专利名称：用于制备抗坏血酸、2－酮－l－古洛糖酸及2－酮－l－古洛糖酸酯的酶促方法
技术领域：
本发明涉及用于制备抗坏血酸、2-酮(keto)-L-古洛糖酸(KLG)和KLG的酯的方法。更具体地说，本发明涉及酶催化剂在制备抗坏血酸、KLG或KLG的酯中的用途。
背景技术：
抗坏血酸、又名维生素C是一种必须存在于人类饮食中以预防坏血病并且已经鉴定为可以提高对传染的抗性的试剂的饮食因子。在商业方面，抗坏血酸例如用作营养添加物、固色剂、肉类和其它食品中的调味剂和防腐剂、面包生面团中的氧化剂、收获中的柑橘类水果的切除(abscission)以及分析化学中的还原剂。
一种用于制备抗坏血酸的通用方法使用了原始Reichstein-Grossner合成的改进方法(Reichstein等，Helv.Chim.Acta，17311(1934)；Reichste in的美国专利2,301,811；本文中所引用的所有文献逐一插入本文仅供参考)。在该方法中把葡萄糖源转化成抗坏血酸。在转化过程中生成了KLG的双丙酮化合物的中间体。
有几种两阶段方法用于制备抗坏血酸。在第一阶段中，通过发酵方法将葡萄糖或者转化为分离了的KLG的中间体(Sonoyama等，应用与环境微生物学，431064-1069(1982)；Anderson等，科学，230144-149(1985)；Shinjoh等，应用与环境微生物学，61413-420(1995))或者转化为Reichstein-Grossner合成的中间体、即KLG的双丙酮化合物。
把上述两种中间体之一转化为抗坏血酸的第二阶段是通过两条已经报道的路线中的一条路线进行的。第一条路线、即Reichstein-Grossner合成的后继步骤的改进需要多个步骤，由此在强酸条件下使中间体与甲醇发生酯化以生成甲基-2-酮-L-古洛糖酸(MeKLG)。然后使MeKLG与碱反应以生成金属抗坏血酸盐。最后，用酸化剂处理金属抗坏血酸盐以得到抗坏血酸。第二条路线为一步法，该方法包括如最初在Reichstein的英国专利466548中公开、随后由Yamazaki改进(Yamazaki，日本农业化学协会杂志，28890-894(1954)与化学文摘，505992d)并且再由Yodice改进(WO 87/00839)的酸催化KLG的成环。Yodice的方法在商业上不受欢迎，因为它使用了大量的气态氯化氢、需要非常昂贵的加工设备并且生产出需要进一步纯化的抗坏血酸产品。
脂肪酶、即一组水解酶已经成功地用于一些有机酸酯的合成中。具体说来，脂肪酶已经用于其中的酯化剂为不可逆的醇的酯基转移作用，比如当醋酸乙烯酯用作酯化剂时(Thiel，今日催化，517-536(1994))。Gutman等(四面体通讯，283861-3864(1987))描述了一种使用猪胰脂肪酶作为催化剂由γ-羟甲基酯制备简单的5-元环内酯的方法。但是，Gutman等(四面体通讯，285367-5368(1987))随后报道了用δ-羟甲基酯代替γ-羟甲基酯并且使用同样的催化剂仅生产出聚合物。在Sakashita等的EP 0 515 694 A1中，抗坏血酸酯的合成(在伯羟基上进行酰化)包括在有脂肪酶存在的条件下在极性有机溶剂中使抗坏血酸与多种脂肪酸的活性酯(即脂肪酸乙烯酯)反应。
因此，在现有技术中需要有生产下列物质的方法(a)由KLG或KLG的酯生产抗坏血酸或其金属盐，(b)由KLG的酯生产KLG和(c)由KLG生产KLG的酯，所述方法具有高产率和高纯度、极少或者没有副产物产生并且在温和的条件下进行。因此，本发明主要的目的在于提供上述方法。
发明概述本发明公开了在化学和生物学领域中的进步，其中用于制备抗坏血酸的方法包括使KLG或KLG的酯与水解酶催化剂接触。
在本发明的另一个实施方案中，用于生产KLG的方法包括在水溶液中使KLG的酯与水解酶催化剂接触。
在本发明的再一个实施方案中，用于由KLG生产KLG酯的方法包括使KLG的醇溶液与水解酶催化剂接触。醇溶液含有与将要制得的KLG酯的烷基部分相对应的醇。
