制备无性生殖植物的方法

专利名称：制备无性生殖植物的方法
相关申请的相互参考本申请要求1997年2月5日提交的美国临时申请60/037,211的权利。
背景技术：
本发明涉及从正常有性生殖的植物制备可以通过自身的种子(配子体无性生殖体)遗传克隆自身的植物的方法。更特别地是，本发明涉及的方法包括(a)选择两个或多个表达生殖表型彼此不同的有性生殖株系，它在某些情况下需要植物育种和选择以得到足够程度的差异，(b)繁殖表型不同的植物间杂交，并且(c)杂交前或后进行双倍体化(染色体加倍)。
无性生殖好象比其它任何植物机制更能提高食物、饲料和纤维的产量。无性生殖发生于约0.3％的有花植物物种。本专利申请描述了在不使用两种都已被尝试过但效果不令人满意的方法，即有性生殖植物与野生型无性生殖相关物杂交和诱变方法，使有性生殖植物无性生殖的方法。此处描述的方法模拟了无性生殖植物自然进化的方式(J.G.Carman，重复基因在被子植物中的不同步表达可导致无性生殖、双担孢子形成、四分孢子状态和多胚性，61 Biol.J.Linnean Soc.51-94(1997)(在此引用作为参考；从此以后称为“Linnean”)，并且可以使植物育种和遗传学领域的熟练人员能够将近交农作物，包括小麦、大麦和水稻转变成为潜在的产量比目前使用的近交品种提高10-30％的无性生殖的杂种农作物。目前使用的杂种农作物如玉米也可被改造成无性生殖的。近交或典型的杂种农作物的无性生殖杂种只是在其优良的产量方面是杂种。无性生殖杂种的种子是其母本杂种的遗传克隆，即，不出现遗传分离。因此，年复一年，农场主可将其收获物的一小部分用作种子并可期望得到高产量和同一性。这将使通常种子很昂贵的杂种首次用于贫穷的国家，对另一场“绿色革命”作出巨大的贡献。
Gregor Mendel在无意识的情况下进行了首次配子体无性生殖体的(无性产生种子的植物)遗传实验。他报道了不同山柳菊株系的成功杂交但评论了防止自体受精的极度困难。他所想的是高频率的意外自交(在他的兼性无性生殖山柳菊株系中)实际上是高频率的无性生殖种子形成。除了他的挫折以外，他也未能在他设法产生的少数F1s的F2s中观察到分离。他的F2s实际上是他的F1s的无性生殖克隆，它们毫无例外地表达它们各自的F1表型(S.E.Asker & L.Jerling，植物中的无性生殖(CRC出版社，1992)(在此引用作为参考；从此以后被称为“Asker & Jerling”).
在Mendel使这个无配系群的成员杂交的时候，数千种山柳菊被描述。这种明显的多态性、在其它无配系群(Antennaria、Erigeron、Taraxacum、Potentilla)中观察到的多态性以及Mendel的通过兼性无性生殖体产生新的多态性的结果使得早期的遗传学家推断无配系群中的杂交是物种形成的主要机制。支持这个结论的证据充分，如，在Amelanchier和Crataegus中(C.S.Campbell & T.A.Dickinson，无性生殖，形态变异的型式以及Maloideae亚科(Rosaceae)中的物种概念，15 SystematicBot.124-25(1990)(在此引用作为参考)、在Antennaria(Bayer等，根据核核糖体DNA内部转录间隔(ITS)的Antennaria系统发生推论(AsteraceaeGnaphalieae)，83美国植物学杂志，516-527(1996)(在此引用作为参考)、在多种无配系草群中(E.A.Kellogg，无融合结籽草中的变异和物种限制，15 Systematic Bot.112-23(1990)(在此引用作为参考)、在Rubus中(Nybom，用DNA指纹评估兼性无性生殖黑霉(Rubus亚属Rubus)中的种间杂交实验，122 Hereditas 57-65(1995)(在此引用作为参考)、在Taraxacum中(Richards，Taraxacum无性种的起源，66 Biol.J.Linnean Soc.189-211(1973)(在此引用作为参考)等。与此相反，在早期遗传学家中很快发展了关于杂交在无性生殖起源中作用两种相互矛盾的观点。Strausburger，Zeitpunkt der Bestimmung desGeschlechtes，Apogamie，Parthenogenesis und Reduktionsteilung，7 Hist.Beitr.1-124(1909)(在此引用作为参考)，Ostenfeld，山柳菊物种起源的实验(无配子生殖和杂交型)，11 New Phytol.347-54(1912)(在此引用作为参考)和Holmgren，Zytologische Studien uberdie Fortpflanzung bei den Gattungen Erigeron und Eupatorium，59Kgl.Sven Vetenskapsakad. Ak. Handl. No. 7，1-118(1919)(在此引用作为参考)认为无性生殖由无性生殖特异的遗传因素(基因)控制而不是杂交的结果。相反，A.Ernst，Bastardierung als Ursache derApogamie im Pflanzenreich，Fischer，Jena(1918)(在此引用作为参考)认为负责无性生殖的生殖细胞学异常是在远缘杂种中观察到的基因组紊乱的延伸。
Ernst积累了很多证据支持他的杂交假说，包括如下事实，无性生殖植物具有高的染色体数目(它们通常是多倍体)、无配系群高度多态、无性生殖植物的生殖细胞通常以在种间杂种中观察到的方式退化。Ernst假说的主要的并且导致它很快被广泛的不予考虑(并且导致到至今仍正式不予考虑)的原则是杂种形成了从完全有功能的有性繁殖到无性生殖最终到营养繁殖的连续体。杂种适合于连续体的程度依赖于亲本物种密切相关的程度，如，如果亲本密切相关，杂种将有性繁殖，如果亲本中等程度相关，杂种倾向于无性生殖，如果亲本亲缘关系相距很远，杂种倾向于营养繁殖。因此，依据Ernst，杂种仅仅起源于远缘杂种。Ernst没有确定杂交广泛性以外的支持无性生殖杂种起源的机制。
Ernst的假说在二十世纪二、三十年代受到支持(Harrison，大陆Tephrosia crepuscularia和Britisht bistortata间的杂种黑化的遗传性，及关于种间杂交中孤雌生殖起源的谈论，9 Genetika 4467(1927)(在此引用作为参考)；G.L.Stebbins，Antennaria的细胞学II孤雌生殖物种，94 Bot. Gaz.322-45(1932)(在此引用作为参考))，但是当Ake Gustafsson发表了他的综合论述，A Gustafsson，高等植物的无性生殖，I.无性生殖的机制，42 Lunds Universitets Arsskrift 1-67(1946)，A Gustafsson，高等植物的无性生殖，II.无性生殖的原因，43 Lunds Universitets Arsskrift 69-179，(1947)，A Gustafsson，高等植物的无性生殖，III.生物型和物种形成，43 Lunds UniversitetsArsskrift 181-370(1947)(在此引用作为参考)。在这个论述中，Gustafsson总结到“在任何情况下都不能证明杂交本身能够产生无性生殖。相反，毫无疑问的是，无性生殖方法在很多情况下起源于物种群内。”于1946年记录的某些无性生殖体是同源多倍体的事实正式反驳了任何认识到的对于远缘杂交的要求。由此，因为Ernst的假说认为无性生殖的细胞学机制是在远缘杂种的配子形成过程中观察到的细胞学异常的延伸，它通过定义包含了在减数分裂过程中阻止染色体配对的总体上有差异的基因组，所以它瓦解了。我们现在已知事实并非如此，即，在许多无性生殖体中染色体配对是正常的。自从Gustafsson的论述以后，很少有遗传学家提出杂交在无配系群中的作用，此无配系群已超出包括遗传上决定的无性生殖诱因的分类单位的物种形成。已尝试过剖析这一遗传诱因但证明是一项难以对付的任务。
在Gustafsson的论述以前对无性生殖进行了为数不多的遗传分析，并且这些实验缺乏得出特异性结论所需的子代的数量(Asker &Jerling)。不过，它们提示Gustafsson无性生殖是由隐性基因的相互平衡体系造成的。Gustafsson通过引用下列事例维护这种观点(a)其中Parthenium、Poa和Potentilla的胚胎囊形成和孤雌生殖是在独立的遗传控制之下以及(b)Poa、Potentilla和Rubus中两个无性生殖体之间的或无性生殖体和有性亲本之间的杂种可以是有性的也可以是无性生殖的，结果没有明显的型式(暗示许多隐性基因)。在Rubus中，有性F1来自无性生殖亲本，并且这些F1产生低百分率的无性生殖F2，这再次提示多种隐性因素的分离。
另一个产生模棱两可意义的无性生殖研究的领域涉及人工改变无性生殖体倍性的效应。普遍的倾向是，当无性生殖体的倍性人为增加时，无性生殖增强。然而，在Potentilla、Taraxacum、Paspalum、Poa中已发现例外，其中人工诱导的倍性增加导致(a)单倍孤雌生殖，其中减数卵形成和无受精发育，(b)BIII杂交，其中未减数的卵受精，以及(c)性别的完全恢复。单倍体化恢复了无性生殖的Poa的性别。关于这样的模糊意义，Asker & Jerling得出结论“我们解释‘无性生殖破坏’的困难仍然与我们对于其调节的无知相关....”这样的意义不明确性推动Gustafsson推翻了简单的无性生殖遗传性显性模型。他几乎观察不到支持它们的证据并且不被Dryopteris、Hieracium、Hypericum、Potentilla和Sorbus中这样的主张证明。在每一种情况下，Gustafsson提供了发表的主张的合理的替代物。
