专利名称：通过将转基因靶向至性染色体上控制子代性别比例的制作方法
相关申请的交叉参考本申请要求受益于1999年12月27日申请的美国临时申请系列号60/173,096的相同题目和相同发明人的优先权。
2.背景技术大多数动物种属由两种性别构成雄性和雌性。对许多种属来说，雄性和雌性在许多方面如身材大小、生长速度和行为方式方面是不相同的。这些特征对一种性别来说甚至是唯一的。在养殖动物中，一种性别可能比另一种性别更利于产生需要的产物如肉、奶、蛋和羊毛。因此，控制家畜两种性别的出生比例具有重要的经济价值，因为它使农民能完全利用两种性别的不同。
在哺乳动物以及许多其他生物中，性别是由精子的性染色体(X或Y)决定的。一般来说，被含有Y染色体(Y精子)精子受精的受精卵将发育成雄性，而另外一方面，被含有X染色体(X精子)精子受精的受精卵将发育成雌性。该遗传机制决定了出生的雄性和雌性的数目基本相等。控制性别的关键是选择正确的受精精子(X或Y)。在过去的三十年里，已经实验了多种免疫、机械和化学方法以从收集的精液中分离X和Y精子。其构想是通过人工授精或体外受精使用分离的精子与卵子受精，希望改变子代性别比例。虽然许多出版的专利囊括了这些技术，但是一般认为这些方法是无效和不可靠的。而且，它们需要许多对大多数农民来说不可能获得的设备和专业技术。最近，已经识别出Sry(性别-决定区域Y)基因为哺乳动物中一种重要的雄性决定因素。许多实验室试图通过在转基因动物中表达Sry基因优选增加雄性新生畜的百分比。然而，只有30％的XX转基因小鼠(通常为雌性)生长了雄性器官如睾丸，而这些反性别动物是不育的。
因此，需要的是一种完全消除睾丸中的X精子或Y精子的产生的新方法，以便这种雄性的所有子代将是相同的性别，或者是雄性或者是雌性。同样还需要的是一种使动物遗传修饰的方法，以便使该特殊的特性能够从一代传至下一代。进一步需要的是一种与试图在精液中分离X和Y精子截然不同的方法。这样一种方法应该更准确的控制性别比例，还消除了对每一精液样品分离的复杂分离步骤。
本发明方法包括(a)选择或产生一种转基因，其表达能干预精子的受精能力，并且其基因产物(mRNA和蛋白)不能在互相连接的精子细胞中自由弥散；(b)在减数分裂后精子发生-特异的启动子的调节控制之下放置所述的转基因；以及(c)以将转基因插入至两条性染色体的一条中的方式使用所所述的转基因产生转基因动物。所述转基因的表达可以降低精子与一条特别的性染色体结合使卵子受精，发育成新个体的能力，因此控制了子代的性别比例。该方法还可以通过用在胚胎形成期(受精后)表达的启动子取代减数分裂后精子发生-特异的启动子，以及用对早期胚胎有毒性的转基因取代对精子有毒性的转基因进行修饰。性染色体连接的毒素转基因的胚胎表达打破了有一条特定的性染色体的胚胎的正常发育，只允许具有优选的性别的胚胎发育成能存活的个体。该修饰方法不仅可以用于使用X和Y染色体的生物体，还可以用于使用Z和W染色体的生物体进行性别鉴定。该方法能使农民选择优选的养殖动物的性别，以产生奶和肉产品，使研究动物提供者特异地增加优选性别的出生比例。
在浏览了以下的说明书、附图和附属的权利要求后，本发明的这些和其它优点将是显而易见的。
发明详述方法1.基本原理和策略通过表达毒性基因产物，可以特异去除转基因小鼠中的组织或细胞类型已经得到阐明。因此，毒性基因在单倍体精子细胞中的减数分裂后表达破坏了含有毒性转基因的精子。当转基因被整合进两条性染色体(X或Y)中的一条时，只有含有该特殊性染色体的精子细胞是不能存活的，而含有其它性染色体的精子细胞可以具有正常功能。这些雄性转基因动物仅仅产生一种类型的精子，因此其所有子代应该都是相同的性别。以上理论的主要挑战是单倍体精子细胞通过胞质桥(～1μm)保持连接，即它们是合胞体的事实。因此，毒素可以弥散进不含该转基因的精子细胞中，导致所有精子而不是仅仅含毒素转基因的一半精子的破坏(Braun等人，1989，见Davies和Willison综述，1993)。然而，通过选择其产物不能在内在相互连接的精子细胞中自由弥散的毒素基因，或通过将细胞定位DNA序列与毒素转基因结合产生含有限制弥散特性的转基因有可能解决这一问题。获得该方案的技术以一种简单的方式表示在附图中。