在本发明的再一个实施方案中，用于由KLG的酯生产KLG的酯的方法包括使第一种KLG酯的醇溶液与水解酶催化剂接触。该醇溶液含有与将要制得的第二种KLG酯的烷基部分相对应的醇。
发明详述本发明的目的在于出乎意料地发现使用水解酶作为催化剂通过诱导KLG或KLG酯的闭环，可以由KLG、或者更优选地可以由KLG的酯生成抗坏血酸。可以在熔化状态或者在溶液中进行用于生产抗坏血酸的方法。该方法也可以在体内或在体外进行。对体内方法而言，水解酶催化剂可以天然存在于宿主细胞中或者可以通过重组DNA方法引入到宿主细胞或者生物体中。
本发明的目的还在于出乎意料地发现KLG可以在可逆反应中通过在水溶液中使用水解酶作为催化剂使KLG的酯发生反应来制备。此外，本发明的目的在于出乎意料地发现KLG的酯可以通过使用水解酶作为催化剂在醇溶液中使KLG或另一种KLG的酯发生反应来制备。用于制备上述溶液的醇对应于将要制得的KLG的酯的烷基部分。
在本发明的方法中用作催化剂的水解酶可以从任何来源适宜的生物体中得到或者分离出来。其中包括的实例有、但却不限于植物、微生物以及动物，比如酵母、细菌、霉菌、真菌、鸟类、爬行动物、鱼类和哺乳动物。正如在酶命名(学术出版社，1992)中规定的那样，对本发明而言的水解酶通常被定义为E.C.3.-.-.-的酶类，并且这些酶可以通过商业途径得到。
优选的水解酶为那些能够影响含有羰基或者磷酸基团的分子水解的酶。更具体地说，优选的水解酶为能够影响在含有一个杂原子单键的羰基碳上发生水解的酶。这些含有一个杂原子单键的羰基碳的实例包括、但却不限于酯、硫酯、酰胺、酸、酰基卤及类似物。优选的水解酶包括E.C.3.1.-.-的酶类，它包括作用于酯键的水解酶、比如酯酶和脂肪酶；E.C.3.2-.-的酶类，它包括糖苷酶；E.C.3.4-.-的酶类，它包括肽的水解酶，比如蛋白酶；以及E.C.3.5.-.-的酶类，它包括作用于除肽键以外的键的酰胺酶。最优选的水解酶包括蛋白酶、酰胺酶、脂肪酶和酯酶。
最优选的水解酶含有活性位点的丝氨酸残基，它能够与KLG或KLG的酯进行酯化或者酯基转移作用。甚至更为优选的为那些含有丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸的催化三联体的水解酶。
优选的蛋白酶包括那些来源于芽胞杆菌属或曲霉属细菌的蛋白酶。特别优选的蛋白酶为那些从地衣形芽胞杆菌细菌中得到的蛋白酶。优选的蛋白酶为那些与枯草蛋白酶之间至少具有70％的序列同源性的蛋白酶。与枯草蛋白酶具有序列同源性的蛋白酶用于洗涤剂工业中，因此可以方便地得到。更优选的为与枯草蛋白酶之间至少具有80％序列同源性的蛋白酶，甚至更为优选的为与枯草蛋白酶之间至少具有90％序列同源性的蛋白酶，特别是与枯草蛋白酶之间至少具有95％序列同源性的蛋白酶。一种非常优选的蛋白酶为枯草蛋白酶自身，它具有由Smith等在《生物化学杂志》2432184-2191(1968)中所描述的氨基酸序列(SEQ ID NO1)并且如下所示MMRKKSFWLG MLTAFMLVFT MAFSDSASAA QPAKNVEKDYIVGFKSGVKT ASVKKDIIKE SGGKVDKQFR IINAAKAKLDKEALKEVKND PDVAYVEEDH VAHAIAQTVP YGIPLIKADKVQAQGFKGAN VKVAVLDTGI QASHPDLNVV GGASFVAGEAYNTDGNGHGT HVAGTVAALD NTTGVLGVAP SVSLYAVKVLNSSGSGTYSG IVSGIEWATT NGMDVINMSL GGPSGSTAMKQAVDNAYARG VVVVAAAGNS GSSGNTNTIG YPAKYDSVIAVGAVDSNSNR ASFSSVGAEL EVMAPGAGVY STYPTSTYATLNGTSMASPH VAGAAALILS KHPNLSASQV RNRLSSTATYLGSSFYYGKG LINVEAAAQ.
