肝素的转基因生产的制作方法

肝素的转基因生产的制作方法
【专利摘要】本申请提供了用于生产肝素的方法、细胞和转基因非人哺乳动物。具体地，所述方法包括提供转基因非人哺乳动物或修饰的乳腺上皮细胞以表达一个或多个肝素生物合成酶，并收集所产生的肝素。进一步提供了所述细胞、其转基因非人哺乳动物、以及从这些细胞或转基因非人哺乳动物获得的肝素。
【专利说明】肝素的转基因生产
[0001] 相关申请
[0002] 本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2013年12月24日提交的美国临时专利申请序号 61/920,505,名称为"肝素的转基因生产"的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。 发明领域
[0003 ]本申请涉及生物化合物的转基因生产领域。
[0004] 发明背景
[0005] 肝素是一种作为抗凝剂广泛使用的复杂的糖胺聚糖。通常从动物小肠或牛肺中收 集肝素。然而，存在肝素污染的问题。因而，需要用于生产肝素的新方法。
[0006] 发明概述
[0007] 在一个方面，本申请提供了用于生产肝素的方法、细胞和转基因哺乳动物。在一个 实施方式中，提供了在其乳汁中生产肝素的转基因非人哺乳动物。在一个实施方式中，提供 了一种生产肝素的方法，所述方法包括提供一种转基因非人哺乳动物，所述转基因非人哺 乳动物已被修饰以便在其乳腺中表达一种或多种肝素合成酶，和从所述转基因哺乳动物乳 腺生产的乳汁中收集肝素。在一个实施方式中，提供了一种生产肝素的方法，所述方法包括 提供一种转基因非人哺乳动物，所述转基因非人哺乳动物已被修饰以便在其乳腺中表达一 种或多种肝素合成酶和核心蛋白，和从所述转基因哺乳动物乳腺生产的乳汁中收集肝素。
[0008] 在另一个方面，提供了一种生产肝素的方法，所述方法包括提供乳腺上皮细胞，所 述乳腺上皮细胞已被修饰以表达一种或多种肝素生物合成酶，和从乳腺上皮细胞收集肝 素。在一个实施方式中，提供了一种生产肝素的方法，所述方法包括提供乳腺上皮细胞，所 述乳腺上皮细胞已被修饰以表达一种或多种肝素合成酶和核心蛋白，和从乳腺上皮细胞收 集肝素。
[0009] 在另一个方面，提供了一种转基因非人哺乳动物，所述转基因非人哺乳动物已被 修饰以便在其乳腺中表达一种或多种肝素合成酶。在一个实施方式中，提供了一种转基因 非人哺乳动物，所述转基因非人哺乳动物已被修饰以便在其乳腺中表达一种或多种肝素合 成酶和核心蛋白。
[0010] 在另一个方面，提供了乳腺上皮细胞，所述乳腺上皮细胞已被修饰以表达一种或 多种肝素生物合成酶。在一个实施方式中，提供了乳腺上皮细胞，所述乳腺上皮细胞已被修 饰以表达一种或多种肝素生物合成酶和核心蛋白。
[0011] 在一个实施方式中，所述转基因哺乳动物是有蹄类。在另一个实施方式中，所述有 蹄类是山羊。在另一个实施方式中，所述有蹄类是牛。
[0012] 在提供任意方法、细胞或哺乳动物的一个实施方式中，所述肝素生物合成酶选自 下组：四糖产生物、重复单元产生物、重复单元修饰物、差向异构化物、硫酸化酶和支持酶。 在另一个实施方式中，四糖产生物是XTII、GalT-l或GlcAT-1。在另一个实施方式中，重复单 元产生物是EXT1聚合酶和EXT2聚合酶。在另一个实施方式中，重复单元修饰物是NDSTI和 NDSTII。在另一个实施方式中，差向异构化物是C5差向异构酶。在另一个实施方式中，硫酸 酶是3-OST、6-0ST或2-0ST。在另一个实施方式中，支持酶是UDPGDH。
[0013] 在提供任意方法、细胞或哺乳动物的另一个实施方式中，一种或多种肝素生物合 成酶和核心蛋白已被修饰以使得GPI(糖基磷脂酰肌醇)锚定被操纵。在一个实施方式中，将 GPI锚定加入核心蛋白以定向至膜。在另一个实施方式中，GPI锚定缺失以使其分泌进入乳 汁。在另一个实施方式中，肝素生物合成酶和核心蛋白已被修饰以使得在脂肪球膜中生产 肝素和生物合成酶。在另一个实施方式中，一个或多个肝素生物合成酶在乳启动子(milk promoter)的控制下。在另一个实施方式中，乳启动子是山羊β酪蛋白启动子。
[0014] 在一个方面，提供了根据所提供的任意一种方法生产的肝素。
[0015] 本发明的每个限制可以包括本发明的不同实施方式。因此，预期包括任意一个元 素或元素的组合的本发明的每个限制可以包括在本发明的每个方面中。本发明不限于将其 应用于下述说明书所述的或附图中所示的构造的细节和组成的排布。本发明能够有其他实 施方式和以不同方式实践或实施。而且，在本申请中使用的措辞和术语用于描述目的并且 不应被视为是限制性的。
[0016] 附图简述
[0017]附图仅是说明性的并且不需要用于本申请的实施。
[0018] 图1提供了肝素生物合成酶途径的示意图。
[0019] 发明详述
[0020] 在一个方面，本申请提供了用于生产肝素的方法、细胞和转基因非人哺乳动物。尽 管此前已有报道给予肝素可引起副作用，其可能有时是非常严重的，如出血、瘀点、紫癜或 瘀斑，但是令人吃惊的是本申请证实了低剂量和中剂量全身和乳腺输注肝素对哺乳动物的 健康和产奶量具有极小影响，从而允许在转基因哺乳动物中生产肝素。