在本发明中使用了1-型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)基因作为毒素转基因。以前已经阐明HSV-tk含有一个潜在的精子发生特异的启动子，其表达破坏了精子生成(Palmiter等人.1984；Ellison和Bishop，1988；Braun等人，1990；Wilkie等人，1991；Al-Shawi等人，1991；Huttner等人，1993；Bernier等人，1994；Salomon等人，1995；Ellison等人，1995；Ellison和Bishop，1996；Al-Shawi等人，1998)。对所有这些HSV-tk转基因小鼠来说，一种普通的表型是雄性小鼠不能将HSV-tk转基因传递至下一代，虽然这些雄性中许多是不育的。Gondo等人(1994)。也已经有含有HSV-tk转基因的胚胎干(ES)细胞系不能通过雄性生殖系传递的报道。所有这些结果与HSV-tk蛋白优选分布在转染细胞的核周边区域(Haarr和Flatmark，1987)的报道一起暗示HSV-tk基因产物(mRNA和蛋白)在内在连接的精子细胞中的弥散是有限的。因此，HSV-tk是在性别控制项目中使用的理想侯选物。当然，发现其它具有相似特性的基因是可能的。可选择的，通过将细胞定位DNA序列与多种可能干预精子功能的基因连接，可以产生这些毒素基因，所述的干预精子功能的基因例如引起细胞死亡的基因、阻断精子发育和突变的调节基因、涉及精子活动度的突变细胞骨架或能量-产生基因以及涉及接合体识别、穿透和融合的基因。
通过多种方法可以将毒素基因插入到性染色体上，以下简要描述了几个实施例。(1)用胚胎干(ES)细胞技术靶向基因(a)使用标准同源重组方法将转基因靶向至ES细胞的性染色体上。
(b)将阳性ES细胞微注射进受体胚胎中，产生嵌合小鼠。
(c)繁殖嵌合小鼠，使ES来源的胚芽细胞传递至下一子代，以获得期望的转基因动物。(2)使用动物克隆技术靶向基因(a)使用标准同源重组方法将转基因靶向至适合核的供体细胞(如来源于胚胎的成纤维细胞)的性染色体上。
(b)通过细胞融合或核转染将供体细胞的核转染进去核卵母细胞中。
(c)激活重建的卵母细胞，将它们转染进假孕的代孕母亲中，使胚胎发育成含有转基因插入至期望的染色体的个体。(3)使用ES细胞或克隆技术随机整合(a)通过各种转染方法(如电穿孔)，用选择性标志基因(如新霉素抗性基因)将HSV-tk转基因共转染至ES或核供体细胞中。
(b)选择新霉素抗性克隆并使之生长，通过原位荧光杂交(FISH)检测转基因整合位点。用插入至期望的性染色体上的转基因扩展克隆落。
(c)将ES细胞注射进胚胎中产生嵌合动物，或使用供体细胞核克隆动物。(4)将转基因随机插入进接合体或胚芽细胞中使用多种方法如原核注射、逆病毒载体转染、脂质转染和精子孵育将转基因随机插入进基因组。然后，使用FISH筛选转基因建立者(founders)，以便鉴定含有插入至期望的性染色体的转基因的个体。
方法(3)和(4)使用了随机整合机制。这些方法的优点是它们相对比较容易用来产生DNA构建物。其缺点是必须筛选相当数目的细胞克隆或个体，以便发现含有插入至期望的性染色体上的转基因的那些克隆或个体。方法(1)和(2)使用了同源重组方法将转基因特异靶向至期望的性染色体上，因此消除了使用FISH筛选的必要。然而，它却涉及到更多产生基因-靶向DNA构建体。除了需要整合进靶构建体中的可选择的标志基因，还需要两个位于侧面的同源DNA片段以发生同源重组事件。因为越来越多的DNA序列数据能够从性染色体获得，许多位点都可以用作插入转基因的靶位点。一般规则是，转录机器可以接受靶位点进行精子细胞中的转录，在那些位点中插入转基因不引起转基因动物的异常表型。
由于转基因雄性不能将HSV-tk转基因从一代传递至下一代，需要使用一种可诱导的(如四环素可诱导系统)或条件系统(如Cre/loxP)。例如，通过侧面与干预DNA序列相接的loxP位点可以被插入至启动子和转基因之间，以便防止HSV-tk转基因的表达。因此，可以将转基因在代间传递以保持品系。当需要性别控制时，可以通过去除干预DNA序列(在两个loxP位点之间)激活HSV-tk转基因，而去除干预DNA序列是通过与含有Cre重组酶基因的雌性交配实现的。Cre转基因动物可以通过商业途径购买，或可以使用标准转基因方法产生。对靶向在X染色体上的转基因来说，有可能通过雌性(母亲至女儿)来保持转基因的品系。因此，在品系产生后，不需要使用可诱导的或条件系统。2.修饰方法可以通过用在胚胎形成(受精后)期间表达的启动子取代减数分裂后精子生成-特异的启动子，以及将破坏精子功能的毒素转基因置换为影响胚胎发育或存活的转基因对以上技术进行修饰。当这些转基因被插入到两条性染色体中的一条时，该转基因在早期胚胎形成中的表达破坏了具有一条特殊性染色体胚胎的正常发育，而只允许具有优选性别的胚胎发育成能存活的个体。该修饰的方法是事半功倍的。然而，如果将该方法与排卵过度(注射激素以增加每次排卵中卵的数量)结合起来，它是用于性别选择的有用的方法。
该修饰的方法需要一种维持转基因传代的可诱导或条件系统，因为所有含有该转基因的胚胎都被杀死，因此不能将转基因传递至下一代。例如，通过在启动子和转录单位之间插入侧面与干预序列相接loxP区域，可以阻止毒素转基因转录。这些失活的转基因可以从一代传至下一代。当需要性别控制时，转基因动物可以与含有由配子形成特异启动子控制的Cre重组酶基因的动物交配。Cre重组酶激活配子中的转基因，去除从这些配子发育的胚胎，只有具有不含转基因的性染色体的胚胎可以发育成个体。
不仅在使用X和Y染色体决定性别的生物体中可以使用该修饰的方法，而且在使用Z和W染色体决定性别的生物体中也可以使用该修饰方法。在使用ZW系统确定性别的生物体中，雌性是异形配子的(Z卵子和W卵子)，而雄性是同形配子的(所有的精子含有Z染色体)。因此，使用转基因雌性以控制性别。对每次排卵排出大量卵的种属来说(例如许多水生种属、两栖动物、昆虫和植物)，去除一半的早期胚胎应该不会明显影响其繁殖量，因为无论如何大多数的胚胎不能发育成成年个体。然而，对那些其卵本身就是有价值的商品的种属(如鸟)来说，必须要仔细评价控制仔鸡性别的益处是否超过被破坏的一半卵的价值。3.在实验小鼠上验证方法的实施步骤所有使用性染色体进行性别确定的生物体中都可以使用该技术，但是仅需要在一种种属上实验以验证该原理。最近，小鼠是验证方法的选择种属。以下是可以用于产生期望的转基因小鼠的特殊技术方案的实施例。1)从商业途径，如Stratagene，购买HSV-tk基因、新霉素抗性基因(neo)、白喉毒素(DT)。2) 通过两种单链寡脱氧核苷酸退火产生loxP区域DNA。3) 用聚合酶链反应(PCR)，采用129小鼠基因组DNA作为模板，克隆同源重组需要的位于侧面的同源DNA片段。例如，可以将转基因靶向至X染色体的Hprt位点上(见Melton等人，1984的基因序列)，或Y染色体的Tspy假基因位点上(见Vogel等人，1998的序列)。特定的，使用引物CAGTACAGCCCCAAAAT GGT和引物GAGGTCCTTTTCACCAGCAA在Hprt基因的外显子6和外显子7之间扩增一～4Kb的片段；使用引物AGTTTGTTGTTGGATATGCC和引物CCTCTTAGATGCTGTTACTG在Hprt基因的外显子8和外显子9之间扩增一～1.3Kb的片段；使用引物AGGAGAGTGTGGGCATG和引物AAATGCACAATCTAAAGC在Tspy假基因的5’端扩增一～1Kb的DNA片段；使用引物CTCCAAGGACTGCTCTCA和AAACATGAGAAACATGGTA在Tspy假基因的3’端扩增一～1.5Kb的DNA片段。4) 根据
图1装配上述DNA片段，以产生X和Y染色体的基因靶向构建体。5) 将DNA构建体电造孔入ES细胞中，将ES细胞平置于含有G418的介质中，以便使新霉素抗性克隆出现。由于Hprt基因本身是一种可选择标记，在选择性介质中除了加入G418之外加入6-硫鸟嘌呤将会增加对用于X染色体目标的靶克隆对随机整合克隆的机会。对Y染色体目标来说，靶构建体中的白喉毒素基因是作为一个阴性可选择标记起作用，它也可以增加靶克隆对随机整合克隆的机会。6) 在选择性介质中使ES细胞生长7-10天，然后选择抗性克隆并在多孔培养板中培养扩展。7) 复制多孔培养板，冷冻保存一套培养板以储存ES克隆，从另一套培养板中制备基因组DNA。8) 通过PCR和Souther印迹杂交分析基因组DNA样品以鉴定同源重组事件。将具有靶向至正确染色体位点的转基因的ES克隆进一步繁殖，作为阳性克隆储存。9)将阳性克隆注射进囊胚期小鼠胚胎中。将注射的胚胎转移进假孕的代孕母亲子宫内，以使嵌合鼠出生。10)用野生型小鼠繁殖嵌合小鼠，使转基因传递至下一代中。对X染色体目标来说，重要的是用野生雄性繁殖雌性嵌合体以便进行转基因的胚芽系传递，因为转基因不能通过精子传递。