为了方便读者，表1提供了以上以及在本说明书其余部分中使用的氨基酸简写形式的一览表。
表1氨基酸符号三字母缩写一字母丙氨酸 AlaA精氨酸 ArgR天冬酰胺AsnN天冬氨酸AspD半胱氨酸CysC谷氨酰胺GlnQ谷氨酸 GluE甘氨酸 GlyG组氨酸 HisH异亮氨酸IleI亮氨酸 LeuL赖氨酸 LysK甲硫氨酸MetM苯丙氨酸PheF脯氨酸 ProP丝氨酸 SerS苏氨酸 ThrT色氨酸 TrpW酪氨酸 TyrY缬氨酸 ValV另外也包括在本发明范围之内的为与以上所示序列的对1至6个位点具有特异性的突变体、序列添加以及序列缺失相对应的蛋白酶。甚至更优选的为对应于以上所示枯草蛋白酶序列的对0至2个位点具有特异性的突变体的蛋白酶。
适用于本发明的酯酶包括那些由猪肝提取物中得到的酶。优选的酯酶为那些与猪肝酯酶之间至少具有70％序列同源性的酯酶，所述的猪肝酯酶具有由Matsushima等在《FEBS Lett.》29337(1991)中所述的氨基酸序列(SEQ ID NO2)并且如下所示
MWLLPLVLTS LASSATWAGQ PASPPVVDTA QGRVLGKYVSLEGLAFTQPV AVFLGVPFAK PPLGSLRFAP PQPAEPWSFVKNTTSYPPMC CQDPVVEQMT SDLFTNFTGK ERLTLEFSEDCLYLNIYTPA DLTKRGRLPV MVWIHGGGLV LGGAPMYDGVVLAAHENFTV VVVAIQYRLG IWGFFSTGDE HSRGNWGHLDQVAALHWVQE NIANFGGDPG SVTIFGESFT AGGESVSVLVLSPLAKNLFH RAISESGVAL TVALVRKDMK AAAKQIAVLAGCKTTTSAVF TFVHCLRQKS EDELLDLTLK MKFLTLDFHGDQRESHPFLP TVVDGVLLPK MPEEILAEKD FTFNTVPYIVGINKQEFGWL LPTMMGFPLS EGKLDQKTAT SLLWKSYPIANIPEELTPVA TFTDKYLGGT DDPVKKKDLF LDLMGDVVFGVPSVTVARQH RDAGAPTYMY EFQYRPSFSS DKFTKPKTVIGDHGDEIFSV FGFPLLKGDA PEEEVSLSKT VMKFWANFARSGNPNGEGLP HWPFTMYDQE EGYLQIGVNT QAAKRLKGEEVAFWNDLLSK EAAKKPPKIK HAEL.
酯酶更优选与以上所示的猪肝酯酶的序列之间至少具有80％的序列同源性、甚至更优选至少有90％的序列同源性、特别优选至少有95％的序列同源性。非常优选的为具有以上所示序列的猪肝酯酶。
另外也包括在本发明范围之内的为与以上所示序列的对1至6个位点具有特异性的突变体、序列添加以及序列缺失相对应的酯酶。甚至更优选的为对应于以上所示猪肝酯酶序列的对0至2个位点具有特异性的突变体的酯酶。
优选的脂肪酶包括那些从猪和其它哺乳动物、微生物以及植物中分离出来的酶。这包括、但却不限于从曲霉属、毛霉菌属、假丝酵母属、假单胞菌属、腐质霉属、根霉属、色杆菌属、产碱杆菌属、地霉属和青霉属得到的脂肪酶。优选的脂肪酶也包括胞外脂肪酶、比如角质酶(cutinase)。更优选的脂肪酶与南极洲假丝酵母(CandidaAntartica)B型脂肪酶之间至少具有70％的序列同源性、甚至更优选至少具有80％的序列同源性、愈加更优选至少具有90％的序列同源性、甚至更优选至少具有95％的序列同源性。一种非常优选的脂肪酶为南极洲假丝酵母B型脂肪酶自身，它具有由Uppenberg等在《结构)》2293，453(1994)中所述的氨基酸序列(SEQ ID NO3)并且如下所示MKLLSLTGVAGVLATCVAATPLVKRLPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTP.
另外也包括在本发明范围之内的为与以上所示序列的对1至6个位点具有特异性的突变体、序列添加以及序列缺失相对应的脂肪酶。甚至更优选的为对应于以上所示B型南极洲假丝酵母序列的对0至2个位点具有特异性的突变体的脂肪酶。
优选的酰胺酶包括那些从青霉菌属的细菌中分离出来的酰胺酶。更优选的酰胺酶与青霉素酰基转移酶之间至少具有80％的序列同源性。特别优选的酰胺酶为青霉素酰基转移酶，它也称作青霉素酰胺水解酶E.C.3.5.1.11(Duggleby等，自然，373264-266(1995))。
对于在其活性位点上含有丝氨酸的水解酶来说，人们认为在KLG或KLG酯的反应中的第一步涉及通过由活性位点丝氨酸的KLG的酰化形成了KLG-酶酯。人们认为分子内的闭环生成了抗坏血酸(或其盐)，而醇解则生成了KLG的酯、水解则生成了KLG。
本发明的方法包括将KLG或者KLG的酯与水解酶接触以生成抗坏血酸。优选地，该反应是在有机溶剂系统、水溶剂系统或其混合物的条件下进行的。有机溶剂优选为C1-C6的醇。水溶剂系统或者水和有机溶剂混合的系统更为优选，这是因为抗坏血酸、KLG以及KLG的酯通常更易溶于水溶剂系统中。对于在体外从KLG的酯生产抗坏血酸而言，优选水和有机溶剂混合的系统或者有机溶剂系统以便使能够生产出副产物KLG的竞争水解反应降到最低的程度。当使用完整细胞系统在体内生产抗坏血酸时，特别优选水溶剂系统。
在本发明的一个方面，抗坏血酸是由KLG或KLG的酯在有水解酶催化剂存在下，在体内在完整细胞以及完整生物体生产系统中生成的。在一个具体实施方案中，水解酶是由宿主生物体天然产生的。在另一个具体实施方案中，水解酶是通过重组DNA技术由宿主生物体产生的。例如，将编码水解酶的基因序列插入宿主生物体中，其中所述的宿主生物体可以是能够表达水解酶的微生物、植物或动物。培养产生水解酶的宿主生物体、即在有KLG或KLG的酯存在的情况下提供适于生长的营养和合适的环境以生产出抗坏血酸。优选的宿主生物体为柠檬泛菌(Pantoea Citrea)，以前在如Anderson等的美国专利5,008,193中所公开的将其称为草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)。
另外优选的宿主生物体为一种除了生产水解酶之外还生产KLG的生物体。具有代表性的生物体为来自泛菌属或葡糖杆菌属的生物体、比如Shinjoh等在《应用与环境微生物学》61413-420(1995)中公开的生物体，以及如Sonoyama等在《应用与环境微生物学》431064-1069(1982)中公开的棒状杆菌属的生物体。
