川硬皮肿腿蜂对花椒虎天牛幼虫的生物防治方法
【专利摘要】本发明公开了一种川硬皮肿腿蜂对花椒虎天牛幼虫的生物防治方法，属于生物防治技术领域，将川硬皮肿腿蜂经花椒挥发物学习处理，具体如下：将正己烷收集的健康枝条与虫粪木屑混合物挥发成分设置5个浓度梯度，共计10个处理；在25℃下，川硬皮肿腿蜂蛹期为20d，在幼虫结茧15天后，挑选出结茧较佳的指形管，每个处理取10μL混合溶液滴于滤纸条上，待溶液挥发后，将滤纸片置于指形管中用棉花封存，成虫羽化后当天取出。本发明采用寄生蜂的生物防治方法其不仅克服了物理与化学防治方法的缺点，而且其目的在于控制害虫种群数量，而不是对害虫的彻底消灭，在维持生态平衡上具有重要意义。
【专利说明】
川硬皮肿腿蜂对花椒虎天牛幼虫的生物防治方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物防治技术领域，特别涉及一种川硬皮肿腿蜂对花椒虎天牛幼虫的 生物防治方法。
【背景技术】
[0002] 姜川硬皮肿腿蜂（Sc 1 eroderma s i chuanens i s Xiao )属膜翅目肿腿蜂科 (Bethylidae)天牛肿腿蜂属(Scleroderma)。由四川农业大学森保实验室周祖基、曾垂慧教 授发现于四川，中国林科院森保专家萧刚柔先生1995年鉴定为新种并命名。是一种能防治 杉综天牛（Callidium villosulum F·)、粗鞘双条杉天牛（Semanotus sionanster Gressitt)、双条杉天牛（S.bifasciatus Motschulsky)、花椒虎天牛（Clytus valiandus F)等钻駐性害虫的寄生性天敌昆虫。目前和管氏肿腿蜂(Scleroderma guaui Xiao et Wu) 一起广泛应用应用于松墨天牛（Monochamu salternatus Hope)、花椒虎天牛（Clytus valiandus Fairmaire)、青杨天牛(Saperda populnea L·)、双条杉天牛等林业害虫的生物 防治。该蜂在自然界数量少，分布范围窄，需要在室内大量繁殖，才能对害虫进行有效的控 制。自发现以来已分别对川硬皮肿腿蜂成虫及幼虫形态学、生物学、对环境的适应性进行了 研究，发现该蜂适应力强，寄生率高，寄主范围广，繁殖力强，是防治天牛及部分钻蛀性害虫 的理想天敌，具重要的生物防治价值。
[0003] 花椒虎天牛在四川花椒各产地皆有分布，主要危害5年生以上花椒树 (2已111：11〇1541111113111^631111111|&?；[111)，10年生以上椒树危害率最高。该虫主要取食树干基部韧 皮部或多年生主侧枝，未见危害1年~2年生嫩枝。被害株基干部常被多头幼虫共同危害，当 其围绕树干韧皮部蛀食一圈后，造成整株树的枯死。越西县花椒420万株，遭受花椒虎天牛 危害的危害率达56.35%，其中，每年被害致死的死亡率为13.92%。仅在四川汉源县每年因 该虫危害导致近8%的花椒树死亡，且多是成年挂果树，年经济损失300余万元。目前对于花 椒虎天牛的防治主要以人工捕杀成虫幼虫、诱捕器捕杀、化学防治等的物理与化学方法。但 是这些方法比较费时费力，污染环境，最终也无法有效控制花椒虎天牛的危害。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供一种川硬皮肿腿蜂对花椒虎天牛幼虫的生物防 治方法，用以解决人工捕杀成虫幼虫、诱捕器捕杀、化学防治等的物理与化学方法费时费 力，污染环境，最终也无法有效控制花椒虎天牛的危害。
