一种采用假鳞茎诱导石仙桃植株再生及繁殖的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于濒危野生植物中重要植物材料快速繁殖方法，特别是涉及一种采用假鳞茎诱导石仙桃植株再生及繁殖的方法。
【背景技术】
[0002]石仙Pholidota chinensis Lindl.)是兰科(orchidaceae )石仙桃属(pholidota)植物，别名石橄榄、石上仙桃和石莲。多年生附生草本，肉质肥厚呈瓶状或卵形的根状茎横走，叶两片，顶生于假鳞茎之上，纸质而较柔嫩。石仙桃多糖具有较好的抗氧化作用。特别是抗超氧阴离子作用。石仙桃中多糖不仅含量较高，而且具有养阴，清肺，利湿，消瘀等功能，用于眩晕，头痛，咳嗽，吐血，梦遗，痢疾，白带，疳积，同时还具有:麻醉，益胃，止咳，抗癌以及提高免疫作用。石仙桃属植物全球约30种，分布于热带亚洲至澳大利亚和太平洋一些岛屿。在我国主要分布于云南、广东、广西、贵州、浙江、福建、江西等省，其中尤以云南西南地区多见。目前在市场上出现的石仙桃属植物多数来自野生资源，而石仙桃种子在自然状况下极难萌发，主要靠分株繁殖，速度慢。若无计划、无目的、盲目过度采挖，必将严重破坏其自然资源，稀有种类就会处于渐危或渐临灭绝的状态。所以，必须采取措施保护其自然资源。目前诱导石仙桃鳞茎植株再生未见报道。
【发明内容】
[0003]为了解决现有技术中种子在自然状况下极难萌发、自然繁衍能力、传播扩散能力不强，自然更新困难、分株繁殖速度慢等问题，本发明提供了一种采用假鳞茎诱导石仙桃植株再生及繁殖的方法，为规模化、产业化生产提供技术支持。
[0004]本发明的方法是以如下方式实现的:
本发明的一种采用假鳞茎诱导石仙桃植株再生及繁殖的方法，具体步骤如下
1)材料选取与消毒:选取新鲜饱满的石仙桃假鳞茎为外植体，去除叶2\3部分和假鳞茎周围杂质，用洗涤剂漂洗干净，置于流水中冲滴0.5-lh，然后进行消毒处理，消毒完成后进行接种；
2)诱导培养:将经消毒处理的材料，经滤纸吸干表面水分后接种于经高温、高压灭菌的鳞茎芽诱导培养基中；培养条件:培养室温度为23±2°C，光照时间8h/d，光照强度500 ?100lx ；
3)增殖培养:将经上述诱导培养，所得到的生长良好的直径成长为0.2-0.5 cm的假鳞茎，接种在增殖培养基中，光照时间8h/d，光照强度1000?15001x ；
4)诱导生根:将增殖培养出来的带有小叶片的假鳞茎无根幼苗单株，转移到生根培养基中；光照时间10h/d，光照强度1500?1800Ix ;
5)移栽:当诱导生根培养试管苗生长至根I?3条，新叶1-2片时，将试管苗放在自然光下炼苗5?7天，打开瓶盖炼苗1-2天；然后取出培养苗，洗去附着在根系上的培养基，移入水草和腐殖土质量比为I: 2的混合基质中，保湿遮阴，温度控制在15?25°C，湿度应保持在75 %?85 %，避免阳光直射，获得生长健壮的完整再生植株。
[0005]上述所涉及的培养基:
(1)鳞茎芽诱导培养基:VW+2.0 mg/L 6-BA +0.01 mg/L TDZ+0.3mg/LNAA+ 1.5g 吨―1 蛋白胨+25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g ?L ^0+30 g *L 1 香蕉+60 g *L 1 土显，pH 值为 5.4-5.6 ;
(2)增殖培养基:Vff+3.0mg/L 6-BA+0.01 mg/L TDZ+ 0.5mg/LNAA + 2g.171 蛋白胨+30g.L 1 香蕉 +70 g.L 1 土显 +25g/L Su+6.5g/L 1 Ag+1.5 g.L 1Ac, pH 值为 5.4-5.6 ；
(3)生根培养基:1/2VW+1.0 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA+25g/L Su+6.5g/LAg+l.5g.I^1Ac，pH 值为 5.4-5.6 ；
以上涉及:1、Ag为(Agar培养基凝固剂和支持物琼脂粉的缩写)。
[0006]2、Su为(Sugar提供植物碳源和维持渗透压蔗糖的缩写)。
[0007]3、Ac为活性炭。
[0008]4、成熟度为80%香蕉(未经各种催熟处理)。
[0009]5、土豆(为市售新鲜食用土豆，优选淀粉含量少的品种)。
[0010]本发明揭示了一种石仙桃植株再生及快速繁殖技术，经过25-35d诱导培养，60-70d增殖培养，30-40d诱导生根，保湿遮阴，避免阳光直射，移栽成活率达95%以上。2周后植株适应能力逐渐增强，获得生长健壮的完整再生植株。应用生物技术方法得到石仙桃再生植株有助于解决资源匮乏、缓解野生资源遭受严重破坏的压力，以有效地保护有限野生资源，为规模化、产业化生产提供技术支持。
[0011]本发明的显著优点:
一:通过本发明方法可以最大限度地应用现有资源，通过生物技术手段在短时间内解决稀缺资源的应用需求；
二:有助于解决资源匮乏、缓解野生资源遭受严重破坏的压力，有效地保护有限的野生资源，为规模化、产业化提供技术支持。
[0012]三:石仙桃鳞茎分株繁殖速度慢，有关石仙桃鳞茎高效繁殖方法未见报道。
[0013]四:石仙桃小鳞茎在鳞茎芽诱导培养基上培养后逐渐变绿、长大，增殖系数高、生根率高，植物生长需求时间短，栽培后适应性强，苗木健壮挺拔，长势良好，整齐一致，大大缩短了苗木培养过程，节约了大量成本。为石仙桃的保护，以及规模化、产业化生产推广应用提供技术支持。
[0014]五:总结出一套可供生产单位应用石仙桃鳞茎高效微体繁殖技术，通过应用该技术建立石仙桃生产基地。因此，石仙桃鳞茎繁育的广泛应用可直接提高珍稀品种人工林地产量、质量和园林绿化水平，实现资源高效培育，具有十分广阔的产业化发展前景。本发明仓撕性强，技术含量高，公益性强，对于促进珍稀兰花品种的研宄、利用，有着良好前景和及其重要意义，为开发利用该种资源提供了理论依据和技术支持。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
一种诱导石仙桃鳞茎植株再生及繁殖应用技术，具体步骤如下
I)材料选取与消毒:1、选取饱满石仙桃假鳞茎为外植体，采摘后用保鲜袋包装，带回实验室后去除叶2\3部分和假鳞茎周围杂质，用洗涤剂漂洗干净，置于流水中冲滴0.5h ;2、植株消毒处理:将冲洗后带叶假鳞茎植株用双蒸水冲荡2次，置超净工作台内用75%酒精消毒30s后倒去酒精，加入0.1%升汞(HgCl2)处理8min，将汞液倒入废汞瓶，无菌水冲荡3遍，即可接种；
2)诱导培养:将消毒处理材料，经滤纸吸干表面水分后带1\3叶部分和假鳞茎植株整个接种于经高温、高压灭菌的鳞茎芽诱导培养基中；培养条件:培养室温度为23°C，光照时间8h/d，光照强度8001x，培养时间25d ;假鳞茎逐渐适应专门设计配制的培养基并在此培养基上培养后逐渐变绿、长大；
3)增殖培养:将经上述诱导培养，所得到生长良好直径成长为0.4cm的假鳞茎，分别接种在增殖培养基中，光照时间8h/d，光照强度12001x，，增殖培养时间60d ；
4)诱导生根:将继代诱导培养出来的带有小叶片的假鳞茎无根幼苗单株分接，转移到生根培养基中；光照时间10h/d，光照强度16001x，诱导生根时间30d ；
5)试管苗培养完成:当诱导生根培养试管苗生长至根I条，新叶I片时完成诱导石仙桃植株再生并可以进行周期性繁殖培养；
6)移栽:将完成生根培养试管苗放在自然光下炼苗6天，打开瓶盖炼苗I天，增强试管苗对室外环境的适应能力；然后用摄子从培养瓶中取出培养苗，洗去附着在根系上的培养基，移入水草和腐殖土(1:2)混合的基质中，保湿遮阴(温度控制在20°C)，湿度保持在80%,避免阳光直射，成活率可达95%以上。I周后植株适应能力逐渐增强，获得生长健壮的完整再生植株。
[0016]培养基配制:培养基厚度为1.5cm左右，pH值为5.5 ；
(1)鳞茎芽诱导培养基VW+2.0 mg/L 6-BA +0.01 mg/L TDZ+0.3mg/LNAA+ 1.5g.Γ1蛋白胨 +25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g.L ^0+30 g.L 1 香蕉 +60 g.L 1 土? ；
(2)增殖培养基Vff+3.0mg/L 6-BA+0.01 mg/L TDZ+ 0.5mg/LNAA + 2g.L—1蛋白胨+30 g.L-1 香蕉 +70 g.L-1 土豆 +25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g.L-1Ac ；