正如本文所使用的那样，重组DNA技术包括体外重组DNA技术、合成技术以及体内重组/遗传重组，并且该技术在现有技术中是众所周知的。例如可以参阅在下列文献中所述的技术Maniatis等，《分子克隆实验室手册》，冷泉港实验室，纽约(1989)；Ausubel等，《分子生物学通用实验方案》，Greene出版协会与WileyInterscience，纽约(1989)；Anderson等，《科学》，230144-149(1985)；以及Estell等的美国专利5,441,882。
为了从KLG的酯制备KLG，使KLG的酯的水溶液与水解酶反应。在制备KLG中可以使用助溶剂并且优选C-C6的醇。
为了从KLG或者从KLG的其它酯制备KLG的酯，将起始原料溶于醇溶液中，其中的醇对应于将要制得的KLG的酯的烷基部分。从中可以得到优选的KLG酯的醇ROH的烷基部分R可以选自支链或直链的、饱和或不饱和的烷基、芳烷基、芳基以及取代的芳基。优选的R基团包括C1至C6的直链或支链的、饱和或不饱和的烷基。针对烷基部分衍生的甚至更优选的KLG的酯包括MeKLG、乙基-KLG、正丙基-KLG、异丙基-KLG、正丁基-KLG、异丁基-KLG、t-丁基-KLG以及正戊基-KLG。生成的最优选的KLG的酯为MeKLG、这是因为它可以很方便地进行生产，以及丁基-KLG、这是由于在除去水分时可以便利地使用丁醇水的共沸物。在制备KLG的酯的过程中可以使用助溶剂并且优选水、C1-C6的醇或其混合物。
用于进行本发明的反应的优选温度为5℃至120℃。甚至更优选的温度为25℃至100℃，并且特别优选的温度为38℃至80℃。
用于本发明的方法的优选pH介于1.5和10之间，并且更优选的pH介于3和10之间。为了从KLG的酯制备抗坏血酸盐，特别优选的pH范围在6和10之间。为了制备呈游离酸形式的抗坏血酸，优选的pH在抗坏血酸的pKa下，并且更优选在4.2下。为了从KLG的酯制备KLG，特别优选的pH范围介于5和10之间，这是因为在该pH范围内通常能提高酶协助的水解的速率。另一方面，为了生成呈质子化形式的KLG，介于1.5和2.5之间的pH尤其合乎要求。最后，为了从KLG制备KLG的酯，特别优选的pH范围介于3和6之间。
每种水解酶都具有最适温度、最适pH以及与活性有关的pH和温度范围。因此对给定的水解酶而言，适宜的pH和温度范围为可以为水解酶的活性创造条件并且避免使水解酶变性或失活的条件。对于可以发生变性的条件而言、比如高温或者使用变性溶剂(如甲醇或者类似物)，可以要求进行最小量的测试以限定那些在一系列给定的条件下仍保持活性的水解酶。
下面的实施例是通过解释的方式提供的，并且这些实施例不打算限制所要求保护的本发明的范围。
实施例在质子模式为300MHZ和碳模式为75MHZ下操作的Varian Gemini300NMR仪上记录质子和碳核磁共振(NMR)光谱。除非另作说明的以外，所有的NMR光谱都以0百万分率(ppm)的四甲基硅烷(TMS)为基准并且以ppm记录峰的频率。使用紫外(UV)检测进行HPLC(高效液相层析)的分析。使用Fisons VG分析有限公司的Autospec质谱仪在FD(场解吸)模式下得到质谱(MS)。
在本实验中使用的KLG是根据Lazarus等、Anderson等在《科学》230144-149(1985)中的方法通过发酵得到的，并且通过浓缩和结晶进行纯化。另外，KLG也可以根据本领域中众所周知的方法通过化学转化由L-山梨糖制得(例如参见Reichstein的美国专利2,301,811)。甲基-2-酮-L-古洛糖酸的标准品可以从Aldrich化学公司(稀有和特殊化学药品目录)买到，另外可以通过如下所述的与用于制备丁基-KLG的方法类似的方法由KLG的酯化来制备。
水解酶样品是从商业来源得到的，包括Sigma化学公司、AltusBiologics、重组生物催化公司、Boehringer Mannheim、NovoNordisk、Genencor国际公司、Thermogen和Fluka。实施例1本实施例描述了丁基2-酮-L-古洛糖酸的制备和纯化。
在氩气环境中将KLG水合物(51.62g)装入一个500ml的反应容器中。该反应器配备有一个连接到迪安-斯达克榻分水器上的30.48cm(12”)的维格罗分馏柱。然后向反应器中装入正丁醇(310g)和对甲苯磺酸(2.3g)。在适度真空的条件下[大约19.95kPa(150mm Hg)]在搅拌下使反应混合物回流(81-82℃)。持续回流共计2小时40分钟。不再继续加热。使反应冷却并在室温下保持大约3天。得到的晶体通过粗多孔玻璃过滤器过滤并用两份正丁醇(139g、随后为37g)洗涤。将得到的固体(24.4g)溶解在热的醋酸乙酯(250ml)中，并在室温下通过静置过夜进行重结晶。通过过滤分离出重结晶的丁基-KLG并在真空下
干燥至恒重(15.97g)来实现。
人们发现如此制得的丁基-KLG在水中具有至少50％重量百分数的溶解度，因为在50％重量百分数的情况下在所有的浓度下它都可以溶解在水中。本实施例重结晶的丁基-KLG具有令人满意的质子和碳NMR光谱并且通过场解吸质谱测定给出了预测的分子量。
1H NMR(DMSO，数字式分辨率＝0.11Hz，在半高度下的TMS＝0.5Hz)6.49(OH，d，J＝1.4Hz)，4.96(OH，d，J＝5.0Hz)，4.84(OH，d，J＝4.8Hz)，4.78(OH，d，J＝7.4Hz)，4.17-4.0(m，2H)，3.5-3.2(m，约为5H)，1.64-1.5(m，2H)，1.4-1.35(m，2H)，0.89(CH3，t，J＝7.3)。
13C NMR(DMSO，去偶的)169.4，96.3，73.8，72.8，69.8，64.5，62.8，30.0，18.4，13.5。
FDMSM＝250实施例2以下的方法用于说明在具体的pH和水溶剂组合物条件下酶的活性。
如下进行起始酶的筛选。把酶(一般为10mg)、水性缓冲溶液(一般为860微升(ul)或550ul)、0.2M CaCl2水溶液(10ul)、甲醇(一般为90ul或400ul)和底物的水溶液(一般为90ul的丁基-KLG、其常用的浓度为110,000ppm)加入2ml聚丙烯离心管中。把得到的溶液简短地旋转一下并放置在300rpm、38℃下的水浴摇床中(通常处理18小时或者更长的时间)。在温育后，将样品在14,000G’s(14,000倍的重力)下离心20分钟以除去酶、取样(300ul)并用蒸馏水稀释到1毫升。如果不在当天用HPLC进行分析的话，在分析前冷冻样品。
在下面的表2中总结的是在丁基-KLG(BuKLG)与多种水解酶在水/甲醇溶液中反应时的产物(以及残留底物)的HPLC数据。这些数据是以KLG、MeKLG、抗坏血酸(ASA)和丁基-KLG的百万分率报道的。报道值为0(零)表明存在的物质的量低于仪器的检测阈值。在给定的试验中，标记为“无酶”的样品为对照物。这些对照物含有底物、但却不含酶，因而可以代表实验和HPLC的本底数据。
表2针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选(38℃处理41小时/38％甲醇-水/0.1MES缓冲溶液)酶 测量的 KLG MeKLG ASA BuKLGpH (ppm)ESL-001-01 5.811802352766 4603ESL-001-02 5.6704 1084302 7736ESL-001-03 5.7386 527 257 8931ESL-001-04 5.8550 752 833 6229ESL-001-05 5.9456 684 469 7942ESL-001-06 5.6547 661 129 8896ESL-001-07 5.7311 755 489 6540无酶 108 325 33 10177无酶 (重复) 107 303 0 9459无酶 117 327 42 9878无酶 (重复) 103 269 2 8593无酶 116 322 0 9473表2说明由重组生物催化公司提供的水解酶(ESL-001-01至ESL-001-07)显示出在用吗啉代乙磺酸(MES)半钠盐缓冲的、将pH控制在5.5与6之间的38％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明显地转化为抗坏血酸、MeKLG和KLG。这些水解酶为通过商业途径由重组生物催化公司销售的重组酯酶以及来自嗜热生物体、商品名为CloneZyme(商标)的脂肪酶。