[0005] 为解决以上问题，本发明采用的技术方案如下：一种川硬皮肿腿蜂对花椒虎天牛 幼虫的生物防治方法，将川硬皮肿腿蜂经花椒挥发物学习处理，具体如下:将正己烷收集的 健康枝条与虫粪木肩混合物挥发成分设置5个浓度梯度，共计10个处理;在25°C下，川硬皮 肿腿蜂蛹期为20d，在幼虫结茧15天后，挑选出结茧较佳的指形管，每个处理取10yL混合溶 液滴于滤纸条上，待溶液挥发后，将滤纸片置于指形管中用棉花封存，成虫羽化后当天取 出。
[0006]作为优选，5个浓度梯度如下:0.01g/mL，0. lg/mL，lg/mL，10g/mL，100g/mL。
[0007] 作为优选，所述的滤纸条规格为2cm X 0 · 5cm。
[0008] 本发明的有益效果:一种川硬皮肿腿蜂对花椒虎天牛幼虫的生物防治方法，现有 技术是直接用防治对象的虫粪作为味源，本发明采用仪器将虫粪直接提取为溶剂，再滴于 饲养川硬皮肿腿蜂试管的滤纸片上，这样更便于大规模的对川硬皮肿腿蜂进行驯化处理， 而且目标性更明确。
[0009] 本发明采用了经花椒挥发物学习处理的川硬皮肿腿蜂防治方法，有利于天敌增 殖，可提高生防效果。因此，采用寄生蜂的生物防治方法其不仅克服了物理与化学防治方法 的缺点，而且其目的在于控制害虫种群数量，而不是对害虫的彻底消灭，在维持生态平衡上 具有重要意义。
【附图说明】
[0010] 图1为羽化期经历味源A的川硬皮肿腿蜂对各味源的行为反应；
[0011] 注:X2检验中的"n. S"表示P>0.05，"*"表示P〈0.05 ; A气味源为花椒枝条挥发物， A1-A5分别为不同浓度0 · 01g/mL、0 · lg/mL、lg/mL、10g/mL、100g/mL。
[0012] 图2为无学习经历蜂对味源A的行为反应；
[0013] 图3为经历味源B的肿腿蜂对各味源的行为反应；
[0014]注:B气味源为花椒虎天牛虫粪木肩混合提取物，B1-B5分别为不同浓度0.01g/mL、 0·1g/mL、1g/mL、10g/mL、100g/mL 〇
[0015] 图4为无学习经历蜂对味源B的行为反应。
【具体实施方式】
[0016] 为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下参照附图并举实施例，对 本发明做进一步详细说明。
[0017] 1供试虫源与味源
[0018] 1.1 虫源
[0019]供试肿腿蜂为四川农业大学森林保护省级重点实验室用黄粉虫（Tenebrio molitonL.)蛹繁殖的川硬皮肿腿蜂雌成蜂，于肿腿蜂即将羽化时，挑选蜂量中等、蜂茧干净 无污染的繁蜂管置于25±1°C，相对湿度60%~70%的人工气候箱中培养供试。
[0020] 1.2味源
[0021 ]采集5年生以上的花椒树的健康枝条和被花椒虎天牛为害枝条的天牛虫奠木肩混 合物，材料采用保鲜袋密封，置于4 °C冰箱中保存备用。
[0022] 1.3收集
[0023]用采样袋（Oven Bags，美国Reynolds公司）分别套住不同处理的健康花椒枝条 (36g)和天牛虫奠木肩混合物(36g)，在采样袋两对角插入Tanex-TA填充的玻璃管(吸附剂 50mg，60~80目；玻璃管外径6mm、长85mm，美国Supleco公司）和活性碳空气过滤管，并用 Teflon管分别连接大气采样器(QC-1型大气采样仪，北京劳动保护科学研究所)的进、出气 口，以0.5L · mirT1的空气流速，动态吸附采集6h。然后，用5ml重蒸乙醚(化学纯，成都市科龙 化工试剂厂)洗脱，N 2吹送浓缩至2ml，用于行为反应测定。
[0024] 2川硬皮肿腿蜂对挥发性信息化合物的学习效应
