呤或者是其的核苷和萘乙酸或者是β吲哚基乙酸的培养基，第一次可以进行掌状叶大黄的增殖培养，通过在一定条件下的培养可以进行均一而且理想的育苗、种的保存，并能稳定地获得有用的药效物质，因而具有很大的实用意义。
权利要求
本发明之掌状叶大黄的茎尖培养法所具有的特征是采用含有苄腺腺嘌呤或者是其的核苷和萘乙酸或者是β吲哚基乙酸的培养基来进行新牙形成及增殖培养，然后在只含萘乙酸或者是β吲哚基乙酸中的任何一种来作为生长激素的培养基上进行生根培养。
专利摘要
本发明之茎尖培养法所具有的特征是采用含有 苄腺嘌呤或者是其的核苷(苄腺苷)和萘乙酸或者 是β吲哚基乙酸的培养基来进行新芽的形成和增 殖，然后在只含有萘乙酸或者β吲哚基乙酸中的任 何一种来作为生长激素培养基上让其生根。
文档编号C12N5/00GK85106601SQ85106601
公开日1986年9月3日 申请日期1985年8月31日
发明者金子光 申请人:和喜伊藤公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan