用于乌菜无菌苗培养的种子消毒方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物组织培养技术领域，具体地说，涉及用于乌菜无菌苗培养的种子 消毒方法。
【背景技术】
[0002] 随着分子生物技术研究的快速发展，通过转基因方法提高蔬菜抗性和产量成为改 良蔬菜品质的最佳途径。无菌苗的培养是组织培养和转基因研究能否有效进行的前提。许 多研究者对种子的消毒方法进行了大量探索。李旭娇等(甘蓝型油菜无菌苗培养方法的优 化，李旭娇，田保明，范兴福，师恭耀，宋铮，裴振强，王伯楠，孙丹丹，高树广，河南农业科学， 2009年)对甘蓝型油菜种子的消毒方法进行研究，结果表明以70%酒精表面消毒0.5-lmin 后，用0.1 %HgCl2消毒lOmin效果最好。但HgCl2为剧毒试剂，在试验中产生废水处理较困难， 直接排放会污染环境，因此不提倡使用HgCl 2进行种子灭菌消毒。乌菜为十字花科芸薹属白 菜亚种的一个变种，目前，针对乌菜无菌苗培养前的种子消毒方法尚未建立一套科学、系 统、安全、环境友好型的消毒方法，且不影响种子的发芽率。
【发明内容】
[0003] 本发明旨在提供一种可以提高种子的发芽率的，用于乌菜无菌苗培养的种子消毒 方法。
[0004] 为了实现本发明目的，本发明提供的用于乌菜无菌苗培养的种子消毒方法，将乌 菜种子用清水冲洗2〇-3〇111；[11(优选30111；[11)后。置于75%酒精中浸泡消毒30-1208，然后用无 菌水冲洗2-4遍(优选3遍），再用1-8%次氯酸钠溶液浸泡消毒5-12min，最后用无菌水冲洗 2-4遍(优选3遍），即完成种子消毒。
[0005] 优选地，将乌菜种子用清水冲洗30min后。置于75%酒精中浸泡消毒30s，然后用无 菌水冲洗3遍，再用8 %次氯酸钠溶液浸泡消毒5min，最后用无菌水冲洗3遍，即完成种子消 毒。
[0006] 更优选地，将乌菜种子用清水冲洗30min后。置于75%酒精中浸泡消毒30s，然后用 无菌水冲洗3遍，再用1 %次氯酸钠溶液浸泡消毒5min，最后用无菌水冲洗3遍，即完成种子 消毒。
[0007] 最优选地，将乌菜种子用清水冲洗30min后。置于75%酒精中浸泡消毒30s，然后用 无菌水冲洗3遍，再用2%次氯酸钠溶液浸泡消毒5min，最后用无菌水冲洗3遍，即完成种子 消毒。
[0008] 本发明进一步提供所述种子消毒方法在乌菜无菌苗培养中的应用。
[0009] 所述应用是将消毒后的乌菜种子接种于MS培养基中，于25°C培养。
[0010]本发明基于乌菜无菌苗种子常规消毒方法进行三因素四水平的正交试验设计。三 因素为75%酒精消毒时间、次氯酸钠溶液浓度、次氯酸钠溶液消毒时间，各因素下的水平分 别为30s、60s、90s、120s (75 %酒精消毒时间）；1 %、2 %、5 %、8 % (次氯酸钠溶液浓度）； 5111；[11、8111；[11、10111；[11、12111；[11(次氯酸钠溶液消毒时间）。
[0011]在种子消毒后，用枪头镊将其接种于MS培养基中培养5d。记录菌落数及种子发芽 数，以消毒种子的带菌率表示消毒效果，计算发芽率，并进行方差分析。
[0012] 结果表明：（1 )75%酒精浸泡30s后，用8%次氯酸钠溶液消毒5min，可以降低乌菜 种子的带菌率，提高种子的消毒效果；（2)75%酒精浸泡30s后，用1 %次氯酸钠溶液消毒 5min，可以提高乌菜种子的发芽率；（3)75%酒精浸泡30s后，用2%次氯酸钠溶液消毒5min， 既可以降低乌菜种子的带菌率，提高消毒效果，又可以保证乌菜种子的发芽率。
[0013] 本发明基于乌菜无菌苗种子常规消毒方法进行三因素四水平的正交试验设计，确 定了75%酒精的最佳消毒时间以及次氯酸钠溶液的最佳浓度和最佳消毒时间，降低种子的 带菌率，同时保证较高的发芽率，有利于后续乌菜无菌苗培养技术的深入研究。
【具体实施方式】
[0014] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0015] 实施例1乌菜无菌苗种子消毒方法的研究
[0016] 1、试验进行之前进行三因素四水平的正交试验设计(表1)。三因素为75%酒精消 毒时间、次氯酸钠溶液浓度、次氯酸钠溶液消毒时间，各因素下的水平分别为30s、60 S、90s、 120s (75 %酒精消毒时间）；1 %、2 %、5 %、8 % (次氯酸钠溶液浓度）；5min、8min、lOmin、 12min(次氯酸钠溶液消毒时间）。
[0017] 2、选取籽粒饱满、颜色正常的健康乌菜种子800粒，分为16组，每组50粒。将种子置 于自来水下冲洗30min，然后移至超净工作台。用75%酒精浸泡消毒后，用无菌水冲洗3遍， 然后用次氯酸钠溶液浸泡消毒，随后用无菌水冲洗3遍。75%酒精消毒时间、次氯酸钠溶液 浓度、次氯酸钠溶液消毒时间均根据试验设计。
[0018] 3、在种子消毒后，用无菌枪头镊将其接种于MS培养基中，于25°C培养5d。记录菌落 数及种子发芽数，以消毒种子的带菌率表示消毒效果(表2)，并计算发芽率(表3)，然后进行 方差分析。
[0019] 表1乌菜无菌苗种子消毒正交试验因素水平表
[0022]表2乌菜无菌苗种子消毒正交试验结果-灭菌效果
[0023]
[0024] 表3乌菜无菌苗种子消毒正交试验结果-发芽率
[0025]
[0026]
[0027]表4乌菜无菌苗种子消毒补充试验结果
[0029] 4、试验结果表明：75%酒精浸泡30s后，用8%次氯酸钠溶液消毒5min，可以降低乌 菜种子的带菌率，提高种子的消毒效果。75%酒精浸泡30s后，用1 %次氯酸钠溶液消毒 5min，可以提尚种子的发芽率。
[0030] 5、对以上结果进行了补充试验，每个处理重复三次，每次50粒乌菜种子，重复步骤 2和3操作。
[0031] 6、补充试验结果表明：75%酒精浸泡30s后，用2%次氯酸钠溶液消毒5min，既可以 降低乌菜种子的带菌率，提高消毒效果，又可以保证种子的发芽率(表4)。
[0032] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 用于乌菜无菌苗培养的种子消毒方法，其特征在于，将乌菜种子用清水冲洗20-30min后，置于75%酒精中浸泡消毒30-120S，然后用无菌水冲洗2-4遍，再用1-8%次氯酸钠 溶液浸泡消毒5-12min，最后用无菌水冲洗2-4遍，即完成种子消毒。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将乌菜种子用清水冲洗30min后。置于75% 酒精中浸泡消毒30-120S，然后用无菌水冲洗3遍，再用1-8%次氯酸钠溶液浸泡消毒5-12min，最后用无菌水冲洗3遍，即完成种子消毒。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将乌菜种子用清水冲洗30min后。置于 75%酒精中浸泡消毒30s，然后用无菌水冲洗3遍，再用8%次氯酸钠溶液浸泡消毒5min，最 后用无菌水冲洗3遍，即完成种子消毒。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将乌菜种子用清水冲洗30min后。置于 75%酒精中浸泡消毒30s，然后用无菌水冲洗3遍，再用1 %次氯酸钠溶液浸泡消毒5min，最 后用无菌水冲洗3遍，即完成种子消毒。5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，将乌菜种子用清水冲洗30min后。置于 75%酒精中浸泡消毒30s，然后用无菌水冲洗3遍，再用2%次氯酸钠溶液浸泡消毒5min，最 后用无菌水冲洗3遍，即完成种子消毒。6. 权利要求1-5任一项所述种子消毒方法在乌菜无菌苗培养中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将消毒后的乌菜种子接种于MS培养基中， 于25 °C培养。
【专利摘要】本发明提供一种用于乌菜无菌苗培养的种子消毒方法，所述方法是将乌菜种子用清水冲洗20-30min后，置于75％酒精中浸泡消毒30-120s，然后用无菌水冲洗2-4遍，再用1-8％次氯酸钠溶液浸泡消毒5-12min，最后用无菌水冲洗2-4遍，即完成种子消毒。本发明基于乌菜无菌苗种子常规消毒方法进行三因素四水平的正交试验设计，结果表明，75％酒精浸泡30s后，用2％次氯酸钠溶液消毒5min，既可以降低乌菜种子的带菌率，提高消毒效果，又可以保证种子的发芽率，有利于后续乌菜无菌苗培养技术的深入研究。
【IPC分类】A01C1/08, A01H4/00
【公开号】CN105594342
【申请号】CN201610052717
【发明人】汪承刚, 张盛云, 陈国户, 袁凌云, 朱世东, 刘思嘉, 方柔
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月25日