[0021] 肝素是糖胺聚糖(GAG)家族成员，其由聚阴离子、多分散性、线性的由重复二糖单 元组成的多糖组成。在肝素中主要的二糖是艾杜糖醛酸（IdoA)和N-乙酰基-D-葡糖胺 (GlcNAc)，或者D-葡糖醛酸(GlcA)和N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)。然而，由于这些二糖的 进一步修饰，使得在肝素聚合物链中具有显著的异质性(见下文中对生物合成的描述）。肝 素通常由重量通常在3kDa至40kDa之间的约10-200个二糖组成（Sas isekharan等，Curr Opin Chem Biol 4:626-631(2000))<^Α(：如肝素能够与核心蛋白的丝氨酸残基共价结合， 作为在糖合成发生位置的锚定，得到称为蛋白糖胺的糖缀合物。
[0022] 肝素通常存在于细胞外膜并且在围绕着细胞的细胞外基质中。肝素与多种肝素结 合分子相互作用以条件多种生物过程，包括例如细胞生长、细胞分化、免疫、代谢、细胞信 号、炎症、凝血和癌症。已鉴定在无脊椎动物和脊椎动物中存在肝素和肝素样分子，并且从 很多物种中分离的分子似乎能够激发至少一些相同的生物过程例如抗凝血（参见例如 Medeiros等，Biochim Biophys Acta 1475(3) :287-294(2000)和Pejler等，J Biol Chem 262(24):11413-21(1987))〇
[0023] 肝素参与重要的生物过程(特别是凝血、炎症和癌症）导致使其作为药物使用。已 广泛地对肝素在凝血中的作用进行了研究。肝素是一种由嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生的 天然存在的抗凝剂。肝素通过阻止血液系统中的凝块形成和现有凝块扩大作为抗凝剂。这 通过肝素与抗凝血酶IIKAT)结合实现，其导致产生使得AT活化的构象改变。然后活化的AT 将凝血酶和参与凝血的其他蛋白酶灭活，阻止凝血起始或进一步凝血。肝素目前广泛作为 抗凝血药物使用，年用量超过100公吨（参见例如Laremore等，Curr Opin Chem Biol 13(5- 6) :633-640(2009))。肝素通常适用于例如深部静脉血栓和肺栓塞、急性冠状动脉综合征、 心房纤颤、心肺转流、血液滤过、中央置管或外周静脉导管。因为肝素与多种调控除了凝血 以外的其他过程的肝素结合蛋白相互作用，所以涉及使用肝素治疗的针对多种其他疾病的 临床试验正在进行中，例如成人呼吸窘迫综合征、过敏性鼻炎、哮喘和炎性肠病。此外，肝素 在动物模型中还显示出具有抗转移性，使其还具有用于癌症治疗的潜力(Borsig等，Proc Natl Acad Sci USA98(6):3352-3357(2000))。
[0024] 在通常情况下，在患者中使用的肝素是通过在屠宰牲畜中分离天然存在的肝素制 备的，因为人肝素在结构和功能上与其他哺乳动物肝素是类似的（参见例如Linhardt等， Biochemistry 31 (49): 12441-5(1992))。然而，在2008年含多硫酸软骨素污染的肝素导致 多名患者死亡（参见例如Sasisekharan等，Thromb Haemost 102:854-858(2009))。其结果 是，有必要开发一种从确定的和受控的来源生产肝素的替代方法。目前经过测试的代替从 屠宰牲畜中分离肝素的方法包括化学合成、化学酶合成和离体基于细胞的合成。然而，这些 方法具有缺点，因为它们是昂贵的、在技术上具有挑战性和/或无法囊括体内存在的各种肝 素(参见例如Laremore等，Curr Opin Chem Biol 13(5-6) :633-640(2009))。需要开放生产 肝素的替代方法。
[0025] 因此，本发明提供了一种生产肝素的方法，所述方法包括提供已被修饰以便在其 乳汁中表达肝素的转基因非人哺乳动物。在一个方面，本发明提供了一种生产肝素的方法， 所述方法包括提供已被修饰以便在其乳腺中表达一种或多种肝素生物合成酶的转基因非 人哺乳动物，和从所述转基因动物乳腺生产的乳汁中收集肝素。
[0026]本发明的另一个方面提供了一种生产肝素的方法，所述方法包括提供已被修饰以 便在其乳腺中表达一种或多种肝素生物合成酶和核心蛋白的转基因非人哺乳动物，和从所 述转基因动物乳腺生产的乳汁中收集肝素。
[0027]在一个方面，在转基因哺乳动物中生产肝素指增加肝素的表达使其高于在哺乳动 物中已存在的水平(例如在转基因山羊中生产升高水平的山羊肝素）。在另一个方面，在转 基因哺乳动物中生产肝素指生产不是在该哺乳动物中天然存在的肝素的直系同源物(例如 在转基因山羊或奶牛中生产的人肝素）。在另一个方面，在转基因哺乳动物中生产肝素指生 产不是在该哺乳动物中天然存在的混合肝素(例如使用山羊和人酶的组合在转基因山羊中 生产肝素）。因为肝素和肝素样分子已显示出激发类似的生物应答(例如用于治疗人疾病的 动物肝素和无脊椎动物肝素样分子的抗凝血性质），应意识到从转基因动物中获得的肝素 不限于人或非人哺乳动物肝素，还包括肝素的变体和肝素样分子。
[0028]在一个方面，本发明提供了一种生产肝素的方法，所述方法包括提供已被修饰以 表达一种或多种肝素生物合成酶的乳腺上皮细胞，和从所述乳腺上皮细胞收集肝素。
[0029]在另一个方面，本发明提供了一种生产肝素的方法，所述方法包括提供已被修饰 以表达一种或多种肝素生物合成酶和核心蛋白的乳腺上皮细胞，和从所述乳腺上皮细胞收 集肝素。
[0030]参与肝素生物合成（"肝素生物合成酶"）的主要的酶是本领域公知的（参见例如 Baik等，Metabolic engineering 14:81-90(2012))。认为生物合成途径至少涉及十二个酶 促步骤并且在图1中进行了概述。存在在其上发生糖合成的作为锚定使用的核心蛋白。这种 核心蛋白被转运至糖酶驻留在其中的尚尔基体。最初，将四糖键加入核心蛋白的Ser残基。 其通过经由四种不同的酶催化顺序加入完成，依次加入木糖，然后是两个半乳糖残基，随后 是葡糖醛酸。产生四糖的酶是XTI和ΧΤΠ ，用于将木糖加入核心蛋白上的Ser，B4GalT7(m， 4-半乳糖基转移酶)和B3GALT6(i31，3-半乳糖基转移酶），其加入半乳糖残基和B3GAT3(GlcA β1，3-葡糖醛酸基转移酶），其加入葡糖醛酸。在本申请中将产生四糖的酶称为四糖产生物 并且其包括表1中所列的基因。
[0031]下一步是加入GlcNAC，其确定将在蛋白上合成肝素或硫酸乙酰肝素。在一个替代 模式中，将酶EXTI和EXT2加入G1 cNAC和G1 cA重复单元，其导致肝素的聚合。在本申请中将聚 合链的酶称为"重复单元产生物"并且其包括表2中所列的基因。
[0032] 重复单元经由GlcNAC N-脱乙酰基酶和N-磺基转移酶（例如NDST I和NDST II)修 饰。NDST乙酰化和硫酸化选定的GlcNAC残基以生产GlcNS(NDST II有时与PAPS硫酸供体一 起工作）。在本申请中将该步骤中使用的酶称为重复单元修饰物并且并且其包括表3中所列 的基因。
[0033] 在下一个步骤中，其可以发生在利用重复单元修饰物修饰之前、修饰过程中或之 后，C5差向异构酶（"差向异构化物"）发挥作用将葡糖醛酸(Glc A)子集转化为艾杜糖醛酸 (IdoA)。差向异构化物包括表4中所列的基因。
[0034] 在这之后，一系列硫酸基转移酶发挥作用并修饰重复单元，将硫酸加入重复单元 子集。将在该步骤中使用的这些酶称为"硫酸化酶"，包括3-0-磺基转移酶、6-0-磺基转移酶 和2-0-磺基转移酶(分别为3-0ST、6-0ST和2-0ST)并且相关基因列于表5中。
[0035] 在进行这些修饰后，在肝素中存在的主要的修饰的和未修饰的二糖包括但不限于 GlcA-GlcNAc、GlcA-GlcNS、IdoA-GlcNS、IdoA(2S)-GlcNS、IdoA-GlcNS(6SWPIdoA(2S)- GlcNS(6S)〇
[0036] 适宜的四糖产生物的示例包括但不限于表1中的基因：
[0037]
[0038] 表 1
[0039] 适宜的重复单元产生物的示例包括但不限于表2中的基因。
[0040]
[0041]
[0042] 表 2
[0043] 适宜的重复单元修饰物的示例包括但不限于表3中的基因。
[0044]
[0045]
[0046] 表 3
[0047] 适宜的差向异构化物的示例包括但不限于表4中的基因。
[0048]
[0049] 表 4
[0050] 适宜的硫酸化酶的示例包括但不限于表5中的基因：
[0052]
[0053] 表 5
[0054] 用于合成肝素的核心蛋白的示例包括但不限于表6中所列的那些：
[0055]
[0056]
[0057] 应意识到酶序列可因物种而异。因而，例如，牛NDST I可以与人NDST I具有不同的 序列。在一些实施方式中，在本申请所述的方法中使用物种特异性酶。因而，例如，在转基因 山羊中使用山羊肝素生物合成酶。然而，在一些实施方式中，一个物种的肝素生物合成酶可 以用在不同的物种中。因而，例如，将人肝素生物合成酶用在（即表达)转基因哺乳动物中 (例如转基因山羊）。还应意识到不同物种的酶可以是"混合的和匹配的"。因而，在一些实施 方式中，转基因哺乳动物如转基因山羊可以具有人肝素生物合成酶和其他哺乳动物的肝素 生物合成酶作为转基因。
[0058] 从转基因动物中纯化肝素
[0059] 在一些实施方式中，从生产肝素的转基因动物的乳汁中纯化肝素。在一些实施方 式中，从转基因动物的乳汁中纯化肝素以使得所述肝素是基本上纯的。在一些实施方式中， 基本上纯的包括基本上无污染物。在一些实施方式中，污染物包括多硫酸软骨素。
[0060] 在一些实施方式中，肝素是使用柱层析纯化的。柱层析是本领域熟知的（参见基本 实验室技术单元6.2(2008)中用于通用层析的现行方案和1^4，119,774中肝素的纯化）。在 一些实施方式中，肝素是通过免疫共沉淀纯化的（参见细胞生物学单元7.2(2001)中的现行 方案）。在一些实施方式中，使用肝素结合抗体或其片段纯化肝素。
[0061 ]用于产生在乳汁中表达肝素的转基因动物的构建体
[0062] 在一些实施方式中，为了生产在利用核转移生产转基因动物(例如山羊）中使用的 含有构建体(例如编码一种或多种肝素生物合成酶或编码一种或多种肝素生物合成酶和核 蛋白）的原代细胞系，可以将该构建体转染至原代动物皮肤上皮细胞，对其进行克隆扩增和 完全鉴定以评估转基因拷贝数、转基因结构完整性和染色体整合位点。如在本申请中所使 用的，"核转移"指一种克隆方法，其中所述核从供体细胞移植进入去核卵母细胞。
[0063] 目标蛋白的编码序列（例如肝素生物合成酶或肝素生物合成酶和核心蛋白）可以 通过筛选来源于从序列数据库如NCBI、Genbank的所选动物(如有蹄类）的基因组材料或反 向翻译的信使RNA文库获得，或者通过肝素生物合成酶的序列获得，等等。可以将序列克隆 进入适宜质粒载体并扩增进入适宜宿主生物体，如大肠杆菌。
[0064]在载体扩增后，可以切除编码该基因的DNA，将其从剩余载体中纯化并且引入能够 用于生产转基因动物的表达载体中。在载体扩增后，还可以使用适宜的5'和3'控制序列切 除DNA构建体，将其从剩余载体中纯化并且用于生产已将所需的表达构建体整合至其基因 组的转基因动物。相反地，某些载体，如酵母人工染色体(YAC)，没有必要从载体中除去已组 装的构建体;在这种情况下可以将扩增的载体直接用于制备转基因动物。可以将编码序列 与控制序列可操作地连接，其能够使编码序列在转基因非人哺乳动物的乳腺中表达。
[0065] 适于指引在转基因动物乳汁中生产肝素生物合成酶的DNA序列可以携带来源于天 然来源的乳蛋白的5'-启动子区域。这个启动子由此在激素和组织特异性因子的控制下并 且是哺乳期乳腺组织中最活跃的。在一些实施方式中，该启动子是山羊β酪蛋白启动子。该 启动子可以与指示蛋白前导序列产生的DNA序列可操作地连接，其指示转基因蛋白从乳腺 上皮分泌进入乳汁。在一些实施方式中，可以加入来源于天然分泌乳蛋白的3'-序列以改善 mRNA的稳定性。
[0066] 如在本申请中所使用的，"前导序列"或"信号序列"是编码蛋白分泌信号的核酸序 列，当与编码转基因蛋白的下游核酸分子可操作地连接时指引分泌。前导序列可以是天然 前导序列、来源于人工的前导序列，或者可以来自与指引转基因编码序列的转录使用的启 动子相同的基因，或来自从细胞如哺乳动物乳腺上皮细胞中正常分泌的其他蛋白。
[0067] 在一些实施方式中，启动子是乳特异性启动子。如在本申请中所使用的，"乳特异 性启动子"是天然地指引在将蛋白分泌进入乳汁的细胞中（例如乳腺上皮细胞)的基因表达 的启动子，并且包括例如酪蛋白启动子，例如α_酪蛋白启动子(例如aS-Ι酪蛋白启动子和α S2-酪蛋白启动子）、β_酪蛋白启动子（例如山羊β酪蛋白基因启动子（DiTullio等， BioTechnology 10:74-77(1992)))、γ-酪蛋白启动子、κ-酪蛋白启动子、乳清酸性蛋白 (WAP)启动子(Gordon等，BioTechnology 5:1183-1187(1987))、β-乳球蛋白启动子(Clark 等，BioTechnology 7:487-492( 1989))和α-乳清蛋白启动子（Soulier等，FEBS Letts · 297: 13(1992))。在该定义中还包括特异性在乳腺组织中活化的启动子，例如小鼠乳腺肿瘤病毒 (MMTV)长末端重复(LTR)启动子。
[0068] 如在本申请中所使用的，当其以这样一种方式共价连接以安置在调控序列的影响 或控制下编码序列的表达或转录时，将编码序列和调控序列称为"可操作地连接"。为了使 编码序列翻译成功能性蛋白，将编码序列与调控序列可操作地连接。如果诱导5'调控序列 中的启动子导致编码序列的转录和如果两个DNA序列之间连接的性质（1)不会导致引入移 码突变，（2)不会被指引编码序列转录的启动子区域的能力干扰或(3)不会被翻译成蛋白的 相应RNA转录本的能力干扰，则将两个DNA序列称为是可操作连接的。因此，如果启动子区域 能够影响DNA序列的转录以使得所得到的转录本可以翻译成所需的蛋白或多肽，则启动子 区域与编码序列是可操作地连接的。
[0069] 如在本申请中所使用的，"载体"可以是任意数量的核酸，在其中可以通过限制和 连接插入所需序列，以供在不同基因环境之间转运或在宿主细胞中表达。载体通常由DNA组 成，但是RNA载体也是可用的。载体包括但不限于质粒和噬菌粒。克隆载体是能够在宿主细 胞中复制的，并且其进一步的特征为具有一个或多个限制性内切酶位点，载体在其中可以 以可确定的方式切割并且在其中可以将所需的DNA序列连接，以使得新的重组载体保留其 在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情况下，所需序列的复制随着宿主菌中质粒拷贝数的 增加可以发生多次，或者随着通过有丝分裂产生宿主复制物每个宿主仅发生一次。在噬菌 体的情况下，复制在溶菌期可以主动发生或在溶原期被动发生。表达载体是在其中所需DNA 序列可以通过限制和连接插入以使得其与调控序列可操作地连接并且可以作为RNA转录本 表达。载体还可以含有一个或多个适于在细胞的鉴定中使用的标记物序列，其已被或未被 该载体转化或转染。标记物包括例如编码对抗生素或其他化合物具有抗性或敏感性导致其 增加或减少的蛋白的基因，编码其活性可以通过本领域公知的标准测定方法检测的酶的基 因（例如β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶），和对转化或转染细胞、宿主、菌落或噬菌斑的表型产 生可见影响的基因。优选的载体是那些能够自主复制并且表达在与之可操作地连接的DNA 区段中存在的结构基因产物的那些。
[0070] 转基因动物和乳腺上皮细胞
[0071] 在一个方面，本申请提供了一种在其乳汁中生产肝素的转基因非人哺乳动物。特 别地，本申请提供了一种转基因非人哺乳动物，所述转基因非人哺乳动物在乳腺中表达一 种或多种肝素生物合成酶。本申请还提供了一种转基因非人哺乳动物，所述转基因非人哺 乳动物在乳腺中表达一种或多种肝素生物合成酶和核心蛋白。
[0072] 在另一个方面，提供了乳腺上皮细胞，所述乳腺上皮细胞表达一种或多种肝素生 物合成酶。还提供了乳腺上皮细胞，所述乳腺上皮细胞表达一种或多种肝素生物合成酶和 核心蛋白。
[0073] 可以根据本领域公知的方法产生转基因动物。在一个实施方式中，通过将原代细 胞与单独的构建体共转染产生该动物。然后可以将这些细胞用于核转移。或者，可以使用显 微注射产生转基因动物，并且可以将构建体注射。
[0074] 适于转基因表达的动物包括但不限于山羊、绵羊、野牛、骆驼、奶牛、家兔、水牛、马 和羊驼。适宜的动物还包括牛、山羊和绵羊，其分别涉及不同种类的奶牛、山羊和绵羊。适宜 的动物还包括有蹄类。如在本申请中所使用的，"有蹄类"是或属于偶蹄类，通常是食草的四 足哺乳动物，包括但不限于绵羊、山羊、牛和马。
[0075] 克隆将导致产生大量的转基因动物一一其均能够生产肝素生物合成酶或其他目 标基因构建体。生产方法包括使用克隆的动物和这些动物的后代。在一些实施方式中，克隆 的动物是山羊或牛。克隆还包括胎儿的核转移、核转移、组织和器官抑制以及形成嵌合后 代。
[0076] 克隆过程的一个步骤包括将细胞的基因组转移至去核的卵母细胞中，所述细胞含 有编码一种或多种肝素生物合成酶或一种或多种肝素生物合成酶和核心蛋白的转基因。如 在本申请中所使用的，"转基因"指任意核酸分子片段，其人工插入细胞或其祖代，并且成为 由该细胞发育成的动物基因组的一部分。此类转基因可以包括相对于转基因动物部分或全 部是外源性(即外来)的基因，或者可以是与该动物的内源性基因具有同一性的基因。
[0077] 适宜的卵母细胞的哺乳动物来源包括山羊、绵羊、奶牛、家兔、非人灵长类等等。优 选地，卵母细胞来自有蹄类，和最优选地来自山羊或奶牛。分离卵母细胞的方法是本领域所 熟知的。主要地，该过程包括从哺乳动物例如山羊的卵巢或生殖道分离卵母细胞。有蹄类动 物卵母细胞易于获得的来源是来自激素诱导的雌性动物。为了成功使用技术如基因工程、 核转移和克隆，可以优选地在体内使卵母细胞成熟，随后可以将这些细胞作为核转移的受 体细胞使用，以及随后使用精子细胞使其受精以便发育成胚胎。已成功将已在体内成熟为 中期II阶段的卵母细胞用于核转移技术。主要地，通过手术从非超排卵或超排卵的动物中 收集成熟的中期II卵母细胞，所述动物在几小时前开始发情或注射了人绒毛促性腺激素 (hCG)或类似激素。
[0078] 用于预测在乳腺中表达的重组分子数量和质量的一个工具是通过诱导泌乳 (Cammuso，Gavin 等，Animal Biotechnology 11(1):1-17( 1999))。诱导泌乳能够从转基因 产生的早期阶段而不是从由妊娠导致的第一自然哺乳期(将在一年以后)对蛋白进行表达 和分析。诱导泌乳可以通过激素或人工进行。
[0079] 在一些实施方式中，根据本申请提供的方法生产的肝素组合物还包含乳汁或部分 纯化的乳汁。在一些实施方式中，本申请提供的方法包括从转基因动物的乳汁中分离肝素 的步骤（参见例如Pollock等，Journal of Immunological Methods,231(1-2) :147-157 (1999))。
[0080] 通过下述实施例对本发明进行了进一步解释，决不应将其解释为进一步的限制。 在本申请中引用的所有参考资料(包括参考文献、授权的专利、公开的专利申请和在审的专 利申请）的全部内容在此明确地通过引用并入，特别是教导了上文引用的。然而，任何参考 资料的引用均并非旨在承认该参考资料是现有技术。 实施例
[0081 ] 1.安全性研究
[0082] 1.1测试肝素对乳腺的影响
