一种离体诱导南高丛越橘四倍体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物技术中植物多倍体培育的方法，具体地说，涉及一种离体诱导南高丛越橘四倍体的方法。
【背景技术】
[0002]越橘属于杜鹃花科越橘属多年生落叶或常绿灌木，果实为蓝色或红色，原产北美。果实为蓝色或红色，果实大小因种类不同而异，果肉柔软多汁，风味醇美，含有丰富的维生素和及其他果品中少有的特殊营养成分，具有较高的保健药用价值，因此国际粮农组织将其列为人类五大健康食品之一。
[0003]植物染色体数目加倍后，提高植株基因量进而增强了植物的抗逆性，使植物对外界不良环境的适应能力更强；此外，加倍后的植株发生了叶片面积增大，叶片气孔数目减少，气孔保卫细胞增大，保卫细胞中的叶绿体含量增多等变化，提高了植物体的光合效率，有利于植物的生长发育。因此，植物多倍体诱导育种有着无比广阔的应用前景。而南高丛越橘(Vaccinium aMiraJe)具有抗逆性强、生长速度快、产量高等优点，但因果实较小而制约了其推广种植。开展越橘的多倍体育种，可在此基础上较快选育出一批高品质、高产量、适应性增强的新的种质资源。因此，本发明以组培苗茎尖为材料，采用浸渍法与培养基共培养结合的方法对南高丛越橘组培苗茎尖进行离体四倍体诱导，并获得了南高丛越橘四倍体再生植株，对培育适应热带及亚热带的大果型越橘新品种具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供出一种离体诱导南高丛越橘四倍体的方法，本发明以组培苗茎尖为材料，采用浸渍法对南高丛越橘组培苗茎尖进行离体四倍体诱导并获得了南高丛越橘四倍体再生植株，从而实现了本发明的目的。
[0005]本发明的一种离体诱导南高丛越橘四倍体的方法，包括以下的步骤:
(I)增殖培养:将生长健壮的南高丛越橘组培苗茎尖剪切并接种到继代培养基中进行增殖培养。接种后先在25?28°C条件下全暗培养2?5天，然后置于每天光照14?16小时，光照强度为3000?50001x，培养温度为25?28°C的条件下培养，每20天继代一次，以获得更多的丛生芽。
[0006](2)多倍体诱导:剪取步骤(I)培养获得的丛生芽带叶茎尖(约0.5cm)，浸泡在经过抽滤灭菌的秋水仙素溶液中，在摇床中以100?300r/min的速度震荡处理12?48h，然后无菌水冲洗3?5次后接种至诱导培养基中进行多倍体诱导培养。接种后先在25?28°C条件下全暗培养20?30天，然后置于每天光照14?16小时，光照强度为3000?50001x，培养温度为25?28°C的条件下培养。
[0007](3)嵌合体分离:将步骤(2)获得的变异植株枝条剪下，进行组织培养，将恢复生长的嵌合体枝条分切成带芽小段并接种到增殖培养基上分离培养，如此重复切割增殖培养几代，再进行倍性检测，直到得到四倍体植株为止。
[0008](4)生根培养:将步骤(3)获得的经形态鉴定、染色体计数确认已为四倍体的变异萌枝剪切并接种至生根培养中诱导生根。接种后置于每天光照14?16小时，光照强度为3000?50001x，培养温度为25?28°C的条件下培养直至生根。
[0009](5)炼苗移栽:根长至I?2cm试管苗的培养瓶瓶盖打开在室外于自然光照下炼苗2?4天后将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，尽量不伤害根部，栽入微酸性的由腐殖土:椰糠:稻谷=3:1:1组成基质中并定植于大田中，移栽I个月内保持空气湿度80%以上。
[0010]上述步骤(1)、(3)所述的增殖培养基为:WPM+0.1?1.0mg/L ZT+15?30g/L蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0011]上述步骤(2)所述的秋水仙素深夜是指浓度为0.05%?0.2%的秋水仙素溶液。
[0012]上述步骤(2)所述的诱导培养基为:WPM+0.1?2.0mg/L ZT+10?30mg/L秋水仙素 +15 ?30g/L 鹿糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0013]上述步骤(4)所述的生根培养基为:1/2MS+1.0?3.0mg/L NAA+1.0?2.0mg/LABTi+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0014]与现有技术相比本发明的优点是:南高丛越橘(Vaccinium australe)实有抗逆性强、生长速度快、产量高等优点，但因果实较小而制约了其推广种植。开展越橘的多倍体育种，可在此基础上较快选育出一批高品质、高产量、适应性增强的新的种质资源。本发明以组培苗茎尖为材料，采用浸渍法对南高丛越橘组培苗茎尖进行离体四倍体诱导并获得了南高丛越橘四倍体再生植株，为选育抗逆性强、优质、高产、单果大的南高丛越橘品种奠定基础。
【具体实施方式】
[0015]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0016]实施例1
(I)增殖培养:将生长健壮的南高丛越橘组培苗茎尖剪切并接种到继代培养基中进行增殖培养。接种后先在25°c条件下全暗培养3天，然后置于每天光照14小时，光照强度为30001x，培养温度为25°C的条件下培养，每20天继代一次，以获得更多的丛生芽，增殖系数为4.5。所述的增殖培养基为:WPM+1.2mg/L ZT+25g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.8。
[0017](2)多倍体诱导:剪取步骤(I)培养获得的丛生芽带叶茎尖(约0.5cm)，浸泡在经过抽滤灭菌的0.1%秋水仙素溶液中，在摇床中以100r/min的速度震荡处理18h，然后无菌水冲洗3次后接种至诱导培养基中进行多倍体诱导培养。接种后先在25°C条件下全暗培养20天，然后置于每天光照14小时，光照强度为30001x，培养温度为25°C的条件下培养60天后，茎尖存活率为80.32%，变异率为33.33%。所述的诱导培养基为:WPM+1.0mg/L ZT+20mg/L秋水仙素+20g/L蔗糖+4.0g/L琼脂，pH为5.8。
[0018](3)嵌合体分离:将步骤(2)获得的变异植株枝条剪下，进行组织培养，将恢复生长的嵌合体枝条分切成带芽小段并接种到增殖培养基上分离培养，如此重复切割增殖培养几代，再进行倍性检测，直到得到四倍体植株为止，四倍体植株率为16.76%。所述的增殖培养基为:WPM+1.2mg/L ZT+25g/L 蔗糖 +3.5g/L 琼脂，pH 为 5.8。
[0019](4)生根培养:将步骤(3)获得的经形态鉴定、染色体计数确认已为四倍体的变异萌枝剪切并接