实施例3下面的表3说明多种酰基转移酶、酯酶、脂肪酶和蛋白酶显示出在用MES缓冲溶液缓冲的、pH为4.8至5.8的38％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明显地转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG。标明为ChiroClec(商标)的酶为可以通过商业途径从Altus Biologics购得的结晶状的交联酶。ChiroClec-CR为来自皱摺假丝酵母(Candida rugosa)的脂肪酶，ChiroClec-BL为枯草蛋白酶(一种蛋白酶)的结晶形式，而ChiroClec-PC为来自葱头假单胞菌(Pseudomonas Cepacia)的脂肪酶。南极洲假丝酵母B(Candida Antartica)(一种脂肪酶)、猪肝酯酶(一种水解酶)和芽胞杆菌属物种的蛋白酶均显示出特别高水平的活性。
表3针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选(38℃处理16小时/38％甲醇-水/0.1M MES缓冲溶液)
实施例4下面的表4说明多种酰基转移酶、酯酶、脂肪酶和蛋白酶显示出在用MES缓冲溶液缓冲的、pH为5至5.8的38％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明显地转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG。猪肝酯酶、枯草蛋白酶Carlsberg(一种蛋白酶)、芽胞杆菌属物种的蛋白酶、ChiroClec-BL与南极洲假丝酵母B脂肪酶均显示出特别高水平的活性。
表4针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选(38℃处理47.5小时/38％甲醇-水/0.1M MES缓冲溶液)酶 测量的 KLG MeKLG ASA BuKLGpH(ppm)猪肝酯酶5.3 705 2720 246 1368葱头假单胞菌脂肪酶 5.5 77 288466222猪胰脂肪酶 5.4 229 613222 10899皱摺假丝酵母脂肪酶 5.8 104 205155 5417α-胰凝乳蛋白酶 5.1 82 248546092青霉素酰基转移酶5.8 100 1607 306192黑色曲霉脂肪酶 5.3 214 391296470米赫毛霉脂肪酶 5.6 54 189108 7041ChiroCLEC-CR5.5 115 218993769枯草蛋白酶Carlsberg 5.1 307247 0 0南极洲假丝酶母A 5.4 166 316355943解脂假丝酵母脂肪酶 5.7 150 1660 6445南极洲假丝酵母B 5.3 22103520 60 0Humicola lanuginosa脂肪酶 5.2 129 241428017芽胞杆菌属物种的蛋白酶 5.3 37221940 2938ChiroCLEC-BL蛋白酶 537441724 54634ChiroCLEC-PC脂肪酶 5.7 108 1965 4148皱摺假丝酵母酯酶5.6 70 309616734L-1(假单胞菌属) 5.4 90 336117066L-2(南极洲假丝酵母B)5.5 26223764 14913L-3(Candida cylindracea)5.7 88 1583710343L-5(南极洲假丝酵母A)5.5 153 665424626L-6(假单胞菌属) 5.7 0 379136183L-7猪胰 5.8 94 884120 5488L-8(腐质霉属) 5.5 98 219 77299无酶5.6 75 234 55508无酶5.5 68 209 64968无酶5.6 65 277 16 5320实施例5下面的表5说明多种脂肪酶和蛋白酶显示出在用MES缓冲溶液缓冲的、pH为5.7至6.1的38％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明显地转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG。在该表中根据与其它酶进行比较，Prozyme 6(一种来自米曲霉的蛋白酶)、蛋白酶2A(来自米曲霉)与GC899(一种来自Geneneor国际公司的商品洗涤剂蛋白酶)显示出更高水平的活性。