[0025] 2.1川硬皮肿腿蜂对挥发性信息化合物的学习经历
[0026]将正己烷收集的健康枝条与虫粪木肩混合物挥发成分设置5个浓度梯度:0.01g/ mL，0. lg/mL，lg/mL，10g/mL，100g/mL;共计10个处理。在25°C下，川硬皮肿腿蜂蛹期为20d， 在幼虫结茧15天后，挑选出一定数量结茧较佳的指形管，每个处理取10yL混合溶液滴于2cm X 0.5cm的滤纸条上，待溶液挥发后，将滤纸片置于指形管中用棉花封存，成虫羽化后当天 取出。
[0027]这个方法是和现有技术是不同的，现有技术是直接用防治对象的虫粪作为味源， 本发明采用仪器将虫粪直接提取为溶剂，再滴于饲养川硬皮肿腿蜂试管的滤纸片上，这样 更便于大规模的对川硬皮肿腿蜂进行驯化处理，而且目标性更明确。
[0028] 2.2川硬皮肿腿蜂对所经历挥发物的触角电位生理反应
[0029]触角电位测定采用荷兰Syntech公司生产的触角电位仪。测定前用解剖刀将川硬 皮肿腿蜂触角自柄节从头部挑出；用Spectra 360导电胶将其固定在PR(GainlO X )电极上， 气味管与触角相距lcm。测定方法按照杜永均等[11]的方法进行。用微量取样器抽取10μ1溶 液，均匀地滴在2cmX0.5cm的滤纸条上，放入10cm长的样品管中，样品管末端连接气体刺激 控制装置。待基线稳定后给予刺激，每次刺激时间为〇. 5s，刺激间隔为30s，以保证触角感受 能够完全恢复。实验每处理测试触角6根，每样品平均刺激5次。以重蒸正己烷为对照，将每 一样品观测值的平均数除以前后2次对照测定值的平均值即得EAG反应相对值。
[0030] 2.3川硬皮肿腿蜂对所经历挥发物的行为反应
[0031]采用?'型嗅觉仪测定川硬皮肿腿蜂行为反应。?'型玻璃管长臂l〇cm，两臂长 5cm，内径均为lcm，两臂夹角75°，交叉处由标准磨口制成，两侧臂分别用Teflon管与10cm长 的样品管相连。一样品管放置气味源，另一样品管设为空白。样品管用Teflon管依次连接蒸 馏水加湿瓶(300mL)，填装活性炭的空气净化瓶(500ml)，然后连接到大气采样器排气口。控 制空气流0.1-0.2L · min-1，测量时间为8:00-12:00，温度为25 ± 2 °C。
[0032]生测时，吸取10yL溶液滴在滤纸条(2cm X 0.5cm)上，待溶剂挥发后，将滤纸条分别 置于一容量瓶中，作为信号源，另一容量瓶设为空白。将肿腿蜂由Y型管长臂管口引入(每次 1头），爬过长臂管口 2cm后开始计时，寄生蜂在Y型管分叉处做出选择，取向不同的侧臂。每 头蜂观察5min，爬过侧臂3cm,且停留时间lmin以上记为对该气味有选择，否则记为无选择。 记录每个有效选择的时长以待比较。每处理随机测定肿腿蜂30头，每测5头调换Y型管两臂 位置，以消除管臂位置对寄生蜂行为可能产生的影响，每个处理测量完成后更换嗅觉仪，用 酒精彻底清洗Y型管和连接的Teflon管及容量瓶，自然晾干，Y型管和容量瓶在100°C下烘干 24h，以消除不同处理间气味残留的影响。
[0033] 2.4川硬皮肿腿蜂的室内寄生试验
[0034]取无天牛危害的花椒树干，锯成15cm长的木段，木段两端蘸加热石蜡封上，以减少 木段内水分的散失。然后用刻刀取下3cm X 4cm大小的树皮，再在所取树皮中央的木质部用 刻刀雕刻1个2cmX 3cm的人工虫道，将从受害花椒树林分中劈树所得的2-3龄花椒虎天牛幼 虫接入该人工虫道中，最后将先前取下的树皮放回原处，并用图钉钉住。将每个木段释放相 应的川硬皮肿腿蜂后，放入50cm的干燥器中。
[0035]试验设蜂虫比1:1、2:1和4:1共3个梯度，每个梯度用无学习经历的川硬皮肿腿蜂 做为对照。每梯度所用花椒虎天牛幼虫5头，试验重复3次。
[0036] 3数据统计与分析
[0037] 所有试验数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析，用Excel 2007和Word2007作图。 生测数据采用X2检验比较差异显著性[12]，采用Duncan's多重分析法比较各处理间的差异。 [0038] 4.分析与结果
[0039] 4.1不同学习经历的川硬皮肿腿蜂对各味源的行为反应
[0040] 4.1.1花椒枝条处理的川蜂对花椒枝条挥发物行为反应
[0041] 羽化期经历花椒枝条挥发物的川硬皮肿腿蜂行为生测结果如图1所示，羽化期经 历味源A的川硬皮肿腿蜂对味源A有一定的趋向性。其中，羽化期经历10g/mL的花椒枝条挥 发物，花椒枝条对川硬皮肿腿蜂的引诱率显著高于驱避率(P〈〇. 05)。
[0042]无学习经历川蜂对花椒枝条挥发物的行为反应见图2。卡方检验表明，味源A对无 学习经历蜂没有明显引诱作用。当味源浓度增加。对无学习经历蜂驱避作用明显增强。 [0043] 4.1.2花椒虎天牛虫粪木肩处理的川蜂对花椒枝条挥发物行为反应
[0044]羽化期经历花椒虎天牛虫粪木肩的川硬皮肿腿蜂行为生测结果如图3所示，羽化 期经历味源B的川硬皮肿腿蜂对味源B有一定的趋向性。其中，羽化期经历10g/mL的花椒虎 天牛虫粪木肩，花椒虎天牛虫粪木肩对川硬皮肿腿蜂的引诱率显著高于驱避率(p〈0.05)。 [0045]注:B气味源为花椒虎天牛虫粪木肩混合提取物，B1-B5分别为不同浓度0.01g/mL、 0·1g/mL、1g/mL、1Og/mL、100g/mL 〇
[0046] 无学习经历川硬皮肿腿蜂对虫粪木肩混合挥发物的行为反应见图4。卡方检验表 明，味源B对无学习经历蜂没有明显引诱作用。当味源浓度增加。对无学习经历蜂驱避作用 明显增强。
[0047] 4.2川硬皮肿腿蜂对不同浓度味源的行为反应多重比较
[0048] 从羽化期经历不同味源的川硬皮肿腿蜂对不同浓度味源的行为反应多重比较可 以看出（表1)，羽化期经历10g/mL花椒枝条挥发物的川硬皮肿腿蜂对味源的行为反应率最 高，达到66.67%，与其余9种处理间存在显著差异(P〈0.05)，其次是羽化期经历10g/mL虫粪 木肩挥发物的肿腿蜂对味源的行为反应率64.44%。而经历0.01g/mL花椒枝条与虫粪木肩 挥发物的肿腿蜂反应率最低。
[0049] 表1不同经历的川硬皮肿腿蜂选择率多重比较
[0050]
[0051]
[0052] 注：表中数据为平均值±标准误，具不同大写字母的数据表示差异极显著（P< 0 · 01，Duncan ' s比较）
[0053] 具不同小写字母的数据表示差异显著(？<0.05,〇1!11(^11'8比较）
[0054] 4.3川硬皮肿腿蜂对不同浓度味源的EAG反应
[0055] 从羽化期经历不同味源的川硬皮肿腿蜂对不同浓度味源的EAG反应多重比较可以 看出（表2)，羽化期经历10g/mL花椒枝条挥发物的川硬皮肿腿蜂对味源的EAG反应率最高， 达到1.6737±0.3487，与其余9种处理间存在显著差异(？〈0.05)。而经历1 8/1^花椒枝条与 虫奠木肩挥发物、〇.〇lg/mL花椒枝条挥发物和10g/mL花虫奠木肩挥发物的肿腿蜂反应率最 低。
[0056] 表2不同经历的川硬皮肿腿蜂触角电位值多重比较
[0057]
[0058]
[0059] 4.4室内寄生云斑天牛的试验结果