歪曲的分离比率也阻碍了无性生殖的遗传分析。Dicanthium和Themeda中的某些无性生殖体当在长的日照下生长时倾向于有性，在短的光照下生长时倾向于无性生殖(Asker & Jerling)。不过，在下列的物种进行了得到一致的分离比率的重复研究Panicum(Asker & Jerling)、Tripsacum(O.Leblanc等，用玉米RFLP标记检测玉米-Tripsacum杂种中的无性生殖模式，90理论和应用遗传学1198-1203(1995)(在此引用作为参考)和Brachiaria(Valle & Miles，无性生殖物种育种，在Y.Savidan & J.G.Carman，无性生殖研究进展(FAO，Rome，出版中)(在此引用作为参考)，并且每一个研究提示未减数孢子生殖(细胞学上检测到的)由单个显性等位基因控制。然而，其它最近的研究对这个结论提出了挑战，如，在O.Leblanc等，90理论和应用遗传学1198-1203(1995)研究的Tripsacum接近中的未减数孢子生殖“等位基因”是存在于重组被抑制的大连锁群的一部分，相似的连锁群存在于无性生殖Pennisetum(Grimanelli等，无性生殖研究中的分子遗传学，在Y.Savidan & J.G.Carman，无性生殖研究进展(FAO，Rome，1998)(出版中，在此引用作为参考))中。这些连锁群可以包含未减数孢子生殖所需的多种基因(Grimanelli等，四分孢子状态Tripsacum中二倍性孢子形成无性生殖定位一个基因还是多个基因？，遗传学(1998)(出版中，在此引用作为参考))。
两个研究组目前正试图将无性生殖从Tripsacum渐渗到玉米中，他们都未报道其在含有九个Tripsacum染色体以下的附加系中的表达。在一个小组中，制备了两个含有九个Tripsacum染色体(3X+9)的无性生殖玉米三倍体。细胞遗传学和分子研究表明在每一个株系中的九个Tripsacum染色体也许是相同的(B.Kindiger等，一系列39染色体玉米-Tripsacum回交杂种中的无性生殖评估，36农作物科学1108-13(1996)(在此引用作为参考))。同一小组制备了第三株含有九个Tripsacum染色体(3X+9)的三倍体附加系。然而，这个株系中的许多九个染色体与前面两个株系的九个染色体不同。玉米染色体在三个株系中是相同的。后述的3X+9植物也是无性生殖的，但是无性生殖的频率只有10-15％，前两个株系的频率为95-100％(Sokolov等，发展无性生殖玉米的前景，遗传学优先指导，Russia(1997)(进展报告；在此引用作为参考))。这些数据以及其它尝试使玉米无性生殖的小组的未发表结果(Grimanelli等，无性生殖研究的分子遗传学，在Y.Savidan & J.G.Carman，无性生殖研究进展(FAO，Rome，1998)(出版中))提示了无性生殖遗传性的复合模式。在另外一项研究中，有性的T.dactyloides二倍体与高度无性生殖的T.dactyloides三倍体杂交产生非整倍体。46株F1s中只有三株倾向于未减数孢子生殖(细胞学确定)。然而，这些高度的未减数孢子生殖F1s包含七个或更多的附加染色体(超过了二倍体水平)，并且所有的染色体数目接近二倍体水平的F1s是有性的(Sherman等，二倍体X三倍体Tripsacum dactyloides杂种中的无性生殖，34基因组528-32(1991)(在此引用作为参考))，这提示复合遗传。最后，在人工产生的Tripsacum三倍体中无性生殖和与三个玉米染色体的区域同线的五个Tripsacum连锁群共分离(Blakey等，Tripsacum生育力与DNA标记的共分离，42 Maydica 363-69(1997)(在此引用作为参考))，这进一步使控制无性生殖的简单遗传机制受到怀疑(至少当在试图将无性生殖机制转移到其它物种或同一物种的株系)。可以假设在隐性条件下主要基因(调节或控制基因)能够阻止无性生殖的发生，由此使得无性生殖看上去是处于简单的遗传调控之下。然而，这样的基因属于许多其它的无性生殖表达需要的基因并且它们自身不能赋予其它物种无性生殖(Linnean)。这些研究回顾了如下推断(a)无性生殖需要多个基因，(b)影响兼性的基因可以加性形式起作用，(c)某些Tripsacum染色体比其它对兼性的影响大，以及(d)来自至少三个玉米染色体的等位基因不能在赋予无性生殖方面替代它们Tripsacum的部分同源的(同线的)对应部分。
减数分裂突变体是简单的遗传假说的中心(Linnean)。最近的突变假说提示除非合适的减数分裂突变与合适的多基因诱因联合，无性生殖不会表达(Mogie，植物无性生殖的进化(1992)(在此引用作为参考)，Grimanelli等，无性生殖研究的分子遗传学，在Y.Savidan & J.G.Carman，无性生殖研究进展(FAO，Rome，1998)(出版中))。然而，最近得到的证据表明被认为是突变的等位基因实际上是多基因诱因的一部分而且是边缘生境有性繁殖必需的。以前没有被理解但在此表明的是通过次级接触的差异生态型(种族间的或种间的)的联合使得无性生殖发生(也参见Linnean)。
就前述而言，应当理解，提供制备无性生殖植物的方法将是本领域内有重要意义的进展。
发明简述本发明的目标之一是提供在不使用诱变方法或已经是无性生殖植物的情况下从有性生殖植物制备无性生殖植物的方法。
本发明另外的目的和优点在详述中得到阐明并可通过本发明的实践得到理解。
为了完成前述的目标并与此处所述的发明相一致，本发明提供了从两个或多个相同或相关有性生殖植物制备无性生殖植物的方法。
方法中的一个步骤涉及得到两个有性生殖株系，其雌性生殖表型有差异以使在相同的环境条件下(光照长度、光强度、温度状况，等)两个株系之间的雌性发育时间表有适当程度的不同步性。适当程度的不同步性包括但不局限于下列条件，其中一个株系中大孢子发生开始的时间是另一个株系中胚囊形成的时间，相对于非配子体胚珠和子房组织(珠心、珠被、果皮等)及其它物候因素如光周期调节的花诱导时间。加速株系(经历胚囊发育的株系)将已经完成了花诱导和大孢子发生。
方法的另一个步骤涉及使适当差异有性生殖株系(用标准的染色体加倍技术)成为双倍体，如果它们不能成为多倍体，将这两个有性双倍体株系进行杂交诱导无性生殖。杂交也可在双倍体化之前进行。在这样的情况下，双倍体化涉及标准的有丝分裂纺锤体抑制剂如秋水仙素，或依赖于BIII杂种的形成(未减数卵受精)以产生无性生殖三倍体。另外的方法包括于下述的实施例中。
附图几个观点简述


图1A-M表示了典型类型的有性(受精作用)和无性生殖胚囊发育的模式图(见B.M.Johri等，被子植物比较胚胎学，第1和2卷(Springer-Verlag，1992)；Asker & Jerling)。Polygonum-type发育是标准并且专有地在99％以上的的所有被子植物物种中表达。水平行中的与每一种发育型相关的数字代表阶段特异的基因表达(1)成熟前分裂间期和早减数分裂前期(交换和MMCs在胼胝质中的成膜作用)，(2)减数分裂，(3)大孢子成熟(胼胝体从存活的大孢子上的消化和存活大孢子的最初液泡化)，(4)胚囊发育，(5)双受精和早期胚乳形成，以及(6)胚胎发生(通常在胚乳形成以后开始)。平行行中的数字代表假定的重复基因的非同步表达，其中的成员起源于不同的多倍体基因组或不同的古多倍体中原型的基因组片段。数字中的间隔代表突变(大多数是无效等位基因)和删除。应当注意，间隔在古多倍体多孢子类型中很普遍而在多倍体无性生殖类型最不普遍。某些无效等位基因的形成也许会增强无性生殖体结籽。在发育不同步的多倍体和古多倍体中任意消除基因重复好象代表了新的生殖类型(无性生殖、多孢子现象和多胚性)进化的主要的进化机制(Linnean)。
图2A-B代表了两个可在光照周期反应和制备无性生殖植物生殖时间表中提供充足差异的植物属(A)二倍体有性Antennaria aromatica(Montana中的小三角)，A.Corymbosa(Idaho Montana边界的两个圆圈，一个圆圈在Montana边界附近的Wyoming，一个圆圈在北Colorado)，A.marginata(在New Mexico和Arizona的矩形)，A.media/pulchella(California的星)，A.microphylla(一个圆圈在Albert，一个圆圈在Idaho、Montana和Wyoming的边界附近，一个圆圈在Wyoming的中北部，一个圆圈在Colorado南部)，A.racemosa(一个圆圈在BritishColumbia，两个圆圈在Idaho Montana边界附近和一个圆圈在Wyoming边界附近的Montana)，A.rosulata(在Utah、Colorado、Arizona和New Mexico的星)，A.umbrinella(在Idaho Montana和Wyoming的大三角)，A.friesiana(Alaska的小星)，A.densifoliaA.E.Porsild.(在Yukon的圆圈)，A.monocephala DC.(在Alaska、Yukon和西北Territiries的大星)以及多倍体的无性生殖体A.rosea(小矩形)；(B)二倍体有性Tripsacum bravum Gray(Mexico的大矩形)，T.dactyloides(US的大星)，T.dactyloides var hispidum(Hitchc.)De Wet和Harlan(Mexico的大星)，T.latifolium Hitchc.(Mexico的小矩形)，T.laxumNash(Mexico的大圆圈)，T.maizarHernandez和Randolph(Mexico的三角)，T.manusoroides de Wet和Harlan(接近Mexico海湾的Mexico小星)，T.pilosum Scribner和Merrill(Mexico的小圆圈)以及T.zopilotense Hernandez和Randolph(不接近Mexico海湾的Mexico小星)。二倍体有性T.cundinamarce de Wet和Timothy、T.australe var.australe Cutler和Anderson以及T.dactyloidesvar.meridionale de Wet和Timothy可从Columbia得到(接近北纬15°，西经85°)且不在地图上。