[0083] 对肝素对哺乳期乳腺的影响进行了评估。哺乳动物乳腺中山羊抗凝血酶(AT)的水 平为约2g/ml，发现其占血液的1%。可以以对应于lmg/ml、200mg/ml和50mg/ml生产水平的 水平将肝素输注进入哺乳期山羊的乳腺中。由于山羊的乳腺能容纳1升乳汁，因而可以在挤 奶和移除乳汁次日输注肝素(输注lg、200mg和50mg高分子量肝素）。可以连续一周每日输注 肝素或直至在乳腺或血液中观察到毒性。
[0084] 可以对待测动物乳汁和血液中肝素的水平进行检测。早期的研究发现一些在乳腺 中产生的蛋白能够以在乳汁中1%的水平渗漏进入循环中。还可以对整个测试期间乳汁的 体积进行监测以确定是否肝素影响泌乳。还可以对动物继续挤奶一周以检测对乳汁体积的 长期影响。还可以每日获得血液样品并通过测定aPTT(活化部分凝血活酶时间）监测肝素的 浓度和凝血性质。可以使用不同的肝素水平测定山羊血液中的aPTT。
[0085] 可以进行对照实验，在其中IV注射给予山羊肝素。还可以确定血液中肝素水平导 致的出血问题。
[0086] 1.2肝素在哺乳期山羊中的毒性研究
[0087]进行一项研究以确定是否在乳腺中生产肝素对生产动物也具有显著影响。通过转 基因产生的蛋白能够对乳腺直接地产生潜在影响。此外，已知蛋白可能渗漏进入循环系统。 为评估全身和输注肝素对山羊的潜在影响，进行了如下所述的研究。在两项实验期间每日 至少一次对各只产乳动物抽血和收集乳汁以确定通过全身和乳房输注途径施用肝素的影 响。利用血清计算由aPTT指示的肝素水平和凝血时间。测定乳汁体积并确定乳汁中的肝素 水平。此外，注意乳汁的质量(颜色，粘稠度，凝块、血液或乳腺炎的证据）。每日评估每只动 物的一般健康情况，包括直肠温度。由于肝素是一种抗凝剂，因而还要每日检查动物的任何 大体出血体征，如异常瘀伤或瘀斑。
[0088] 方法
[0089] 动物
[0090]每日使用约四镑特殊配方的素食山羊饲料饲养6只正常的、非转基因、哺乳期山 羊，并且给予其提摩西和苜蓿干草的组合以及自由饮水和取食平地和矿化的盐块。因为这 些是哺乳期动物，所以从其达到之日起每日挤奶。每日测定乳汁体积并记录直肠温度。第一 次或第二次实验前的乳汁体积和直肠温度可以参见下面的表7。
[0091] 血液收集
[0092] 人工束缚动物，以使得能够辨认出其颈静脉。将21号3/4英寸蝶形针头（BD Vacutainer Blood Collection Set Ref 367251，Franklin Lakes，NJ USA)插入血管中， 并且将血液收集至2-1.8ml梓檬酸钠真空采血管中（BD Vacutainer, Buffered Na Citrate，Franklin Lakes，NJ USA)。收集后(或收集血液和给予肝素后--见下文)拔出针 头，并按压收集位点以止血。各程序后均给予动物正强化(奖励粮食）。
[0093]静脉施用肝素
[0094] 如上所示将动物束缚。对上文所述的用于血液收集的蝶形针头进行设计，以使得 可以通过真空采血管收集血液，或者可以将其与注射器连接。因此，收集血液后，将与血液 收集管连接的针头部分除去，并连接含有肝素的注射器，缓慢注射肝素。通过针头加入 0.4ml无菌生理盐水冲洗以确保全部肝素被递送。在这种方式中，将单一针头位置用于血液 收集和肝素注射，避免了与第二个注射位点相关的任何额外的应激。
[0095] 表7:在第一次或第二次实验之前动物的乳汁体积(升)和体温(华氏度）。
[0096]
[0097] 乳汁收集
[0098] 从山羊送达之日起，每日一次使用便携式挤奶器为所有山羊挤奶。在进行这一程 序时，将动物置于挤奶台上。挤奶的一般步骤如下。挤奶人员彻底洗净双手并带上乳胶检查 手套。使用纸巾和水清洁乳房。然后使用干净的纸巾擦干乳房。使用乙醇湿巾再次清洁乳 头，进行预浸(FS_106Sanitizing Teat Dip，IBA Inc.，Millbury，MA USA)并使其干燥。用 手从乳头取少量样品以评估乳汁质量，进行痕色测试并将其冷冻以供进一步分析。然后将 挤奶器与乳房连接。挤奶后，使用乙醇清洁乳头，并在挤奶后应用消毒剂(Ultra Shield Sanitizing Barrier Teat Dip, IBA Inc.，Millbury, MA USA)。确定乳汁体积，冷冻少量样 品并保存在-80 °C卧式冰柜中以供后续测试。
[0099] 实验1:对全身施用肝素的影响的研究
[0100] 连续6天每天在8AM、12点和4PM三次静脉（IV)注射给予两只山羊肝素。日程安排如 下:连续两天，低剂量肝素，1，500单位(0.151111[10,000单位/1111]1￥，1'10[每日三次])，随后 是连续两天中剂量，6，000单位(0.6ml [ 10，000单位/ml ] IV，TID)，最后是连续两天高剂量肝 素31，000单位(3.11111[10,000单位/1111]1￥，1'10)。这些剂量相当于在创建的用于生产的转基 因动物乳汁/乳腺中靶向表达水平的1%。在各次注射肝素前从颈静脉取血。此外，每日为山 羊挤奶一次并收集样品。在这项实验结束后且将其纳入实验2之前的一天对全身给予肝素 的山羊挤奶。