[0000] 利用EAG和Y型嗅觉试验效果最好的气味源（枝条10g/ml)进行学习处理的川硬皮 肿腿蜂室内防治花椒虎天牛。由表3可见，用有学习经历的川硬皮肿腿蜂寄生花椒虎幼虫， 蜂虫比1:1时平均寄生率为13.33%，蜂虫比2:1时平均寄生率为80.00%，而蜂虫比4:1时平 均寄生率为86.67%。用无学习经历的川硬皮肿腿蜂寄生花椒虎天牛幼虫，蜂虫比1:1时平 均寄生率仅为6.67%，蜂虫比2:1时平均寄生率为33.33%，而蜂虫比4:1时平均寄生率为 40.00%。6种处理的方差分析表明，各处理间存在极显著差异(P〈0.01 )，有学习经历蜂在蜂 虫比4:1时寄生率最高，其次是有学习经历蜂在蜂虫比2:1时，无学习经历蜂在蜂虫比1:1时 寄生率最低。
[0061] 表3学习经历和无学习经历川硬皮肿腿蜂成虫室内对花椒虎天牛的寄生结果
[0062]
[0063]注:表中数据为平均值土标准误，同列数据后具不同大写字母表示差异极显著(p <0 · 01 juncar/ s比较），下同。
[0064] 5结论与讨论
[0065] 寄生蜂羽化后，面对的常是复杂多变的环境，它们必须高效的利用各种信号，尽快 找到合适寄主，以繁衍后代。寄主植物源物质是寄生蜂搜索过程中利用的一类主要信号，其 中由寄主昆虫取食诱导的挥发物尤为重要。实践证明，在影响寄生蜂寻找寄主的诸因素中 化学因素起主导作用，而这种化学因素又主要指利它素。
[0066] 实验可知，无处理蜂对A(花椒枝条挥发物）、B味源(花椒虎天牛虫粪木肩混合提取 物），特别是高浓度的A、B味源有明显趋避性。而在羽化期经过对A、B味源学习处理蜂，对A、B 味源有了明显的趋向性，这说明，A、B味源确实对提高川蜂对花椒虎天牛的搜索寄生有一定 的影响。其中，A味源对川蜂影响最显著的为A4气味源;B味源对川蜂影响最显著的为Μ气味 源。相比较无处理蜂分别对Α、Β气味源行为反应，经Α味源学习处理蜂对Α味源的趋向性更为 明显，选择率也更为显著。
[0067]通过利用花椒枝条挥发气味和花椒虎天牛虫粪挥发物对川硬皮肿腿蜂的多次刺 激，以及室内触角电位实验和Y型嗅觉仪的生测，证明通过用花椒枝条挥发物和花椒虎天牛 虫粪对川硬皮肿腿蜂的驯化和刺激，确实提高了川硬皮肿腿蜂在花椒树上对花椒虎天牛的 反应行为和辨别能力，这种结果是由于川硬皮肿腿蜂在羽化过程中，适应了花椒枝条挥发 气味和花椒虎天牛虫粪气味，对于这两种气味有更高的辨别能力，经处理的川硬皮肿腿蜂 对于花椒虎天牛的搜索能力有显著影响。
【主权项】
1. 一种川硬皮肿腿蜂对花椒虎天牛幼虫的生物防治方法，其特征在于，将川硬皮肿腿 蜂经花椒挥发物学习处理，具体如下：将正己烷收集的健康枝条与虫粪木肩混合物挥发成 分设置5个浓度梯度，共计10个处理;在25°C下，川硬皮肿腿蜂蛹期为20d，在幼虫结茧15天 后，挑选出结茧较佳的指形管，每个处理取IOyL混合溶液滴于滤纸条上，待溶液挥发后，将 滤纸片置于指形管中用棉花封存，成虫羽化后当天取出。2. 根据权利要求1所述的川硬皮肿腿蜂对花椒虎天牛幼虫的生物防治方法，其特征在 于，5个浓度梯度如下:0.0]^/1111^，0.]^/1111^，]^/1111^，1(^/1111^，10(^/111匕3. 根据权利要求1或2所述的川硬皮肿腿蜂对花椒虎天牛幼虫的生物防治方法，其特征 在于，所述的滤纸条规格为2cm X 0 · 5cm〇
【文档编号】A01G13/00GK105900748SQ201610290093
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】杨桦, 杨伟, 杨春平, 苏婷, 卢林, 陈章铭
【申请人】四川农业大学