图3以雌蕊长度表示了二倍体(有性的)和四倍体(二倍性孢子形成)T.zopilotense和T.dactyloides的雌蕊发育阶段(减数分裂前或未减数孢子生殖前、减数分裂或未减数孢子生殖，多核胚囊)。雌蕊的长度(mm)为＜0.50、0.50-0.75、0.75-1.00、1.00-1.25、1.25-1.50、1.50-1.75、1.75-2.00、2.00-2.25、2.25-2.50、＞2.5分别是1-10类。应当注意(a)二倍体T.zopilotense比二倍体T.dactyloides更快地通过雌性发育的三个阶段，(b)四倍体开始未减数孢子生殖比二倍体减数分裂开始的早，它们比二倍体通过三个阶段快得多(四倍体不进行减数分裂)以及(c)二倍性孢子形成的T.dactyloides比双倍孢子形成T.zopilotense更快地通过三个阶段(概括于O.Leblanc & Y.Savidan，与无性生殖和性别相关的Tripscaum物种大孢子发生(Poaceae)的时机，8 Polish Botanical Studies 75-81(1994)(在此引用作为参考))。
图4表示了根据大孢子发生(减数分裂或未减数孢子生殖MMCs以及单核大孢子)或胚囊发育(多核胚囊)的阶段，190个有性Elymus scabrus和690个无性生殖的Elymus rectisetus的雌蕊分布，以及相应的花粉发育阶段(1＝PMC减数分裂II和四分孢子；2＝自由小孢子；3＝具有端始芽孢的花粉粒；4＝Ubish小粒形成前的具泡单核花粉；5＝早期Ubish小粒形成至早期内壁加厚；6＝内壁加厚；7＝没有再分的单核花粉；8＝具有深染的单核的花粉；9＝具有弱染的单核的花粉；10＝双核花粉)。在雌性发育阶段内和花粉阶段上的条代表各自的在给定的花粉阶段所采的标本雌蕊总数的累计百分数(累计以前的花粉阶段)。在第三阶段后有性雌蕊中几乎看不到MMCs。因此，在这项分类中的此后条几乎相等。相反，在有性单核大孢子分类中的条从第三阶段到第10阶段长度一直增加，这表明在这些阶段的大多数雌蕊已发展超过了MMCs阶段。在第10阶段，三个有性雌蕊中的两个包含多核胚囊。在无性生殖雌蕊中，双核胚囊首先在具有较大百分数的在第六花粉阶段出现的多核胚囊(＞2)的第三花粉期观察到(从C.F.Crane & J.G.Carman的东澳大利亚和新西兰的ELymus rectisetus的无性生殖机制，74美国植物学杂志477-96(1987)修饰而来)(在此引用作为参考))。
发明详述在本制备无性生殖的植物的方法公开和描述之前，应当理解本发明不限于此处公开的特定的构型、方法步骤和材料因为构型、方法步骤和材料可以有某些改变。同样也应当理解此处应用的术语只用来描述特定的实施方案并不是起限制作用因为本发明的范围只受附加的权利要求和其相当物限制。
应当注意，正如在此说明书和附加的权利要求中所用的，除非上下文中清楚地说明，单数形式“ a”、“an”和“the”包括复数参考。
在描述和要求本发明的权利中，下面的术语将按照下面的定义使用。
历史上，术语无性生殖当用于有花植物时(被子植物)，包括多种形式的营养繁殖。然而，此处的术语无性生殖局限于不将相反性别的未减数卵子的配子(孤雌生殖)联合的常规导致无性生殖的方法。这些方法通常以配子体无性生殖的形式被描述并且涉及破坏正常胚珠发育的异常。相反，双担孢子形成和四孢子状态(此处共同被称为多孢子现象)也破坏正常的胚珠发育，但是形成正常的、减数分裂的需要受精的卵(
图1J-M)。无性生殖和多孢子之间的细胞学相似性最近被确定(美国序号60/037,211；也见Linnean)。这些相似性提示无性生殖和多孢子现象起源的共性。
被子植物中的大孢子发生(雌性减数分裂)发生在大孢子母细胞(MMCs)和正常情况下从四个减数分裂产物(大孢子)之一发育而来的雌性配子(胚囊)。大多数被子植物胚囊是八核(
图1A)并包含一个卵(受精形成胚)、两个助细胞、一个含有两个极核的中央细胞(受精形成胚乳)和三个反足细胞(Polygonum-型胚囊)。每一个核最初是单倍体，来自经过三次顺序的内有丝分裂存活的大孢子的核(
图1A)。无性生殖打破了这个过程，导致了二倍性孢子形成(
图1C-F)或无孢子生殖(
图1G-H)。
在已知的二倍性孢子形成形式的无性生殖中，未减数的胚囊从减数分裂受到破坏的MMC形成的而被早熟胚囊形成取代(
图1C-F)。胚囊形成的完成也是早熟的，经常在受精前未减数的卵进行孤雌生殖形成原胚(如，Linnean)。被称为无孢子生殖形式的无性生殖与二倍性孢子形成相似，只是未减数的胚囊从接近MMC的珠被壁的体细胞形成的(
图1G-H)。在无孢子生殖中，减数分裂的MMC或年幼的有性胚囊败育并且被一个或多个无孢子胚囊取代(Asker & Jerling)，这也倾向于早熟(Linnean；Asker& Jerling)。因此，这些异常是胚囊形成所需的基因的早熟表达的结果，如果不是全部，大部分的无性生殖是兼性有性的，这意味着性别在其进化过程中被保留并偶然表达(Linnean；Asker & Jerling)。
减数核分裂(核分裂)发生但细胞分裂(胞质分裂)不发生的四分孢子状态(
图1I-K；M.T.M.Willemse & J.L.van Went，雌性配子体，在B.M.Johri，被子植物胚胎学159-96(Springer-Verlag，1984)，在此引用作为参考；B.M.Johri等，被子植物比较胚胎学，第1和2卷(Springer-Verlag，1992)(在此引用作为参考))，也归因于MMC的“早熟配子体化”(E.Battaglia，被子植物雌性配子体的进化解释的关键，47 Annali di Botanica 7-144(1989)，在此引用作为参考))。四分孢子和二倍性孢子的MMCs都经历了空泡化，在胚囊形成的开始过程中的存活的有性大孢子中正常发生。这样的空泡化也发生于无孢子生殖的原始细胞(Linnean)。在二倍性孢子形成和四分孢子状态中，胚囊的形成无间断的进行。在正常物种中，大孢子发生和胚囊发育在时间上是分开的，在此期间，在存活的大孢子的壁上的的胼胝质(β，1-3葡聚糖)被分解(Linnean)。
二倍性孢子和四分孢子物种的MMC壁缺乏正常情况在前期包裹单孢子和双孢子物种MMC的(
图1A-B，L-M)并在大孢子发生过程中沉积于对面壁上的胼胝质(Linnean)。这些沉积物在减数分裂后被分解，使得大孢子在胚囊形成的开始快速扩张。二倍性孢子和四分孢子物种中缺乏胼胝质使得MMCs早熟扩张(
图1C-F，I-K)是MMC配子体化的进一步证据(Linnean；E.Battaglia，47 Annali di Botanica 7-144(1989)；M.D.Peel等，无性生殖Buffelgrass、Kentuky Bluegrass、Pennisetumsquamulatum Fresen、Tripsacum L.和Weeping Lovegrass中的大孢子母细胞胼胝质，37农作物科学724-32(1997))。多孢子的形式，同无性生殖的形式一样，来自广泛的多种起源的异常(Linnean)。
多种形式的多胚现象是指每个胚珠中形成一个以上的胚胎(助细胞和反足细胞胚胎、裂生多胚胎现象、不定胚生殖)(Linnean)。同无性生殖和多孢子现象一样，多种形式的多胚现象是多起源的并且涉及时间和空间错位的发育程序。
多源发生和细胞学研究阐明了无性生殖的起源。细胞学比较表明某些无性生殖类型比其它无性生殖类型更类似于异常有性类型，如，Adoxa-型四分孢子(有性的)与Antennaria-型二倍性孢子相同，只是导致四核胚囊的核分裂在四分孢子中是减数分裂而在Antennaria-型二倍性孢子中是有丝分裂(
图1E & 1I)。同样，Ixeris-型二倍性孢子(
图1D)与有性双担孢子(
图1L & 1M)相同，只是前者中没有减数分裂。Ixeris-型二倍性孢子和双担孢子形成(以及无孢子生殖和四分孢子状态)都在Erigeron属中出现。已经分析多源发生数据发现无性生殖和多孢子经常在属和科水平(高度明显的相关性)发生。同样，前细线期染色体凝集和随后被功能大孢子母细胞替代的无功能大孢子母细胞形成在与无性生殖和多孢子物种紧密相关的物种中发生，这也提示了进化的相似机制。
高的染色体基数(X≥10)通常表明古多倍性，这意味着具有或不具有上升或下降非整倍性的二倍化后的多倍性。每个属中的多基数也反映了古多倍性。已经发现所有属的染色体基数80％已确定包含无性生殖的、多孢子的或多胚现象的物种。统计学分析表明多孢子的和多胚现象的物种通常是古多倍体，而通常是多倍体的无性生殖体通常包含原基因组。而且，多孢子而非无性生殖的物种的属在每一属的X值(2.7±0.4SE)比无性生殖而非多孢子的物种的X值(1.7±0.1)多。这意味着无性生殖体倾向于具有平衡的重复基因(原基因组)而多孢子和多胚现象的物种通常具有不平衡的基因(古多倍体基因组，即，由于非整倍性导致的部分重复或三重)。因此，在本发明中表明由繁殖差异的生态型组成的多倍体中(a)平衡基因组(包含完全的繁殖基因)间的相互作用对于某些雌性发育顺序被正常情况下在发育后期发生的发育顺序，如在无性生殖中发生的完全取代是必需的，如，大孢子发生等(b)包含不完全重复的或三重繁殖基因的非平衡“古多倍体基因组”只有在雌性发育顺序被不同步取代或由发育顺序的其它部分如在多孢子、多胚现象、前细线期凝集和MMC取代时重复是必需的，以及(c)无性生殖，与其长期的繁殖稳定性当被古多倍体过程影响时，可能在正常和发育新型的古多倍体有性物种和属进化过程中的跳板(而不是终止端)。
对酵母异核体研究的阐明了可导致无性生殖、多孢子现象和多胚现象的发育机制的类型。当处于G1期的酵母细胞与处于S期的细胞融合时，整个细胞周期阶段被跳过，即，G1期染色体被提前复制。复制起始的频率依赖于异核体中SG1核比率。在与分裂间期细胞融合的有丝分裂的酵母细胞中，分裂间期核(所有阶段)提前进入有丝分裂(B.Lewin，基因V，(Oxford University Press，1994)(在此引用作为参考))。
无性生殖可能以类似的方式发生。如果一个基因组的胚囊发育信号与另一个基因组的大孢子发生信号重叠，减数分裂可能被省略(二倍性孢子形成)或胚囊发育可能会异位(无孢子生殖)。相应地，只有在大孢子发生和胚囊发育的时机(相对于非配子体胚珠和子房组织的发育)的很大差异存在于原型生态型或物种之间时，无性生殖样倾向出现于多倍体(表1)。这样的天然变异体也许只在高度遍生的物种中才通常被发现，即，具有广泛的纬度和生态分布的物种。
表1描述了不同步表达的重复基因如何导致包含两个在雌性发育时间表中时间表达(成花诱导、大孢子形成和配子体发育)差异的基因组的多倍体的二倍性孢子形成和无孢子生殖。由基因组I编码的斜体发育时相因为基因组II的关卡基因提前表达被省略。
表1
通过基因组I中在短的白昼和长的季节中(低纬度)进化的发育信号与的在长的白昼和短的季节(高纬度)进化的基因组II折中起始子房发育。因此，子房发育的起始和速度以与其它在来自形态不同的亲本(叶子长度和宽度、植物高度等)双倍体中观察到的中间表型相似的方式假定一种“中间表型”。1.在第一阶段的开始，基因组II产生减数分裂的提前信号，由于原孢子母细胞还没有形成，所以失败了，即，它以由中间相表型控制的中间速度发育。2.在第二阶段的开始，基因组II的减数分裂终止关卡信号使减数分裂终止并以与在非同步的酵母异核体(在此进行了综述)中观察到的方式相似的方式使基因组I和基因组II同步。如果减数分裂被成功地终止，则出现几种二倍性孢子形成(
图1)之一，即，直接从大孢子母细胞(Antennaria-型二倍性孢子形成)或年幼的雌性性母细胞(Taraxacum或Ixeris-型二倍性孢子形成)形成胚囊。如果减数分裂未被成功的终止，可能发生无孢子生殖(
图1)，即，从临近的珠心细胞形成一个或多个胚囊。这主要出现于包含多个或不明确的颈卵细胞的物种中。在无孢子生殖和二倍性孢子形成中，发育了遗传上未减数的胚囊。非配子体胚珠或子房的组织按照中间-表型(延迟的)时间表继续发生。相反，配子体(胚囊)的发育继续提前因为基因组I的胚囊发育基因(只在胚囊内)与基因组II的胚囊发育基因同步。3.来自两个同步基因组的信号诱导卵形成及孤雌生殖，相对于胚珠和子房的非配子体组织的发育而言，它们在大多数无性生殖体中提前发生。4.授粉按照中间表型时间表发生，但卵不再是接受的而是在大多数情况下已经分裂。中央细胞如果不是自主的，则被受精，并且胚乳和孤雌生殖胚胎得以发育。
这种重复基因不同步性假设在初级水平上解释了表现出生殖异常物种的许多基因组的独特性以及在无性生殖记录中的许多不一致性。例如，无性生殖、多孢子现象和多胚现象是罕见的但倾向于在遍生的科中同时出现因为繁殖开始的时间有足够的生态型变异等，在大多数科中罕见但在遍生的科中比较多见。在无性生殖体和多孢子物种(Linnean)的无性生殖中兼性出现单孢子Polysporic型的有性繁殖，因为除了删除和突变以外，每一个亲本基因组包含正常繁殖所需的基因，而且生长条件可能会有时更利于导致有性发育发生的基因组外的一个基因组的表达，如在Dicanthium、Themeda及无数其它无性生殖体中发生的。兼性受到下列两个因素的影响(a)由遗传背景差异导致的基因组差别沉默，或(b)通过加快或减慢一个基因组(光周期或温度反应)相对于另一个基因组中基因表达降低不同步程度的环境因素，这样导致性发育发生。由某些关卡系统缺失的整体不平衡基因组的竞争表达导致的(不完全的繁殖基因系列)多孢子现象或多胚现象。相反，无性生殖中的通常包含平衡的繁殖基因系列的基因组竞争性表达被关卡基因终止，这样使得平稳地过度到无性生殖(表1)。无性生殖体中的两个亲本基因组中的至少一个必需具有充足的DNA以延伸繁殖发育的持续时间(减数分裂持续时间等)以使表达充分不同步性。因此，在含有很少量DNA和快速减数分裂的一年生植物中很少出现无性生殖。同样，多元多倍性可消除导致逆转回性别的不同步性。无性生殖在远交物种中比在近交物种中普遍的多，因为当次级接触发生时它们更易于形成生态型间或种间多倍体，如，在频率较高的与更新世八次大的冰川作用或众多小冰川作用相关的气候漂移(L.A.Frakes等，沙面动物的气候模式(Cambrige University Press，1992)(在此引用作为参考))。同样，更多的无性生殖体是异源多倍体而不是同源多倍体，因为通过BIII杂种形成通常对于雌性发育的不同基因组的不同步表达至关重要的多倍体化(Linnean)，在种间杂种中比在种族间杂种中发生频率更高。同样，在大多数不育生态型间或种间一年生植物F1杂种发生BIII杂种形成的机率比连续多年开花的多年生植物低。这个因素进一步限制了一年生植物成为无性生殖的机率并且进一步解释了自然发生的无性生殖的一年生植物发生机率低。最后，当无性生殖体与有性生殖植物体或另一个无性生殖体杂交时，不论杂交是近交还是远交，可以预料后代的性别模棱两可。后代中表现出的繁殖方式将依赖于添加或去掉的基因组如何影响不同步性，如果事先不知道由参与的基因组编码的雌性发育时间表，这一点很难预测(Linnean)。重复基因不同步性假设能够充分解释这些被认为是无性生殖记录中主要的不一致现象的能力是其有效性的强有力的证据。
许多无性生殖体的分布型式表明更新世起源(G.L.Stebbins，高等植物的染色体进化(Addison-Wesley，1971)(在此引用作为参考)；Asker& Jerling)，即，许多无性生殖体的地理分布和多样性中心以更新世冰川的边缘为中心，但是它们的范围常常覆盖位于冰川边缘的北部和南部的假定的有性祖先生态边缘。八个大的覆盖了20％地球表面的冰川在更新世发生。它们被每次持续数千年至100000年的温暖的冰川间时期分开。同样，大多数的冰川事件是由被持续数千年的小的的冰川间时期打断的冰川组成(L.A.Frakes等，沙面动物的气候模式(Cambrige UniversityPress，1992)。因此，在更新世中，北美和Eurasia的北部纬度重复地进行去冰川化，被能够适应冷气候、长的光照和短的生长季节的遍生性分类群再植被。
在年幼的胚珠中的早熟的减数分裂和胚囊发育是对高纬度地区短夏季的适应。跟随着冰川间时期的冰川发展使低纬度变冷允许高纬度的植物区系进入低纬度的植物区系。这给具有假定的早熟雌性发育的生态型(从高纬度，即，温带气候到北极气候)提供了许多机会形成具有假定的延迟的雌性发育(从低纬度，即，热带气候到温带气候)的多倍体生态型(或不同的物种)。这样的多倍体表现出不同步性雌性发育，即，无性生殖。
对高和低纬度的另一类适应包括在季节变化中对特定的光周期变化做出开花反应。许多植物根据它们对光周期的反应进行分类，如，“长日照植物”适应于高纬度，春天和初夏当日照长时开花，“短日照植物”通常存在于低纬度(热带)在热带“冬天”日照短的时候开花，“双重性日长植物”要求短的或长的日照诱导繁殖芽形成，然后分别是长或短的日照，以使形成的芽成熟成为花，“中日性植物”在日照太长或太短的情况下都不会开花，“日中性植物”是指几乎不适应日照长度，在广泛的日照日照长度下发生的开花诱导。也存在几个特定的其它类别(Salisbury &Ross，植物生理学(1992)(在此引用作为参考))。
Salisbury和Ross从迄今研究的对不同光周期开花反应的约300个植物物种中选择了85个。这85个物种清楚地代表了上述的特定的光周期反应类别，这85个物种清楚地代表了67个属。在此应当注意(首次)这些属的33％(67个中的22个)包含具有雌性繁殖异常的物种(配子体无性生殖、多孢子或多胚现象；将Salisbury和Ross表23-1与Linnean的附录比较)。如果繁殖异常不依赖于对不同的纬度的适应，可以预料属的数目增加了9倍，即，只有3.8％的属表达繁殖异常。因此，繁殖异常的发生不依赖于对光周期不同的适应，那么仅有3.8％(而不是33％)的属确定为包含具有不同的光周期适应的物种也应表现繁殖异常。33％分为12％包含配子体无性生殖(与所有的被子植物属的1％相比，即，增加了12倍)，13％包含多孢子的物种(与所有的被子植物属的1.6％相比，即，增加了8倍)，7.5％包含多胚现象的物种(与所有的被子植物属的1.7％相比，即，增加了4.4倍)。在包含表达繁殖异常的植物的属和包含对光周期(不同的纬度)表达不同适应性的植物的属之间的高度明显的相关性被用作重复基因不同步性的附加证据。据认为包含这些特征(明显不同的光周期反应和明显不同的雌性发育时间和速度)差异的多种生态型基因组的双倍体是无性生殖的，其原因为不同步的雌性发育导致未减数胚囊的形成及随后的孤雌生殖(表1)。
如上所述，本发明中的发现很大程度上使尝试将无性生殖转化成有性物种或通过突变诱导其从头表达的科学家依赖的重要假说无效。渐渗方法的(与无性生殖相关物进行远缘杂交)重要的假设是无性生殖是由一个或多个“无性生殖基因”控制并且这些基因能够在其它物种适当地发挥功能。重复基因不同步性假说认为无性生殖是由在种族间(生态型间)或种间基因组重复并控制子房中整个雌性发育顺序(MMC分化、减数分裂、大配子体发育、胚胎发生)的基因系列的不同步(重叠)引起的。因此，只要特定起、差异基因组的基因系列的相互作用将导致适当程度的不同步性并诱导无性生殖。这样的特异性在物种间是不同的，即，在一个物种中诱导无性生殖的基因盒也许在另一个物种中不能恰当地发挥功能诱导无性生殖。而且，在一个光周期反应和雌性发育顺序对于时机是平均的(可能是绝大多数物种)而又没有用提供恰当程度的不同步性的两个差异的基因盒替代(通过植物育种和遗传工程)其现有的编码时间平均的光周期反应和雌性发育顺序的雌性繁殖基因盒的特定物种中不可能诱导无性生殖。也许有人认为一个或多个主基因控制这些顺序的时机，只有需要的主基因被转移，即，一个基因组的主基因可控制另一个基因组的基因盒。然而，正如Wilson，形态和生理形状育种，在K.J.Frey(编辑)，植物育种II(Iowa State University Press，1981)(在此引用作为参考)指出的，光周期反应是数量性状。而且，系统发生数据表明当基因盒被古多倍体化方法打成片段时，无性生殖丢失。因此，尽管可以通过远缘杂交和回交将无性生殖从远缘物种转移至农作物物种，但可预料以前未想到的和理解甚少的困难，包括需要从一个以上的染色体上转移许多基因。
突变育种方法的主要假设是无性生殖是单基因或接近单基因的性状。在缺乏基因组间不同步性时，可以预料只有模仿负责许多无性生殖不同步相互作用(所有的通过孤雌生殖的来自未减数胚囊形成细胞反应)部分的突变。难以想象，诱导无性生殖样繁殖行为突变的积累不会给其它细胞的、繁殖的或整个植物过程带来有害的影响。不同步性假说预测突变方法将会遇到重大的困难。
有性生殖植物杂交方法(A.Ernst，Bastardierung als Ursache derApogamie im Pflanzenreich，Fischer，Jena(1918))的主要假设是无性生殖起源于远缘杂交和双倍体化后的生育力恢复机制。人们已经制备了数千种远缘杂种和双倍体，但是只有在个别的后代中观察到了无性生殖(Asker & Jerling；Linnean)。不同步性假说解释这种观察结果的原因是诱导无性生殖所需的很大程度的不同步性在自然中很难观察到。自然中这种稀有事件的例子是在Rosaceae、Asteraceae、Poaceae和其它科中的新无性生殖体的进化和放射，这些科在更新世冰川作用中，当总同一物种体不同的生态型或紧密相关的物种被气候漂移多次带到一起时，它们经历了杂交并随后形成了种族间或种间无性生殖多倍体。因此，无性生殖只是以很低的百分数随机的在人造的远缘杂种或双倍体中出现。相反，不同步性假说预测从恰当选择的或培育的亲本生态型或株系(基于细胞学上观察到的光周期反应和雌性发育时机时间差异的育种和选择)发展而来的双倍体将是无性生殖的。
此处描述的本发明依赖于特定的技术的联合，这种联合演绎地，明确地确定当生殖质通过杂交或双倍体化联合时可导致配子体无性生殖表达。当联合为多倍体时，赋予无性生殖的有性生殖质的特定联合的演绎地确定(通过赋予光周期反应的不同步性和其它形式的雌性繁殖时机)使与本发明区别于现有技术。
本发明不依赖于将在不同的分类群(基因组)中恰当表达的无性生殖基因的存在。事实上，本发明依赖于这种基因不存在的观念。本发明不依赖于当突变时将诱导无性生殖等位基因的存在。再者，本发明依赖的观念是这样的等位基因当突变时会表达有害的多效性而且不会产生需要的无性生殖形式。本发明不依赖于随机的或以前产生的可能表达也可能不表达无性生殖远源杂种。相反，本发明演绎地确定了当杂交或联合时产生无性生殖的家系或基因盒。此处所列的基础观念和实践与其它以前想到的或目前世界上使用的产生无性生殖体的方法有着根本不同。
其他人提出利用分子标记帮助的无性生殖基因渐渗从与农作物物种相关的野生型无性生殖体制备无性生殖植物。此处综述的数据暗示这样的标记应用有限，因为他们定位的基因将只有当其它的很多基因同时被转移时才会赋予无性生殖，这将大大地减低农作物的农学可取性。这些无性生殖转移程序具有与普遍的“无性生殖基因”或普遍的“无性生殖基因盒”确定和成为专利一样长期的目标。正如在此处所认为的，在包含两个具有不同的雌性发育时间表的基因组的多倍体物种中负责赋予无性生殖的一个基因组内的基因只有当受体物种包含的基因组在编码雌性发育时间表的供体基因组恰当差异是，此基因才会在赋予其它物种或生态型无性生殖。来自一个基因组的普遍赋予无性生殖的基因盒也许不存在。
本发明的目标是针对从典型的经历正常有性繁殖的植物制备配子体无性生殖体(表达无孢子生殖或双二倍性孢子形成的植物)的方法。
本发明特别是针对通过杂交和双倍体化联合两个或多个相同或紧密有亲缘关系的物种的有性生殖植物制备配子体无性生殖体，这些有性生殖植物的区别在于相对于(a)植物生长的环境条件(光周期反应等)，以及(b)植物中总的发育事件如胚珠起始、内果皮生长和发育以及雌蕊长度和宽度，大孢子发生的时间和或持续时间、大配子体发生(胚囊形成)、传粉、受精和胚胎发生。
本发明也针对在用于制备无性生殖体的双倍体的两个或多个有性物种中所需的雌性发育时间表不同步性的量。
本发明也针对用于在最初不表达需要的雌性发育时间表的有性生殖株系中产生希望的雌性发育时间表(繁殖不同步性)差异的选择压力和育种计划。
很方便将本发明分成的方法分成四类(a)选择或制备适用于从有性生殖植物产生无性生殖植物的有性生殖质，(b)杂交方法，(c)双倍体化方法，以及(d)证实无性生殖表达的程序。
选择和培育用于产生无性生殖体的有性生殖质本发明的一个特征是加速刺激自然中负责从有性生殖植物进化为无性生殖的过程。自然过程需要数万年，即，它需要导致分开数千年的植物群落重新联合的(并且适应于不同的气候和光周期)冰川的进展。在本发明中，整个过程的持续时间从数万年降至数年。
从有性生殖植物选择适用于产生无性生殖植物的生殖质的优选的方法涉及确定同一物种或紧密有亲缘关系的物种的、包含光周期上适应于广泛差异纬度(长日照植物、短日照植物、日中性植物等，Salisbury &Ross，植物生理学(1992))生态型的植物。许多这样的“遍生”分类群存在于Poaceae、Asteraceae和Rosaceae(Linnean；见实施例，下文)。生殖质群的选择使它们代表极端(a)生态型起源的纬度，(b)对不同的光周期有开花反应，以及(c)相对于非配子体胚珠和子房组织的大孢子发生、大配子体发生和胚胎时机。
当在目前可得到的变种或株系中如果不存在合适程度的雌性发育时间表差异，则植物育种是从有性生殖植物得到制备无性生殖植物的生殖质的优选方法的必需的部分。优选的方法包括(a)确定几个或更多的适应于高纬度的变种或生态型以及几个或更多的适应于低纬度的相同的或紧密相关的变种或生态型，(b)将两个纬度适应类别的每一个内的变种杂交，(c)根据对不同的光周期处理开花反应差异程度以及大孢子发生、大配子体发生和胚胎时机，从F1s中选择生殖质，以及(d)用常规的育种方案(如，混合选择、单种子后代)，继续对每一个性状进行选择。对于本领域的技术人员，这些方法众所周知，如，Poehlman，Breedingfield Crops(Van Nostrand Reinhold，1987)(在此引用作为参考)。
杂交方法如果所选的物种是雌雄异株的或可自交的、具有短的幼年期和分别易于进行根尖和胚珠的细胞遗传学和胚胎学分析，杂交和双倍体化过程将加快。如果植物不是雌雄异株的或可自交的，必需使用雄性不育株系或进行去雄过程。当表现合适程度的光周期反应差异和雌性发育时间表的差异时，有性变种或株系的杂种就产生了。按照植物育种教科书中所教授的标准方法制备了种间杂种，如，Poehlman，Breeding Field Crops(1987)。如最近的涉及远缘杂交的参考中所述，如，Z.W.Liu等，小麦(Triticum aestivum L.)和无性生殖Australian Wheatgrass(Elymusrectisetus(Nees in Lehm.)A.Love & Connor]核型和基因组分析，89理论和应用遗传学599-605(1994)(在此引用作为参考)杂交和回交后代种间或属间杂种的成功制备可能需要激素处理小花和胚胎拯救程序。通过其中间表型证实杂种。
双倍体化方法标准的秋水仙素技术可使染色体数目加倍，如，J.Torabinejad等，Elymus scabrus种间杂种的形态和基因组分析，29基因组150-55(1987)(在此引用作为参考)。选择性地，可采用最近发展的组织培养技术，如，O.Leblanc等，Tripsacum中的染色体加倍人工的、有性的四倍体植物的制备，114植物育种226-230(1995)(在此引用作为参考)；Salon &Earle，Eastern Gamegrass合成四倍体的繁殖方式的确定，Agron.Abs.114页(1994)(在此引用作为参考)；Cohen & Yao，九株Zantedeschia栽培种的体外染色体加倍，47植物细胞、组织、器官培养43-49(1996)(在此引用作为参考)；以及Chalak & Legave，Oryzalin与不定再生联合用于三倍体Kiwifruit有效的染色体加倍，16植物细胞繁殖97-100(1996)(在此引用作为参考)。当种间F1s回交时，部分双倍体2n+nBIII杂种经常以低的机率产生(0.5％--3％)，如，Z.W.Liu等，89理论和应用遗传学599-605(1994)，如果无性生殖(未减数分裂卵的形成)的倾向存在的话，这个机率可能会高的多，如，O.Leblanc等，玉米-Tripsacum多元单倍体植物的繁殖行为涉及无性生殖转移到玉米中，87遗传学杂志108-111(1996)(在此引用作为参考)。因此，种内和种间杂种染色体加倍的优选的方法是一次或多次上面所列的秋水仙素(或其它已知的纺锤体抑制剂)处理方法。同样，种间杂种染色体加倍的优选的方法包括与有性亲本之一和计数根尖中染色体的数目以确定部分双倍体(通常为三倍体)。然后与另一个亲本回交以得到完全的双倍体或与同一个亲本回交以得到部分二倍体(三个基因组来自一个亲本，一个基因组来自另一个亲本)。双倍体化可在杂交之前或在杂交之后进行。
证实无性生殖表达的程序无性生殖在人工双倍体中的表达通过按照J.G.Carman & S.L.Hatch，Schizachyrium PoaceaeAndropogoneae中的无孢子生殖的无性生殖，22农作物科学1252-55(1982)(在此引用作为参考)分析大孢子发生和胚囊发育以分析无孢子生殖的无性生殖，按照C.F.Crane &J.G.Carman，74美国植物学杂志477-96(1987)(在此引用作为参考)分析二倍性孢子形成无性生殖。子代分析也是有用的，按照Asker &Jerling讲述的进行。
本发明的某些特征可通过参照特定的实施例更好地被理解。应当理解下面的实施例是解释性的而不是限制性的，它们是被用来说明本发明的基本的教义和观念而不是限制本发明。期望本领域的技术人员能够运用实施例中和此处其它包含的信息以将本发明在此处没有特别描述的情况下使用。
实施例1选择和收集生殖质——双子叶植物本发明的一个特征是提供了从一个物种中或一个由紧密相关的物种组成的群体中选择和收集最合适的株系以产生无性生殖植物的方法。这些方法被认为模拟并大大加速了起始从有性生殖植物到无性生殖植物进化的自然过程，即，那些导致在适应了大大差异的气候和光周期的分类群中发生次级接触的自然过程。
在此实施例中，详细解释了用于双子叶植物亚纲的优选的方法。在实施例2中，详细解释了用于单子叶植物亚纲的优选的方法。双子叶植物实施例包含了来自Antennaria属(X＝14)的有性物种。期望本领域的普通技术人员能够成功地将此方法运用于许多物种，包括各种双子叶农作物，如，草莓、Raphanobrassica、土豆、樱桃、苹果和甜菜。
目前选择合适给定的物种或紧密有亲缘关系的物种群中的株系的优选的方法开始是(a)从记录中和/或从田间研究中确定地理分布，和(b)收集所有的有关花生物学的信息(光周期反应、胚胎学等)以及各种生态型的任何适应特别在纬度极端的生态型。例如，双子叶植物Antennaria属包含33个有性物种(大多数为二倍体，有一些是四倍体)和5个大的高度多态性的多倍体无配系群(无性生殖)。它们是双子叶的、草本、多年生并且通常具匍匐茎。Antennaria无性生殖通常在六个地域之一自然地发生，Catepes，包含有性二倍体(2X)及从4X至12X的有性的和无性生殖的多倍体。这个种群的所有成员都具匍匐茎并且性别上是二态性的(Bayer，Antennaria gaertner(AsteraceaeInuleae)的种系重建，68 Canad.J.Bot 1389-97(1990)(在此引用作为参考)；Bayer，以Antennaria(Asteraceae)为例多倍体无配系群的进化，132 OperaBotanica 53-65(1996)(在此引用作为参考))。
广泛的生态型的、形态和遗传研究表明Catepes的5个无配系群，A.alpina(L.)Gaertn、A.howellii E.L.Greene、A.parlinii Fern.、A.parvifolia Nutt.和A.rosea从有性物种进化而来。例如，A.rosea无配系群多样性的中心是北美西部的Rocky Mountain(接近冰川边缘)，它的范围从New Mexico和California南部，西至Alaska和NorthwestTerritories，东部穿过Alberta、Saskatchewan、Great Lakes北部，在Atlantic Canada有非连续的群体。这些有性物种具认为参与了A.rosea的最初进化，其随后的扩张包括A.aromatica Evert，A.corymbosaE.Nelson，A.pulchella E.Greene，A.marginata E.Greene，A.microphylla Rydb.(Bayer，132 Opera Botanica 53-65(1996))。
A.rosea无性生殖的有性相关物符合此处所列的从有性生殖植物制备无性生殖植物的地理和繁殖标准。它们具有非常广泛的纬度分布并且在开花时间上有差异，已经注意到，如，某些无性生殖形式开花比附近的有性形式晚三个周(G.L.Stebbins，94 Bot.Gaz.322-45(1932))。最后，Antennaria物种很容易栽培生长、很容易进行种间杂交(由于缺乏内部繁殖分离机制)并且当被春化时，每年能够产生的两代种子。
Antennaria的无性系分株是从能够提供代表纬度极端和纬度中间点、生态的和形态多样性的植物材料的位点收集的(图2A)。在花期进行收集(对于低纬度，是6月；对于高纬度，是7月)，这时物种能够被证实并且杂交所需的雄性和雌性植物能够被鉴定。收集行程的准备和执行包括学习蜡叶凭证标本和得到收集许可。克隆的根被洗净然后被包在潮湿的泥炭藓中。插条在标准的盆栽混合物中进行盆栽并在扎根过程中弄湿。应当理解收集和扎根对于不同的双子叶植物可能会有些不同。
实施例2选择和收集生殖质——单子叶植物在此实施例中，详细解释了从单子叶植物亚纲选择和收集生殖质的方法。这个单子叶植物实施例包含了来自Tripsacum属(X＝18)的有性物种。期望本领域的普通技术人员能够成功地将此方法运用于许多物种，包括各种单子叶农作物，如，高粱、小麦、大麦、水稻和玉米。
本实施例涉及单子叶植物Tripsacum属，它是新世界特有的，生存于42°N-24°N纬度(de Wet等，Tripsacum dactyloides(Gramineae)的系统学，69美国植物学杂志1251-57(1982)(在此引用作为参考)，从0-2600米海拔高度(Berthaud等，Tripsacum多样性和保守性在Taba，玉米遗传资源(CIMMYT，1995)(在此引用作为参考))。雌雄同株的多年生草本植物，雄花和雌花沿着穗状花序彼此分开。在许多无配系群中典型的是，关键特征的变异在16个物种中有重叠，这很难将它们区分为确定的个体。T.dactyloides无配系群是此属中最多样的。它的范围覆盖了整个属的范围，两个性别的二倍体和无性生殖多倍体各处都有分布(de Wet等，69美国植物学杂志1251-57(1982)；Berthaud等，Tripsacum多样性和保守性在Taba，玉米遗传资源(CIMMYT，1995))。
Tripsacum二倍体是有性的，并且所有的在胚胎学上研究过的自然发生的是无性生殖体(Burson等，Eastern Gamagrass的无性生殖和性别，30农作物科学86-89(1990)(在此引用作为参考)；O.Leblanc等，几个Tripsacum(Poaceae)物种的大孢子发生和大配子体发生，82美国植物学杂志57-63(1995)(在此引用作为参考))。这与Antennaria不同，后者的同源四倍体自然发生。最近，通过秋水仙素使适应于温带北美气候二倍体的加倍制备了有性的Tripsacum双倍体(Salon & Earle，Eastern Gamegrass合成四倍体的繁殖方式的确定，Agron.Abs.114页(1994)；Salon & Pardee，Eastern Gamegrass SG4X-1生殖质的登记，36农作物科学1426(1996)(在此引用作为参考))，通过与适应于热带Mesoamerican气候的二倍体杂交，然后进行秋水仙素加倍(O.Leblanc等，Tripsacum中的染色体加倍人工的、有性的四倍体植物的制备，114植物育种226-230(1995)(在此引用作为参考))。
有性的Tripsacum二倍体(和人工有性双倍体)符合此处所列的从有性生殖植物制备无性生殖植物的地理和繁殖标准。它们具有非常广泛的地理分布并且有性的生态型遍布各地(图2B)。这些生态型很容易栽培生长、很容易进行杂交。它们的胚珠通过干扰差和荧光显微镜技术被检查并且在雌性发育时间表中存在生态型变异(图3)。最后，热带生态型整年保持绿色并且在短日照条件下(10-12小时/天)晚秋或早冬开花。相反，温带生态型需要春化作用，随后是长日照(14-16小时)。热带和温带生态型在特定的刺激重复前不会再开花。
Tripsacum的无性系分株是从能够提供代表纬度极端和纬度中间点、生态的和形态多样性的植物材料的位点收集的，如，图2B。在花期进行收集(对于高纬度，是6月和7月；对于低纬度，是9月和10月)，这时物种能够被证实并且从美国和墨西哥活的苗圃中得到(CIMMYT)。收集Tripsacum生殖质的准备和执行与Antennaria的相同(实施例1)。应当理解收集和扎根对于不同的单子叶植物可能会有些不同。
实施例3不同光周期对开花影响的定量本发明的特征之一是提供对被选为最合适的用于制备无性生殖植物(实施例1和2)的有性生殖株系对不同的光周期的花的发育的影响进行定量的方法。应当理解在最近的文献中公布了许多确定这种影响的数量的方法，本领域的技术人员会发现此处描述的方法以外的方法更适用于某些物种。
目前的优选的对在温带气候(中等纬度)至高山气候(高纬度)是天然的Antennaria物种的光热反应定量的方法是从对Oxyria digyna传统的研究修饰而来(Mooney和Billings，Oxyria digyna北极和高山种群的比较生理生态学，31 Eco Monog.1-29(1961)(在此引用作为参考))。从被确定为最合适的用于制备无性生殖植物(实施例1)的生态型选择了一系列生态型(每一个含12个克隆)，即，它们代表纬度极端和纬度中间点。开花后第六周时，每一个生态型的四个克隆被放置在温度设为4℃(恒定的)春化作用生长室中及6个小时的光周期(弱光)。四周以后，每一个生态型的另外四个克隆被放置在春化作用生长室中，然后在第八周时，进行第三系列的实验。
