一种佛手参的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种佛手参的快速繁殖方法，属于生物领域。
【背景技术】
[0002]兰科手参属植物为多年生草本植物，全世界共10种，我国有5种，包括西南手参、手参、短距手参、蛾眉手参和角距手参。佛手参因具有可观的药用价值而被列入多部藏医药经典。
[0003]兰科植物的种子极小(每粒种子长1~2 mm,直径0.1~0.2 mm)，由于其胚发育不完全，缺乏供给营养成分的胚乳，因此在自然条件下需要与生境中的真菌共生才能萌发，自然萌发率极低。兰科植物依其生长的环境可分为气生兰和陆生兰，生长于土壤中的陆生兰为了适应其分布地的生态环境，在长期的进化中发展了种皮厚及含有阻碍萌发的物质等特征，其种子比气生兰种子更难以萌发。兰科手参属植物为陆生兰类，佛手参的无性繁殖是由老手参根部仅增生一个小手参，当小手参长大时，老手参枯死，平均繁殖倍数低于2，而种子的自然萌发率也极低。解决佛手参的种苗规模化繁殖是实现其人工栽培、药用开发及种质资源保护的关键。
[0004]佛手参属于陆生兰类，其无性及有性繁殖均较为困难，人为的采挖导致了野生资源日益匮乏，迫切需要像天麻、石斛等药用兰科植物一样进行人工栽培，而种苗的规模化生产是实现人工栽培的关键技术。现有技术有人曾尝试利用佛手参的根、芽体和花梗为外植体进行离体培养研究，设计了大量不同植物生长物质组合的培养基，但接种的150个块根、150个花梗和20余个芽体无一例诱导成功，表明佛手参组织培养难度很大。该研究还首次对佛手参种子进行了非共生萌发研究，种子萌发率可达到20%，这已经是很重大的突破，但是萌发率还是非常低，而且将萌发后得到的原球茎进一步进行诱导分化处理，分化率最高仅仅为7%左右，而且后期分化得到的芽无法壮苗成活。
[0005]本发明旨在提供一种佛手参的快速繁殖方法，其利用多种物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高种子的萌发率，原球茎的分化率，而且可以进行壮苗培养，炼苗后转入温室最终存活率高。
【发明内容】
[0006]基于【背景技术】存在的技术问题，本发明针对【背景技术】存在的问题，提供一种佛手参的快速繁殖方法，其利用多种物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高种子的萌发率，原球茎的分化率，而且可以进行壮苗培养，炼苗后转入温室最终存活率高。
[0007]本发明的目的通过以下技术方案实现:
一种佛手参的快速繁殖方法，其特征在于，步骤如下:
种子萌发:
(1)预处理:
取佛手参中度成熟种子，未开裂且易与胎座剥离的黄色种子，用流水冲洗30min，然后加入预处理液中，置于恒温超声波发生器(功率:25KHz)，在28°C恒温处理3min ;
所述预处理液的配方为:苹果酸lg/L，漆酶0.8g/L (酶活为5000u/g)，甘氨酸2g/L,其余为纯净水；
(2)萌发培养基培养:
预处理后，使用中性洗涤剂清洗，然后用蒸馏水冲洗5遍，在无菌条件下将其转至无菌瓶内；用无菌水冲洗3遍后，冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；
用无菌手术刀片纵向割开果荚，挑出种子，散铺于萌发培养基中，接种后的种子在18 °(:黑暗条件下培养5 d后，升温至25 °C黑暗条件下继续培养1 d，接着置于光照周期12 h.d-1,光照强度3.2 μπιο?.m 2.s 1的散光条件下培养；
所述萌发培养基的配方为:以MS为基础培养基，蔗糖11.8g/L、琼脂3.9g/L，复方中药提取液 0.5g/L、椰汁 8g/L、6-BA 0.lmg/L, ρΗ6.5 ；
所述复方中药提取液的制备方法为:
如下所述均为质量份；
取6份罗汉果，3份天山雪莲，1份党参，1份淫羊藿，1.7份茯苓，0.8份连翘，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3°C备用；
实体镜下观察萌发情况并统计萌动率和萌发率。萌动指种子膨大；萌发指膨大的种子能够形成原球茎。
[0008]结果:培养30d后，萌动率达到99.8%，萌发率高达92.1%，这是对濒危植物佛手参种子育苗研究的重大突破。
[0009]诱导佛手参原球茎分化:
(3)获得佛手参种子萌芽得到的原球茎；
(4)愈伤组织形成:
将佛手参种子萌芽得到的原球茎移至诱导增殖培养基；
所述诱导增殖培养基的配方为:以MS为基础培养基，蔗糖15.8 g/L、琼脂3.9g/L，海藻糖 5 g/L,复方中药提取液 0.3g/L、椰汁 5g/L、6-BA 0.lmg/L、pH6.5 ；
所述复方中药提取液的制备方法为:
如下所述均为质量份；
取5份党参，2份天山雪莲，1份青果，1份淫羊藿，1.6份积雪草，0.5份凌霄花，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3°C备用；
(5)待根状茎和愈伤组织长出以后，将根状茎切为长约0.2cm的节段，愈伤组织切成0.2cmX0.2cm小块平铺于新鲜的诱导增殖培养基上；置于温度26°C，光照周期12h.d-1,光照强度22 μπιο?.πι2.s 1的条件下培养，每45 d继代一次，继代3次后的增殖倍数为4.1，分化率高达81.2%。