(3)生根培养基1/2VW+1.0 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA+25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5g * [1Ac ；
以上涉及:1、Ag为(Agar培养基凝固剂和支持物琼脂粉的缩写)
2、Su为(Sugar提供植物碳源和维持渗透压蔗糖的缩写)
3、Ac为活性炭
4、成熟度为80%香蕉(未经各种催熟处理)
5、土豆(为市售新鲜食用土豆)。
【主权项】
1.一种采用假鳞茎诱导石仙桃植株再生及繁殖的方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: 1)材料选取与消毒:选取新鲜饱满的石仙桃假鳞茎为外植体，去除叶2\3部分和假鳞茎周围杂质，用洗涤剂漂洗干净，置于流水中冲滴0.5-lh，然后进行消毒处理，消毒完成后进行接种； 2)诱导培养:将经消毒处理的材料，经滤纸吸干表面水分后接种于经高温、高压灭菌的鳞茎芽诱导培养基中；培养条件:培养室温度为23±2°C，光照时间8h/d，光照强度500 ?100lx ； 3)增殖培养:将经上述诱导培养，所得到的生长良好的直径成长为0.2-0.5 cm的假鳞茎，接种在增殖培养基中，光照时间8h/d，光照强度1000?15001x ； 4)诱导生根:将增殖培养出来的带有小叶片的假鳞茎无根幼苗单株，转移到生根培养基中；光照时间10h/d，光照强度1500?1800Ix ; 5)移栽:当诱导生根培养试管苗生长至根I?3条，新叶1-2片时，将试管苗放在自然光下炼苗5?7天，打开瓶盖炼苗1-2天；然后取出培养苗，洗去附着在根系上的培养基，移入水草和腐殖土质量比为I: 2的混合基质中，保湿遮阴，温度控制在15?25°C，湿度应保持在75 %?85 %，避免阳光直射，获得生长健壮的完整再生植株。
2.根据权利要求1所述的采用假鳞茎诱导石仙桃植株再生及繁殖的方法，其特征在于:所述鳞茎芽诱导培养基:VW+2.0 mg/L 6-BA +0.01 mg/L TDZ+0.3mg/LNAA+ L 5g.Γ1蛋白胨+25g/L Su+6.5g/L Ag+1.5 g.L-1Ac+30 g.L4 香蕉+60 g.L4土豆，pH 值为5.4~5.60
3.根据权利要求1所述的采用假鳞茎诱导石仙桃植株再生及繁殖的方法，其特征在于:所述增殖培养基:Vff+3.0mg/L 6-BA+0.01 mg/L TDZ+ 0.5mg/LNAA + 2g.1/1 蛋白胨+30g.L 1 香蕉 +70 g.L 1 土显 +25g/L Su+6.5g/L 1 Ag+1.5 g.L 1Ac, pH 值为 5.4-5.6。
4.根据权利要求1所述的采用假鳞茎诱导石仙桃植株再生及繁殖的方法，其特征在于:所述生根培养基:1/2VW+1.0 mg/L ΙΒΑ+0.3 mg/L NAA+25g/L Su+6.5g/LAg+l.5g.L 1Ac, pH 值为 5.4-5.6。
【专利摘要】本发明属于濒危野生植物中重要植物材料快速繁殖方法，特别是涉及一种采用假鳞茎诱导石仙桃植株再生及繁殖的方法。该方法包括材料选取与消毒、诱导培养、增殖培养、诱导生根和移栽。本发明为了解决现有技术中种子在自然状况下极难萌发、自然繁衍能力、传播扩散能力不强，自然更新困难、分株繁殖速度慢等问题，为规模化、产业化生产提供技术支持。本发明增殖系数高、生根率高，植物生长需求时间短，栽培后适应性强，苗木健壮挺拔，长势良好，整齐一致，大大缩短了苗木培养过程，节约了大量成本。为石仙桃的保护，以及规模化、产业化生产推广应用提供技术支持。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104813936
【申请号】CN201510234195
【发明人】何碧珠, 林蔚, 何官榕
【申请人】福建农林大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月11日