在第12周时，将所有的克隆从春化作用生长室中取出，提供了三组不同的春化作用暴露时间(4、8和12周)。每一种生态型的、每一个暴露时间组的四个克隆随机分到两个花诱导光周期(12和14小时)每一个设置为22/12℃日照/黑暗温度方案。测定所有克隆从春化作用结束到芽形成、原孢子形成、大孢子发生、大配子体发生和开花(因变量)的时间间隔。对每一个因变量进行方差分析并作为重复(每一生态型分析两次)的析因实验(3X2X生态型的数目)进行分析。群分析(Sneath & Sokal，数值分类法数值分类的原理和实践(1973)(在此引用作为参考))被用于将表现出相似的雌性发育(用物候的、细胞学的和光热数据)的生态型划成一组，结果用于预测当人工双倍体分别在繁殖差异的生态型或繁殖相似的生态型之间形成时，是非同步的(无性生殖)或同步的(正常)雌性发育(表1)。
实施例4不同光周期对开花影响的定量目前的优选的对在热带气候(低纬度)至温带气候(中等纬度)是天然的Tripsacum物种的光热反应定量的方法与用于Antennaria的不同(实施例3)。热带生态型整年保持绿色并且在短日照条件下(10-12小时/天)晚秋或早冬开花。相反，温带生态型需要春化作用，随后是长日照(14-16小时)。热带和温带生态型在特定的刺激重复前不会再开花。本发明优选的方法利用了这些区别。选择了一系列生态型(每一个含16个克隆)以代表纬度极端、纬度中间点以及其它的明显的雌性发育差异形式。诱导每一生态型开花，随后开花停止后，在非诱导条件下(13小时光周期，30/25℃日照/黑暗温度)被保持至少6周。然后，每一个生态型的四个克隆被放置在温度设为6℃(恒定的)春化作用生长室中及13个小时的光周期(弱光)。四周以后，每一个生态型的另外四个克隆被放置在春化作用生长室中，然后在第八周时，进行第三系列的实验。在第12周时，将所有的克隆从春化作用生长室中取出，提供了三组不同的春化作用暴露时间(0、4、8和12周)。
春化作用结束后，每一种生态型的、每一个暴露时间组的四个克隆随机分到两个花诱导处理组合中(每个中有两个克隆)，每一组合由光周期确定(10和16小时)每一个设置为30/25℃日照/黑暗温度方案。测定所有克隆从春化作用结束到芽形成、抽苔、原孢子形成、大孢子发生、大配子体发生和开花(因变量)的时间间隔。对每一个因变量进行方差分析并作为重复(每一生态型分析两次)的析因实验(4X2X生态型的数目)进行分析。群分析被用于将表现出相似的物候的、细胞学的和光热特征的生态型划成一组，如同在Antennaria实施例中所用的，结果用于预测当人工制备生态型间双倍体时是无性生殖样或正常发育(表1)。
实施例5对雌性发育时间表中的差异进行定量本发明的一个特征是提供了雌性发育时间表中的生态性间的差异进行定量的方法。目前优选的可用于双子叶植物(如Antennaria)和单子叶植物(如Tripsacum)的方法联合运用无损伤测量和破坏取样，以测定花芽形成、原孢子形成、大孢子发生、大配子体发生、开花、受精和早期胚胎发育(2-16细胞阶段)时间间隔。这些信息可以在实施例1和2所选的生态型，即，那些代选了纬度和其他生态极端的生态型在统一的条件下生长后得到。实施例3-5中收集的数据是用同一套植物同时得到的。
对雌性减数分裂前期、二分体、四分体和退化大孢子阶段以及1、2、4和8核胚囊阶段进行了细胞学分析，在分析每一个胚珠后得到下列数据减数分裂或胚囊发育阶段，雌蕊长度和宽度、内珠被和外珠被长度、性母细胞或胚囊长度和宽度。按照下列参考中的方法C.F.Crane &J.G.Crman(74美国植物学杂志477-96(1987))，J.G.Crman等，两个六倍体Australian Elymus物种减数分裂和无性生殖大孢子发生中细胞壁的比较组织学，31农作物科学，1527-32(1991)(在此引用作为参考)；M.D.Peel等，37农作物科学724-32(1997)(在此引用作为参考)；以及M.D.Peel等，在小麦和无性生殖体Elumus rectisetus(Nees inLehm.)杂种的减数分裂异常A.Love&Connor，37农作物科学，717-23，(1997)(在此引用作为参考)，用于细胞学分析的雌蕊被杀死，固定、透明、观察和测量。发育阶段数据对(a)雌蕊和珠被长度和宽度(原始数据)和(b)表示为其成熟长度和宽度的百分数的结构的长度和宽度(在柱头伸出时测量)。通过方差分析生态型雌性发育时间表的相似性，以及在图3和4及表2后产生后分析图解分布，用实施例3和4的聚簇分析预测人工无性生殖样或正常发育产生的生态型双倍体(表1)。
表2表示了用Normurski干扰差显微镜通过分析透明的胚珠确定有性(二倍体)及二倍性孢子形成(多倍体)Tripsacum的雌蕊长度和雌蕊发育阶段的关系。
表2
，(a)对不同光周期开花反应和(b)雌性发育时间表中的足够的差异将不会在许多遍生物种的现存的生态型中表达，即使通过育种它们的原基因库中存在有足够的遗传变异性以建立这样的差异，即，在某一遍生性物种内作为整体。本发明的特征之一是提供提高这种差异的育种指导。正如D.Wilson，形态和生理性状的育种在K.J.Frey(编辑)，植物育种II(Iowa State university Press)(1981)(在此引用作为参考)指出的，许多形态和生理性状，包括对光照长度的开花反应也是数量遗传的，这意味着它们受多个基因影响。因此，通过对已经表现出某些这一性状的株系杂交，并从其子代中选择表现出更大倾向的株系，已经在提高日照长度方面得到了许多进步，其中期望植物通过开花做出反应。重复这个过程几代，可期望得到更大的进展。以同样的方式通过对已经表现出某些这一性状的株系杂交并采用相似的重复选择和育种方案，可在通过开花做出反应的植物的日照长度明显降低。目前优选的通过这样的育种计划方案可得到最大差异的性状包括(a)对不同光周期的开花反应，即，产生长和短日照生态型，和(b)相对于非配子体胚珠和子房组织的发育，加快或延迟的原孢子形成起始、减数分裂、胚囊发育等。
应当理解，花的发育中足够的差异将通常不会在许多非遍生物种的现存的生态型中表达，即使通过育种它们的二级和三级基因库中存在有足够的遗传变异性以建立这样的差异，即，在同一属、族或科内。可以认为远缘杂交甚至通过基因工程可在将来用于将靶物种基因整合以得到(a)合适的开花反应和(b)在雌性发育时间表中合适的差异。
实施例7从花发育有差异的有性生殖株系制备无性生殖植物实施例1至6中的技术被用指导以得到同一物种(或紧密相关的物种群)三个或更多的品种，明显适应于长光照(14-20小时)，具有相对于非配子体胚珠和子房组织(珠心、珠被、果皮等)的发育，早期原孢子发育/早期减数分裂/早期配子体发育。同一技术被用指导以得到同一物种(或紧密相关的物种群)三个或更多的品种，明显适应于短光照(10-12小时)，具有相对于非配子体胚珠和子房组织(珠心、珠被、果皮等)的发育，晚期原孢子发育/晚期减数分裂/晚期配子体发育。每一类别(长日照植物和短日照植物等)的几个株系被选择以使它们形成关于开花被诱导的光照长度的连续体，即，有一些长、长和很长及有一些短、短和很短。这些株系被选择，其中胚囊形成的起始(退化大孢子阶段)在一系列株系中(通常为长光照适应株系)的时间大约是另一系列株系中相对于非配子体胚珠和子房组织发育的雌性减数分裂前期至中期发生的时间。
然后用上述标准方法(秋水仙素诱导或通过重复的BIII杂种的产生)和其它合适的方法制备双倍体。标准的杂交方法被用于制备Tripsacum物种的杂种。对于Antennaria，通过将授粉袋(从实验室组织制备，如KIMWIPES)放在整个capitulescence上，分离雌性植物。通过在开花期一起摩擦接受雌性花序与雄蕊头完成授粉。未授粉的对照capitulescence被用于证实每一个亲本中无性生殖的缺失。这对于出现无性生殖的或两性生殖的四倍体克隆尤其重要。在果实成熟时在授粉袋内，不需要胚胎拯救。
最初9个可能的亲本组合(一个来自每个适应群)中的至少三个被制成双倍体有些早的株系与有些晚的株系、早株系与晚株系、非常早的株系与非常晚的株系。按照上述检查它们的无性生殖。如果未表达无性生殖，则从9个可能性中制备另外的双倍体。应当理解，株系起源的遗传背景可能会影响无性生殖的表达。因此，选择或制备另外的整合了不同遗传背景的株系有时可能是必需的。
实施例8制备无性生殖单子叶和双子叶植物在实施例1-7中所描述的技术可用于从有性的双子叶植物或有性的单子叶植物获得无性生殖植物。
按照此处讲述的实践，可以高效地从许多被子植物属的有性生殖植物获得无性生殖植物。在人工的单子叶和双子叶植物的杂种和双倍体中偶尔可以观察到无性生殖(Linnean；Asker & Jerling)。这种偶然发生的原因是推测的并且不能说明重复基因不同步观念。而且，它们不被系统发生的、遗传的、生理的或发育的研究所支持。这些研究的解释是在亲本中存在特定的无性生殖基因但是被二倍体或不合适的遗传背景抑制了(Asker & Jerling)。这对于涉及无配系群的实施例是合理的。例如，G.L.Stebbins，Antennaria I.正常物种的细胞学，94 Bot.Gaz.134-51(1932)，记录了有性的Antennaria neglecta和有性的Antennariaplantaginifolia杂种中的无孢子生殖胚囊形成。同样，Nordberg，Sanguisorba minor(Rosaceae)复合体的胚胎学研究，120 BotaniskaNotiser 109-19(1967)(在此引用作为参考)。制备了两个有性四倍体和一个有性八倍体Sanguisorba种类之间所有的杂种组合，得到的所有四倍体和六倍体F1s产生无孢子生殖胚囊，其中未减数的卵通过孤雌生殖或受精后形成胚胎。而且，A.Jankun & M.Kovanda，Sorbus eximia(胚胎学研究在Sorbus 3中进行)二倍体水平的无性生殖，60 Preslia，Praha，193-213(1988)(在此引用作为参考)，记录了二倍体和四倍体Sorbus eximia中完全有功能的、高频率无孢子生殖的和二倍性孢子形成，Sorbus eximia是地理上限制的、来自有性的二倍体Sorbus aria和Sorbus torminalis的杂交物种。这三个例子都包含了无性生殖基因在有性二倍体祖先中也不表达的无配系群。相反，也存在其它的包含与无配系群无关的分类群的例子。