[0101] 实验2:乳房输注肝素
[0102] 将6只哺乳期的山羊分成3组每组2只山羊。每日使用挤奶器为所有山羊挤奶，并收 集血样。在挤奶和收集血样之后，使用乳头输注导管(Udder Infusion Cannula，IBA Inc.， Millbury，MA USA)向山羊的乳房输注肝素。各组输注给予低剂量（25,000单位）、中剂量 (100,000单位)或高剂量(500,000单位)肝素，其相当于基于每升乳汁探讨3个不同的表达 水平。每只乳房的输注体积小于50ml。这个方案共进行7天。在乳房输注后，在对山羊挤奶8 天，收集在此期间的血样和乳汁样品。
[0103] 1.3 结果
[0104] 实验 1
[0105] 在IV施用低剂量和中剂量肝素期间，aPTT小幅升高。在施用高剂量肝素后aPTT急 剧上升。在施用高剂量期间，4个中午和4PM样品中的3个高于使用凝血仪能够计算得到的最 大aPTT(>124秒）。过夜后第二高AM样品(AM给予肝素之前）的aPTT时间回落至较为正常的水 平。任何剂量对乳汁体积和体温均没有影响。在任何时间均无瘀斑或异常出血的证据。仅在 第2天的高剂量给药期间在中午和4PM检查时对一只动物进行身体检查发现肺音增加。一旦 高剂量全身给药结束，这些肺音消失。
[0106] 实验 2
[0107] 可以按照如下所示对输注肝素的产奶量结果进行分析。在所有情况下，在将肝素 输注进入乳房期间乳汁体积开始出现下降，并且在停止输注肝素后似乎有所恢复。最大的 下降出现在输注给予最大量肝素的一只动物中（根据输注前生产的乳汁体积计算输注肝素 的量）（如下表8所示）。表8还显示了输注肝素的量与aPTT之间的关系。在施用前3天aPTT与 输注肝素的量具有相关性并且出现峰值，然后下降。在肝素乳房输注后的"清洗"期期间 aPTT返回至正常水平(20-40秒）。肝素输注水平与后肝素 aPTT水平似乎没有直接的相关性。 [0108] 表8:对于三个输注水平相对于aPTT时间的每个乳房每天的乳汁体积、肝素单位和 输注mL。星号(*)表示10,000单位/mL，其他为20,000单位/111匕乳汁体积以升计。1^表示每个 乳房输注肝素的mL数。aPTT时间以秒计。
[0109]
[0110] 1.4 结论
[0111] 实验 1
[0112] 本申请已证实全身施用肝素对体温或产奶量具有极小(如果有的话)影响。全身给 予低水平和中水平肝素似乎逐渐将aPTT增加至40-50秒(正常范围为20-40)。全身给予高水 平肝素注射后对aPTT具有较大影响，通常使凝血时间增至超出仪器能够检测的范围（> 124sec)。但是，过夜后(两个高剂量之间)aPTT降至较低的40s，其与全身给予低水平和中水 平肝素时所见的结果类似。大体上无明显的出血体征，如口腔粘膜、外阴或乳房瘀点。在给 予高水平肝素期间，在一只山羊中能够听见增加的"噼里啪啦"的肺音。然而，在此期间没有 从鼻中排出任何血性分泌物的迹象。
[0113] 从这些结果中，能够得出令人吃惊的结论，全身给予肝素6天不会导致已报道的肝 素的副作用瘀点、紫癜或瘀斑，并且不用将其从生产肝素的转基因哺乳动物中排除。
[0114] 实验 2
[0115] 研究发现连续1周每日一次将低剂量或中剂量肝素输注至乳房对体温具有极小影 响，不会产生任何出现体征并且不会使aPTT增至超过55秒。输注高水平肝素显著增加 aPTT， 并且输注最高水平似乎具有全身影响，包括使体温升高和增加呼吸音。使用最高水平输注 给予山羊的乳房似乎产生炎症应答并且显著降低产奶量。然而，在这项实验中，将山羊奶挤 出并将未经稀释的纯肝素直接输注进入乳房。在生产肝素的转基因山羊中，蛋白是由乳汁 生产的，因而是被稀释的。此外，由山羊自身生产的肝素可能并不等同于所输注的外源性肝 素。
[0116] 从这些研究中，能够得出结论，低剂量和中剂量全身和输注肝素对山羊的健康和 产奶量具有极小影响并且不用将其从生产肝素的转基因哺乳动物中排除。
[0117] 2.生产肝素的转基因动物的产生
[0118] 可以将携带具有不同修饰的酶的构建体引入来自已产生核心蛋白的动物品系的 基因组中。可以以假定以四糖合成起始和磺基转移酶结束出现在通路中的顺序引入构建 体。在各点上(例如加入新酶之后），可以将肝素从转基因雌性动物的乳汁中分离。
[0119] 2.1四糖合成、EXT I和EXT II、NDST I和NDST II、磺基转移酶
[0120] 可以将针对参与四糖合成的酶、EXT I和EXT II、NDST I和NDST II以及磺基转移 酶的酶的编码DNA连接至β酪蛋白载体并将该构建体显微注射进入已经携带核心蛋白的动 物胚胎中。携带新构建体的子代能生长至成熟并且经检测其能够将四糖添加在核心蛋白 上。还可以将编码ΕΧΤΙ和ΕΧΤΙΙ的基因连接至酪蛋白载体并将该构建体显微注射进入已携 带核心蛋白的动物胚胎中。类似地，可以将这种方法用于编码NDST I和NDST II以及磺基转 移酶的基因。
[0121] 2.2具有多种肝素合成途径基因的转基因动物的产生