对Y染色体目标来说，有必要用野生型雌性繁殖雄性嵌合体以传递转基因的失活形式。11)通过PCR或Southern印迹杂交，使用(多聚腺苷酸)尾DNA筛选上述交配的子代，以识别含有转基因的小鼠。12)对X染色体目标来说，转基因可以通过雌性在代间传递，而雄性被用于性别控制，因为其所有的子代都是相同的性别。13)对Y染色体目标来说，失活形式的转基因通过雄性来保持。
当需要进行性别控制时，可以用含有Cre重组酶活性的雌性通过交配激活转基因。Cre小鼠可以从商业实验室动物提供者购买，也可以通过标准转基因方法产生。
以下参考文献提供了与本发明相关的背景资料。对在详细描述中特别引用的任何参考文献的深度来说，其在此引用以供参考的目的依赖于本发明的描述。Al-Shawi，R.J.Vurke，H.Wallace，C.Jones，S.Harrison，D.Buxton，S.Maley，A.Chandleu，和J.O.Bishop(1991)分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)114207-4216页。Al-Shawi，R.J.Vurke，C.T.Jones，J.P.Simons，J.O.Bishop(1988)分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)84821-4828页。Bernier F.，S.L.Guerin，M.Ouellet，G.Pelletier，和F.Pothier(1994)转基因(Transgenics)，1225-240页。Braun，R.E.，R.R.Behringer，J.J.Peschon，R.L.Brinster，和R.D.Palmite(1989)自然，337373-376页。Braun，R.E.，D.Lo，C.A.Pinkert，G.Widera，R.A.Flaverll，R.D.Palmite和R.L.Brinster(1990)Biol.Reprod，43684-693页。Capel，B.，Swain，S.Nicolis，A.Hacker，M.Walter，P.Koopman，P.Goodfellow，和R.Lovell-Badge(1993)细胞，731019-1030页。Davies，P.O.和Willison(1993)Sem.Dev.Biol.，3179-188页。Ellison A.R.和J.O.Bishop(1998)Biochim Biophys Acta.144228-38页。Ellison A.R.，H.Wallace，R.Al-Shawi，和J.O.Bishop(1995)Mol.Reprod.Dev.，41425-434页。Ellison A.R.和J.O.Bishop(1996)核酸研究(Nucleic Acids Res.242073-2079页。Erickson R.P.(1990)Trens Genet.，6264-269页。Flatmark T.和L.Haarr(1987)遗传病毒学杂志(J.Gen.Virol.)，682817-2829页。Gondo，Y.，K.Nakamura，K.Nakao，T.Sasaoka，K.Ito，M.Kimura和M.katsuki(1994)生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)。202830-837页。Hendriksen，P.J.M.Hoogerbrugge，A.P.N.Themmen，M.H.M.Koken，J.H.J.Hoeijmakers，B.A.Oostra，T.V.D.Lende和J.A.Grootegoed(1995)Dev.Biol.170730-733页。Huttner，K.M.