在Triticeae中报道了三个三物种杂种中的低频率的无性生殖(来自未减数卵的孤雌生殖)(A.Mujeeb-Kazi，来自Hordem-Triticum属间杂种的无性生殖子代，72遗传学杂志284-85(1981)(在此引用作为参考)；A.Mujeeb-Kazi，Triticum aestivum/Leymus racemosus//Thinopyrum elongatum三属间杂交中的无性生殖，61 Cytologia 15-18(1996)(在此引用作为参考)；R.Von Bothmer等，大麦的复合种间杂交(Hordeum vulgare L.)和无性生殖的可能发生，76理论和应用遗传学681-90(1988)(在此引用作为参考)，其中没有一个涉及Elymusrectisetus，Triticeae中唯一的无性生殖体，甚至其它的Elymus sp。
在有性的双倍体Raphanus sativs和Brassica oleraceae之间的杂种中观察到了频率高的多的无性生殖。从产生的10个杂种中6个的36-70％的胚珠中包含1.6-2.9个无孢子生殖胚囊(S.Ellerstrom &L.Zagorcheva，Raphanobrassica中的不育和无性生殖胚囊形成，87Hereditas 107(1977)(在此引用作为参考)，并记录了无孢子生殖Raphanobrassica的一个母本子代(S.Ellerstrom，Raphanobrassica的无性生殖子代，99 Hereditas 315(1983)(在此引用作为参考)。无孢子生殖不在亲本物种、属、科或整个Brassicales(Linnean)中的其它地方表达，这强有力地说明无孢子生殖在这种情况下不是发育抑制的无性生殖基因逐渐积累才表现出来的。针对这种效应，S.Ellerstrom &L.Zagorcheva，87 Hereditas 107(1977)讲述到“我们认为，看来更公正的结论是Raphanobrassica中无孢子生殖胚囊的形成是由生理紊乱导致的，杂种中两个亲本基因组之间合作缺损的结果，而不是假定存在控制这种胚囊形成的特定的基因。”Sven Ellerstrom在进行这项研究后不久就去世了，没有进行后续的研究。S.Ellerstrom & L.Zagorcheva，87 Hereditas 107(1977)(在此引用作为参考)和S.Ellerstrom，Raphanobrassica的无性生殖子代，99 Hereditas 315(1983)(在此引用作为参考)都未思考Ernst提供的远源杂交以外的负责Raphanobrassica的无孢子生殖的属间生理紊乱的本质或原因。他们也未确定这样的紊乱如何解释许多无性生殖体中相当简单的Mendellian遗传的证据以及某些无性生殖体可能源自同源多倍体。这些缺陷在被子植物(Linnean)繁殖异常的种系和基因组组成的研究中得到解决，其中重复基因的不同步表达得到鉴定。这种观念基本上解释了无性生殖文献中所有主要的不一致性并且被不计其数的系统发生、遗传学的、基因组的和生理学的研究所支持(Linnean；M.D.Peel等，37农作物科学724-32(1997)；M.D.Peel等，农作物科学37，717-23(1997))。
应当理解本发明可以在不脱离其精神或其基本特征的情况下，以其它特定的形式体现，它的基础是发现了无性生殖是由雌性发育通路中重复基因的不同步表达导致。上述的步骤和材料都应被看作是解释性的而不是限制性的，本发明的范围由附加的权利要求而不是由前面的描述阐明。权利要求相当物中意思和范围的所有改变也包含在其范围内。
权利要求
1.一种从有性生殖植物获得无性生殖植物的方法，包括以下步骤(a)从植物物种或有亲缘关系的植物物种群体中得到至少两套所述的株系，这些株系通过对各种光周期的开花反应和它们与非配子体胚珠和子房组织发育相关的雌性发育阶段开始时间和持续时间得以区分；并且(b)使所述株系杂交并选择那些包含每一种所述株系的遗传材料的杂交株系以使其被赋予不同步的花发育和由此导致的无性生殖杂交株系。
2.根据权利要求1所述的方法，其中开花反应差异存在于短日照植物、长日照植物、双重性日长植物、中日性植物或中间型光周期植物中。
3.根据权利要求1所述的方法，其中的开花反应差异存在于短日照植物、长日照植物、双重性日长植物、中日性植物、中间型光周期植物和日中性植物组成的群体的至少一个成员中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中对各种光周期的开花反应的差异通过植物育种得到。
5.根据权利要求1所述的方法，其中雌性发育阶段的开始时间和持续时间的差异存在于原孢子形成、大孢子发生、大配子体发生或早期胚胎发育中。
6.根据权利要求1所述的方法，其中雌性发育阶段的开始时间和持续时间的差异存在于选自原孢子形成、大孢子发生、大配子体发生和早期胚胎发育的至少一个成员中。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在雌性发育阶段的开始时间和持续时间的差异通过植物育种得到。
8.根据权利要求1所述的方法，其中的非配子体胚珠和子房组织包括由珠心、珠被、果皮、托杯和雌蕊壁组成的群体的至少一个成员。
9.根据权利要求1所述的方法，其中遗传材料包含赋予适当程度的可通过无性生殖表达测量的不同步性的每一套所述株系的基因组。
10.根据权利要求1所述的方法，其中遗传材料包含赋予适当程度的可通过无性生殖表达测量的不同步性的每一套所述株系的染色体。
11.根据权利要求1所述的方法，其中遗传材料包含赋予适当程度的可通过无性生殖表达测量的不同步性的每一套所述株系的基因。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述的所选杂交株系表现选自无孢子生殖、二倍性孢子形成和多胚现象的繁殖异常。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述的所选杂交株系是遗传上的多倍体。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述的所选杂交株系是遗传上的三倍体。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述的所选杂交株系是遗传上的非整倍体。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述的所选杂交株系是遗传上的二倍体。
17.一种从有性生殖植物获得无性生殖植物的方法，包括步骤(a)鉴定植物物种或有亲缘关系的植物物种群体中天然发生的对各种光周期的开花反应的差异；(b)得到两套所述的通过它们对各种光周期的开花反应得以区分的植物物种或有亲缘关系的植物物种群体中的株系；(c)鉴定在所述株系内或之间与非配子体胚珠和子房组织发育相关的雌性发育阶段开始时间和持续时间的差异；(d)得到所述物种或有亲缘关系的物种群体的至少两套所描述的株系，它们通过对各种光周期的开花反应和与非配子体胚珠和子房组织发育相关的雌性发育阶段开始时间和持续时间得以区分；并且(e)制备包含每一种所述株系的遗传材料的杂交株系使得其被赋予不同步的花发育和由此导致的无性生殖的杂交株系。
18.一种从有性生殖单子叶植物或双子叶植物中得到无孢子生殖、二倍性孢子形成或多胚植物的方法，包括以下步骤(a)鉴定植物物种或有亲缘关系的植物物种群体中天然发生的对各种光周期的开花反应的差异；(b)得到两个套所描述的通过它们对各种光周期的开花反应得以区分植物物种或有亲缘关系的植物物种群中的株系，；(c)鉴定在所述株系内或之间与选自珠心、珠被、果皮、托杯和雌蕊壁的非配子体胚珠和子房组织的发育相关的选自原孢子形成、大孢子发生、大配子体发生和早期胚胎发育的雌性发育阶段开始时间和持续时间方面的差异；(d)得到所述物种或物种群体的至少两套所描述的株系，这些株系的区分是由于它们的(i)对各种光周期的开花反应，差异发生在选自短日照植物、长日照植物、双重性日长植物、中日性植物、中间型光周期植物和日中性植物的一个成员内或跨越一个以上成员中，并且(ii)与选自珠心、珠被、果皮、托杯和雌蕊壁的非配子体胚珠和子房组织的发育相关的选自原孢子形成、大孢子发生、大配子体发生和早期胚胎发育的雌性发育阶段开始时间和持续时间，差异发生在这样的雌性发育阶段的一个成员内或跨越一个以上成员；(e)制备包含每一种所述株系的基因组、染色体或基因的多倍体、三倍体、二倍体或非整倍体株系使得表达无性生殖。
19.从两个或多个相同或有亲缘关系的物种的有性生殖植物制备无性生殖植物的方法，包括以下步骤(a)得到两个雌性繁殖表型不同的有性生殖株系，在相似环境条件下在两个株系之间存在雌性发育时间表的不同步性；(b)如果所述株系还不是多倍体，通过雌性发育时间表不同的有性生殖株系染色体加倍制备双倍体；并且(c)使这两个有性生殖株系杂交以诱导无性生殖。
20.根据权利要求19所述的方法，其中的步骤(c)在步骤(b)之前。
全文摘要
本发明提供从对不同光周期的反应和大孢子和配子体发育时间表有差异的有性生殖植物制备无性生殖植物的方法。优选的体系是鉴定物种或亲缘关系紧密的物种群体内的差异株系,如果需要,通过育种增加差异,并制备包含来自并列的差异株系的基因组的人工双倍体。通过结合繁殖上有差异的株系诱导的雌性发育程序的非同步表达导致无性生殖。此处所述的控制无性生殖表达的方法允许开发多种栽培农作物的不分离杂种。
文档编号A01H1/00GK1267187SQ98803377
公开日2000年9月20日 申请日期1998年2月5日 优先权日1997年2月5日
发明者J·G·卡曼 申请人:犹他州大学