[0122] 可以将携带一组酶(例如NDSTI、NDSTII和C5差向异构酶）的转基因品系与携带另 一组(例如核心蛋白以及四糖合成酶和EXT I和EXT II)的独立的转基因动物品系杂交。然 后可以通过繁殖程序鉴定用于补充乳腺中现有肝素合成活性的一组酶。
[0123] 在独立、平行的程序中，可以对携带该途径所需所有基因的较大构建体(使用BAC 或YAC)进行组装。然后可以将这种较大的构建体引入动物基因组中。已将这种方法成功用 于构建携带较大的多重基因阵列(例如免疫球蛋白基因座)的转基因动物。
[0124] 2.3分泌过程
[0125] 大多数糖胺聚糖蛋白是膜结合的或细胞内的。
[0126] 还可以对可溶性形式进行工程改造以辅助分泌。例如，使用GPI锚定将一些GAG蛋 白（蛋白多糖)连接至细胞表面。可以将锚定位点缺失以使得能够生产可溶性版本。
[0127] 脂肪球分泌:可以在脂肪球膜中生产膜蛋白。
[0128] 2.4生产肝素的大量转基因动物的产生
[0129] 可以通过体细胞核转移(克隆)将构建体引入山羊或奶牛的基因组中。与奶牛相比 转基因山羊具有产生时间更短的优势。但是，转基因奶牛每只动物产生的乳汁约为10倍并 且具有增强的可扩展性。而且，尽管与山羊相比奶牛的产生时间更长，可以通过对牛犊进行 激素诱导获得显著增加的奶量，以抵消一些产生时间对开发周期的影响。
[0130] 可以将较大的表达构建体转染进入细胞如成纤维细胞，并选择成功的克隆。然后 可以针对成功掺入全部相关肝素生物合成基因的这些克隆细胞进行筛选。该克隆程序能够 导致产生大量携带肝素途径的创建者。可以在山羊2个月（或牛6个月）时对其进行诱导以确 定是否已成功对核心蛋白进行修饰以便在该大型动物的乳腺中形成肝素。
[0131] 等效物
[0132] 认为前述书面的说明书足够使本领域技术人员实施本发明。不能将本发明限制在 所提供的实施例的范围，因为实施例旨在说明本发明的某些方面和实施方式。其他功能上 等效的实施方式在本发明的范围内。除了本申请显示和描述的那些以外，本发明的不同修 订在前述描述的基础上对本领域技术人员将是显而易见的并且落入所附权利要求的范围 内。本发明的优势和目的并非必需被本发明的每个实施方式所涵盖。
【主权项】
1. 一种生产肝素的方法，所述方法包括 提供在其乳汁中生产肝素的非人转基因哺乳动物， 和 从所述转基因哺乳动物乳腺生产的乳汁中收集肝素。2. -种生产肝素的方法，所述方法包括 提供一种非人转基因哺乳动物，所述非人转基因哺乳动物已被修饰以便在其乳腺中表 达一种或多种肝素生物合成酶，和 从所述转基因哺乳动物乳腺生产的乳汁中收集肝素。3. -种生产肝素的方法，所述方法包括 提供一种非人转基因哺乳动物，所述非人转基因哺乳动物已被修饰以便在其乳腺中表 达一种或多种肝素生物合成酶和核心蛋白，和 从所述转基因哺乳动物乳腺生产的乳汁中收集肝素。4. 根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述转基因哺乳动物是有蹄类。5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述有蹄类是山羊。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述有蹄类是牛。7. -种生产肝素的方法，所述方法包括 提供乳腺上皮细胞，所述乳腺上皮细胞已被修饰以表达一种或多种肝素生物合成酶， 和 从所述乳腺上皮细胞收集肝素。8. -种生产肝素的方法，所述方法包括 提供乳腺上皮细胞，所述乳腺上皮细胞已被修饰以表达一种或多种肝素生物合成酶和 核心蛋白，和 从所述乳腺上皮细胞收集肝素。9. 一种转基因非人哺乳动物，所述转基因非人哺乳动物在其乳汁中生产肝素。10. -种转基因非人哺乳动物，所述转基因非人哺乳动物已被修饰以便在其乳腺中表 达一种或多种肝素生物合成酶。11. 一种转基因非人哺乳动物，所述转基因非人哺乳动物已被修饰以便在其乳腺中表 达一种或多种肝素生物合成酶和核心蛋白。12. 根据前述任意一项权利要求所定义的转基因非人哺乳动物。13. 乳腺上皮细胞，所述乳腺上皮细胞已被修饰以表达一种或多种肝素生物合成酶。14. 乳腺上皮细胞，所述乳腺上皮细胞已被修饰以表达一种或多种肝素生物合成酶和 核心蛋白。15. 根据前述任意一项权利要求所述的方法、哺乳动物或细胞，其中一种或多种肝素生 物合成酶在乳启动子的控制下。16. 根据权利要求15所述的方法、哺乳动物或细胞，其中所述乳启动子是山羊β酪蛋白 启动子。17. 根据前述任意一项权利要求所述的方法生产的肝素。18. -种组合物，所述组合物包含权利要求17所述的肝素。19. 根据权利要求18所述的组合物，还包含乳汁。
【文档编号】C12P21/06GK105828603SQ201480070327
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2014年12月19日
【发明人】H.M.米德, W.G.加文
【申请人】Lfb美国股份有限公司