，J.Pudney，D.S.Milstone，D.Ladd和J.G.Seidman(1993)Biol.Reprod.49L251-261页。Melton，D.W.，D.S.Konecki，J.Brennand和C.T.Caskey(1984)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，812147-2151页。Nafamine，C.M.，K.Chan，L.E.Hake和Y-F.C.Lao(1990)基因进展(Genes Dev.)，463-74页。Palmiter，R.D.，T.M.Wilkie，H.Y.Chen和R.L.Brinster(1984)细胞，36869-877页。Salomon B.，S.Maury，L.Loubiere，M.Caruso，R.Onclercq和D.Klatzman(1995)分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.，)155322-5328页。Shannon，M.和M.A.Handel(1993)Biol.Reprod.，49770-778页。Vogel，T.，H.Boettger-Tong，I.Nanda，F.Dechend，A.I.Agulnik，C.E.Bishop，M.Schmid和J.Schmidtke(1998)染色体研究(Chromosome Res.)635-40页。Wikie.T.M.，R.E.Braun，W.J.Ehrman，R.D.Palmiter和R.E.Hammer(1991)基因进展(Genes Dev.)，538-48页。
以上的实施例中描述的本发明的原理和特征，从以下的权利要求中将会更广义的理解。权利要求的目的是覆盖如所述的发明及其等同物。
权利要求
1.一种产生转基因动物的方法，其体细胞/胚芽细胞含有一种或多种转基因，其中所述转基因的表达导致所述动物的子代的性别比例的变化，所述的方法包括以下步骤a) 制备转基因包括可操作连接(a)至少一种以减数分裂后精子生成特异的方式起作用的表达调节序列(启动子)；(b)编码毒素基因的DNA序列，其表达可以干预精子受精的能力；(c)编码可选择性标记的可选择性DNA序列，如新霉素-、潮霉素-或嘌呤霉素抗性基因，Hprt选择暗盒和白喉毒素基因；(d)可选择性在减数分裂后启动子和毒素基因之间插入侧面连有干预DNA序列的loxP区域，除非它被Cre重组酶去除，所述的干预序列可以阻止毒素转基因的转录；(e)可选择性细胞定位信号序列，它限制了来自所述转基因的mRNA和蛋白在内在连接的单倍体精子细胞中随机弥散的能力；以及(f)两种可选择的位于侧面的DNA序列，通过同源重组方法，它能使所述的转基因被插入到性染色体(X或Y染色体)上的特异位点上；b) 使用所述的转基因产生转基因动物，以便所述的转基因被插入至两条性染色体中的一条上；以及c) 将所述的雄性转基因动物与含有Cre重组酶活性的动物交配，激活所述的转基因，鉴定至少一种具有期望的生殖特性的转基因动物，具体来说，是改变了子代的性别比例的转基因动物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的动物包括所有使用X和Y染色体决定性别的哺乳类动物和非哺乳类生物体和单性花植物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的转基因选自单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tk)、其突变或截断的基因或任何其它具有以下特征的毒素基因a)其表达可以干预精子受精的能力；b)其mRNNA/蛋白产物在内在连接的精子细胞中以非随机弥散方式起作用。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述转基因动物的期望的子代性别百分比为从50％至100％。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的减数分裂后精子形成-特异的启动子选自HSV-TK基因、鱼精蛋白家族基因、试剂盒(kit)、血管紧张肽-转化酶(Ace)基因、CaM3基因、TP-1基因、TP-2基因、细胞色素cs基因、PSK-C3基因、H2B基因、Mea基因、δ-肌动蛋白基因、proacrosin基因、Idh基因、M-α-3，7微管蛋白基因、hsp70.1基因、Wnt.