[0010]再生植株形成与生长
(6)分化出芽后，很快在芽基部长出多条根，这时转入壮苗培养基:
所述壮苗培养基的配方为:以MS为基础培养基，蔗糖18.8-20.lg/L、琼脂3.9g/L，胶原蛋白 0.2-0.5g/L、海藻糖 3-4g/L、椰汁 6g/L、6_BA 0.2-0.3mg/L、ρΗ6.5 ； 置于温度26°C，光照周期12 h.d-1,光照强度25 μπιο?.m 2.s 1的条件下培养；
壮苗培养5周后，分化的芽发育形成健康的小苗，存活率为78.1-92.3%。
[0011]本发明利用多种物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高种子的萌发率，原球茎的分化率，而且可以进行壮苗培养，成活率高，而且炼苗后转入温室最终存活率也很高。
[0012]本发明的有益之处在于:
本发明利用多种物理和生物手段，成本低廉，操作方便，可以大幅提高种子的萌发率，原球茎的分化率，而且可以进行壮苗培养，壮苗培养5周后，分化的芽发育形成健康的小苗，存活率为78.1-92.3%ο
[0013]，而且炼苗后转入温室最终存活率也很高。
【具体实施方式】
[0014]实施例1:
一种佛手参的快速繁殖方法，其特征在于，步骤如下:
种子萌发:
(1)预处理:
取佛手参中度成熟种子，未开裂且易与胎座剥离的黄色种子，用流水冲洗30min，然后加入预处理液中，置于恒温超声波发生器(功率:25KHz)，在28°C恒温处理3min ;
所述预处理液的配方为:苹果酸lg/L，漆酶0.8g/L (酶活为5000u/g)，甘氨酸2g/L,其余为纯净水；
(2)萌发培养基培养:
预处理后，使用中性洗涤剂清洗，然后用蒸馏水冲洗5遍，在无菌条件下将其转至无菌瓶内；用无菌水冲洗3遍后，冲洗干净后用75%的酒精进行消毒20s，用无菌水冲洗5次，再加入0.1%汞溶液放在振荡器上进行振荡消毒5min，然后用无菌水冲洗5次以上，沥干水分；
用无菌手术刀片纵向割开果荚，挑出种子，散铺于萌发培养基中，接种后的种子在18 °(:黑暗条件下培养5 d后，升温至25 °C黑暗条件下继续培养1 d，接着置于光照周期12 h.d-1,光照强度3.2 μπιο?.m 2.s 1的散光条件下培养；
所述萌发培养基的配方为:以MS为基础培养基，蔗糖11.8g/L、琼脂3.9g/L，复方中药提取液 0.5g/L、椰汁 8g/L、6-BA 0.lmg/L, ρΗ6.5 ；
所述复方中药提取液的制备方法为:
如下所述均为质量份；
取6份罗汉果，3份天山雪莲，1份党参，1份淫羊藿，1.7份茯苓，0.8份连翘，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3°C备用；
实体镜下观察萌发情况并统计萌动率和萌发率。萌动指种子膨大；萌发指膨大的种子能够形成原球茎。
[0015]结果:培养30d后，萌动率达到99.8%，萌发率高达92.1%，这是对濒危植物佛手参种子育苗研究的重大突破。
[0016]诱导佛手参原球茎分化: (3)获得佛手参种子萌芽得到的原球茎；
(4)愈伤组织形成:
将佛手参种子萌芽得到的原球茎移至诱导增殖培养基；
所述诱导增殖培养基的配方为:以MS为基础培养基，蔗糖15.8 g/L、琼脂3.9g/L，海藻糖 5 g/L,复方中药提取液 0.3g/L、椰汁 5g/L、6-BA 0.lmg/L、pH6.5 ；
所述复方中药提取液的制备方法为:
如下所述均为质量份；
取5份党参，2份天山雪莲，1份青果，1份淫羊藿，1.6份积雪草，0.5份凌霄花，上述药物按传统煎煮方法加300份煎煮至30份水时，过滤，紫外线灭菌于3°C备用；
(5)待根状茎和愈伤组织长出以后，将根状茎切为长约0.2cm的节段，愈伤组织切成0.2cmX0.2cm小块平铺于新鲜的诱导增殖培养基上；置于温度26°C，光照周期12h.d-1,光照强度22 μπιο?.πι2.s 1的条件下培养，每45 d继代一次，继代3次后的增殖倍数为4.1，分化率高达81.2%。
[0017]再生植株形成与生长
(6)分化出芽后，很快在芽基部长出多条根，这时转入壮苗培养基:
所述壮苗培养基的配方为:以MS为基础培养基，蔗糖18.8g/L、琼脂3.9g/L，胶原蛋白0.5g/L、海藻糖 3g/L、椰汁 6g/L、6_BA 0.3mg/L、pH6.5 ；
置于温度26°C，光照周期12 h.d-1,光照强度25 μπιο?.m 2.s 1的条件下培养；
壮苗培养5周后，分化的芽发育形成健康的小苗，存活率为78.1%。
[0018]实施例2:
一种佛手参的快速繁殖方法，其特征在于，步骤如下:
种子萌发:
(1)预处理:
取佛手参中度成熟种子，未开裂且易与胎座剥离的黄色种子，用流水冲洗30min，然后加入预处理液中，置于恒温超声波发生器(功率:25KHz)，在28°C恒温处理3min ;
所述预处理液的配方为:苹果酸lg/L，漆酶0.8g/L (酶活为5000u/g)，甘氨酸2g/L,其余为纯净水；
(2)萌发培养基培养: