，会在动物模型中植 入含有生长因子的基质及不含所述生长因子的对照基质二者。在对照基质中，通常几乎观 察不到新血管系统。要植入的基质块的尺寸取决于动物模型的性质。例如，对于小鼠，可以 使用边长2-6_的片。对于大型动物，则采用更大的片。片的厚度在1-3_左右。所述片 应当是这样的尺寸（dimension)，使得它可以被包括在皮瓣中。
[0030] 合适的生长因子包括血管生成素（angiogenin)、angiopoietin1、Del1、成纤维 细胞生长因子（酸性的（aFGF)和碱性的（bFGF))、卵泡抑素（follistatin)、粒细胞集落 刺激因子（G-CSF)、肝细胞生长因子（HPGF)或散射因子（scatterfactor，SF)、白介素-8、 瘦蛋白（1印tin)、胎盘生长因子、血小板衍生的内皮生长因子（PDEGF)、血小板衍生的生长 因子BB(PDGF-BB)、多效营养因子&16丨〇廿(^111，？了沁、增殖素&1〇11€6411)、转化生长因 子-a(TGF-a)或(TGF-0)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、血管内皮生长因子（VEGF)、和 前微粒体蛋白（progranulin)。有些实施方案特别地使用酸性或碱性FGF、VEGF、和TOEGF。
[0031] 关于标记内皮细胞，可以使用具有足够辉度（brilliance)的任何荧光蛋白。本文 中例示了绿色荧光蛋白，但是也可以采用其它颜色的荧光，包括红色、黄色和蓝色。在必要 时，还可以修饰荧光蛋白以使其与宿主相容。
[0032] 在一个典型的实验中，在动物的一侧皮下植入一小片经生长因子处理的生长基 质，而在另一侧植入另一片不含生长因子的基质。合适长度的时间段后，典型的是几天，但 是在一个典型的实施方案中可以在4小时与2周之间任意选择，暴露包含基质的皮瓣，并使 用荧光显微镜进行评估。新血管系统作为荧光是直接可见的。
[0033] 然后可以通过对施用方案的动物中所观察到的血管发生与类似构建但未经处理 的动物进行比较，来评估药物或方案的影响。可以以这种方式评估施用药物或提供方案的 任何合适方法。
[0034] 许多以前的血管发生模型是肿瘤模型，它们要求肿瘤的宿主对于肿瘤是严重免疫 缺损的或同基因的。因为合成的生长基质不引发免疫应答，而荧光蛋白或者不引发此类应 答，或者可以经修饰而成为免疫透明的（immunotransparent)，所以在使用本发明的模型时 不要求这些限制条件。这能够实现更现时的结果和更便利的分析。虽然下文实施例中使用 了裸鼠，但是在所述测定法中并非必须使用免疫缺损的动物。
[0035] "合成基质"意指自单体或其它成分从新合成的基质，或者是从活体系统（但不是 肿瘤）分离的基质。如此，例如，例示的Gelfoam源自猪明胶。
[0036] 提供以下实施例来例示而非限制本发明。
[0037] 实施例1:多柔比星对血管发生的影响
[0038] 使用在内皮细胞中生成绿色荧光蛋白（GFP)的转基因C57/B6裸鼠。用 三溴乙醇麻醉这些转基因小鼠（6-8周龄）。将Gelfoaill? (Pharmacia&Upjohn company,Kalamazoo,MI)块（5x5mm)用 75y1RPMI1640 培养基（Cellgro,Herndon,VA) 中的300ng碱性成纤维细胞生长因子（bFGF) (Chemicon，Temecula，CA)处理，或者不处 理。将Gelfoam?;块移植到转基因小鼠两边体侧皮下层中，一侧植入一块经过处理的 Gelfoam?块，另一侧植入一块未经处理的Gelfoam?块。在移植Gelfoam?,后第〇、1、和 2天，给一组小鼠每天一次ip注射5yg/g多柔比星，而另一组给予0. 9%NaCl溶液（溶媒 对照）。第7天在麻醉下制作皮瓣。通过体内荧光显微成像来测量皮瓣中发荧光的新生血 管的长度，由此对血管发生定量。
[0039] 使用配备有汞灯和50W电源的LeicaLZ12型荧光立体显微镜。通过D425/60带 通滤光片和470DCXR双色镜产生GFP的选择性激发。在HamamatsuC58103芯片冷色电 荷親合器件相机（HamamatsuPhotonics,Bridgewater,NJ)上穿过长通（long-pass)滤 光片（GG475;ChromaTechnology,Brattleboro，VT)收集所发射的焚光。使用IMAGEPRO PLUS3. 1软件（MediaCybernetics,SilverSpring,MD)对图像进行反差和亮度加工并进 行分析。在IBMPC上直接捕获1024x724像素的高分辨率图像，或者通过高分辨率Sony ￥0?(31^1?1000型；3〇1^，1'〇1^〇)上的视频输出来连续地捕获该图像。
[0040] 使用抗大鼠免疫球蛋白辣根过氧化物酶检测试剂盒（BDPharmingen,San diego，ca)遵循制造商的说明书检测血管化的_Gel_f〇am? _的冷冻切片中发荧光的新血管 系统和⑶31的共定位。一抗是抗⑶31单抗（1:50 ;Chemicon,Temecula,CA)。抗原染色使 用底物-色原体3, 3'-二氨基联苯胺染色。
[0041] 实验数据表述成均值土SD。统计学分析使用双尾Student氏t检验来进行。
[0042] 图2显示了结果的比较。图2a-2d中的短线代表500ym的长度。如图2a所示， 在给予对照（0. 9%NaCl)溶液的小鼠中，在含bFGF的Gelfoam?小块中形成了大的新血 管系统复合体。即使在这些小鼠中，在不含bFGF的Gelfoami)中没有观察到显著的新血 管系统（图2b)。如图2c所示，施用多柔比星的小鼠在经bFGF处理的泡沫体中显示出大大 减少的新血管系统，而在不含bFGF的泡沫体中观察不到血管发生。
[0043] 图4是图2所示结果的图示。在施用作为对照的氯化钠的小鼠中，在含bFGF的 Gelfoam?小块中的平均新生血管长度（单位为mm/mm2)几乎为6,而且这些小鼠中即使在 未经如此处理的Gelfoani?中也表现出一些血管发生的存在。在施用多柔比星的小鼠中， 经bFGF处理的Gelfoam?中的血管发生的程度降低到低于用氯化钠处理的小鼠中的未经 处理的Gelfoam?。.
[0044] 图3显示了发荧光的血管与⑶31 ( -种内皮细胞标志物）表达之间的相关性。在 图3中，短线代表100ym。在第7天由经bFGF处理的Gelfoam⑧制成冷冻切片。图3a显 示了通过荧光测定的新血管分布，图3b显示了⑶31分布。血管的分布与⑶31的分布实际 上是同样的。
【主权项】
1. 一种血管发生转基因动物模型，该模型包含经修饰而在新生血管形成细胞中表达荧 光蛋白的动物且进一步包含在皮下层中植入的一个或多个生长基质单元。2. 权利要求1的动物模型，其中所述荧光蛋白是由编码核苷酸序列在源自巢蛋白的控 制序列的控制下生成的。3. 权利要求1的动物模型，其中至少一个所述生长基质单元含有血管发生的生长因 子。4. 权利要求3的动物模型，该模型进一步包含至少一个未经生长因子处理的生长基质 单元。5. 权利要求3的动物模型，其中所述生长因子是VEGF或bFGF。6. 权利要求1的动物模型，其中所述生长基质单元包含在皮瓣中。7. 权利要求1的动物模型，其中所述生长基质单元是胶原凝胶。8. -种鉴定调控血管发生的药物或方案的方法，该方法包括将所述药物或方案施用于 权利要求3的动物模型，比较未施用所述药物或方案的对照动物模型中的血管发生程度。9. 一种观察转基因动物中的新血管形成的方法，该方法包括通过荧光显微术直接观察 所述动物中由植入皮下层中的生长基质中荧光标记的细胞所形成的荧光标记的新生血管 的存在、不存在或量， 其中所述荧光是由所述细胞中表达的荧光蛋白生成的；且 其中所述生长基质包含血管发生的生长因子。10. 权利要求9的方法，其中通过测量所述新生血管的长度来对新血管形成定量。11. 权利要求9的方法，其中所述荧光蛋白的生成受到源自巢蛋白的控制元件的控制。12. 权利要求9的方法，其中所述生长基质是胶原凝胶。13. 权利要求9的方法，该方法进一步包括比较包含生长因子的所述生长基质中的新 生血管量与不含生长因子的对照生长基质中观察到的新生血管量。14. 权利要求9的方法，其中所述观察是通过荧光显微术进行的。15. 权利要求14的方法，其中所述生长基质包含在皮瓣中。
【专利摘要】本发明描述了血管发生的动物模型。新生血管被包含生长因子的生长基质所支持。新生血管被在形成这些血管的细胞中选择性表达的荧光蛋白所标记。
【IPC分类】G01N33/50, A01K67/027
【公开号】CN105075984
【申请号】CN201510397522
【发明人】天羽康之
【申请人】抗癌公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2007年9月27日
【公告号】CA2664363A1, EP2067031A1, EP2067031A4, EP2067031B1, US20100146643, WO2008039932A1