基因和锌指Y基因的启动子或任何可以触发所述的转基因的减数分裂后表达的启动子。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的对X-染色体特异靶向的DNA序列是Hprt位点或其它X-连接的序列，其破坏将不会引起转基因动物的异常表型。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述的对Y-染色体特异靶向的DNA序列是Tspy假基因或任何Y-连接序列，其破坏将不会引起转基因动物的异常表型。
8.根据权利要求1所述的方法，其中用胚胎期表达的启动子取代减数分裂后精子发生-特异的启动子，以及用干预胚胎发育或存活的转基因取代破坏精子功能的转基因，所述的方法进一步包括以下步骤将该转基因插入至两条性染色体中的一条，抑制具有一条特殊性染色体的胚胎发育成个体，制备一种转基因，它含有可操作相关的(1)至少一种表达调节序列(启动子)，它在早期胚胎表达，但在精子发生(对XY生物体)或卵子发生(对ZW生物体)期不表达；(2)编码毒素基因的(如白喉毒素基因和蓖麻蛋白基因)的DNA序列，其表达可以杀死胚胎或阻断胚胎的正常发育；(3)插入至启动子和毒素基因之间的、侧翼连有干预DNA序列的loxP区域，除非它被Cre重组酶去除，所述的干预DNA序列可以阻止毒素基因的转录；(4)编码可选择性标记的可选择性DNA序列，如新霉素-、潮霉素-或嘌呤霉素抗性基因，Hprt选择暗盒和白喉毒素基因；(5)两种可选择性侧翼DNA片段，通过同源重组方法，它能使所述的转基因被插入到性染色体上的特异位点上；产生转基因动物，用含有通过由精子发生(对XY生物体)或卵子发生(对ZW生物体)特异的启动子驱动的Cre重组酶转基因的动物繁殖该转基因动物。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述的产生转基因动物的步骤包括使用标准同源重组(基因靶向)方法将转基因靶向至ES细胞的性染色体上，将阳性ES细胞微注射进受体胚胎中，产生嵌合小鼠，繁殖嵌合小鼠，使ES来源的胚芽细胞传代至下一子代，以获得期望的转基因动物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述的产生转基因动物的步骤包括使用标准同源重组(基因靶向)方法将转基因靶向至适合核的供体细胞的性染色体上，通过细胞融合或核转染将供体细胞的核转染进去核卵母细胞中，激活重建的卵母细胞，将它们转染进假孕的代孕母亲中，使胚胎发育成含有转基因插入至期望的染色体的个体。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述的产生转基因动物的步骤包括通过转染，用选择性标志基因将HSV-tk转基因共转染至ES或核供体细胞中，选择新霉素抗性克隆并使之生长，通过原位荧光杂交(FISH)检测转基因整合位点，用插入至期望的性染色体上的转基因扩展克隆落，将ES细胞注射进胚胎产生嵌合动物。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述的产生转基因动物的步骤包括从选自以下的技术中产生转基因动物的步骤原核微注射、逆病毒载体转染、脂质转染和精子孵育，并用FISH检测转基因整合区，发现每一转基因建立者，以便寻找含有插入至期望的性染色体的转基因的个体。
全文摘要
本发明涉及通过靶向转基因控制子代性别比例的方法。该方法包括(a)选择或产生一种转基因，其表达能干预精子的受精能力，并且其基因产物(mRNA和蛋白)不能在互相连接的精子细胞中自由弥散；(b)在减数分裂后精子发生－特异的启动子的调节控制之下放置转基因；以及(c)以将转基因插入至两条性染色体的一条中的方式使用该转基因产生转基因动物。
文档编号C12N15/85GK1434678SQ00819069
公开日2003年8月6日 申请日期2000年12月27日 优先权日1999年12月27日
发明者刘成宇, F·科斯坦蒂尼, 王瑾 申请人:刘成宇