表5针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选(38℃处理19小时/38％甲醇-水/0.1M MES缓冲溶液)
实施例6下面的表6说明多种脂肪酶和蛋白酶显示出在用MES缓冲溶液缓冲的、pH为5.3至6的8.6％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明显地转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG。蛋白酶M(米曲霉)、Prozyme 6(一种来自米曲霉的蛋白酶)、蛋白酶N(枯草蛋白酶)与蛋白酶2A(米曲霉)均显示出特别高水平的活性。
表6针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选(38℃处理19小时/8.6％甲醇-水/0.1M MES)
猪胰脂肪酶Fluka 5.8890 7911585284脂肪酶(Sigma-1754)脂肪酶5.9283 1161486196脂肪酶(Sigma-1754)脂肪酶6 348 1894158098脂肪酶(Sigma-8525)脂肪酶6 326 93 154112脂肪酶(Sigma-1754)脂肪酶6 300 1501548057脂肪酶(Sigma-3126)脂肪酶5.8787 48899 8829F-15(根霉属) 脂肪酶5.9218 1240 8682Lipozyme(Novo-液态) 脂肪酶5.8380 95 1017251GC899(蛋白酶) 蛋白酶5.633541765 2016991实施例7下面的表7说明多种酰基转移酶、酯酶、脂肪酶和蛋白酶显示出在用MES缓冲溶液缓冲的、pH约为5至6的8.6％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明显地转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG。南极洲假丝酵母B脂肪酶、猪肝酯酶与芽胞杆菌属物种的蛋白酶均显示出特别高水平的活性。
表7针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选(38℃处理19小时/8.6％甲醇-水/0.1M MES)酶注释KLG MeKLG ASA BuKLGL-1(假单胞菌属) 脂肪酶 137 116 477601L-2(南极洲假丝酵母B) 脂肪酶 5249 1921 0 768L-3(Candida cylindiacea) 脂肪酶 183 64107 6920L-4(假单胞菌属) 脂肪酶 239 163 889957L-5(南极洲假丝酵母A) 脂肪酶 278 344 0 6245L-6(假单胞菌属) 脂肪酶 90 219 156613L-7(猪胰) 脂肪酶 1007 575 106 5392L-8(腐质霉属) 脂肪酶 209 70150 7957无酶 168 152 6 8753无酶 152 144 3 8233无酶 170 137 188157ESL-001-01重组生物催 1271 906 375 4635ESL-001-02化公司的酶 883 329 332 5949ESL-001-03290 123 447 7333ESL-001-04511 161 306 6207ESL-001-05364 124 299 6402ESL-001-06329 117 118 6934ESL-001-070122 430 15752猪肝酯酶 2726 3731 423 10葱头假单胞菌脂肪酶241 109 224 9135猪胰脂肪酶333 291 314 7888皱摺假丝酵母脂肪酶296 86451 8697无酶 153 116 8 8234α-胰凝乳蛋白酶蛋白酶 3301076 65 3855青霉素酰基转移酶 1871248 1578110无酶 10073 3 5296无酶 144113 7 8106黑色曲霉脂肪酶47972 84 8455米赫毛霉脂肪酶229278 1568620ChiroCLEC-CR 脂肪酶 233155 11 7569枯草蛋白酶4463 93 0 4428南极洲假丝酵母A脂肪酶 21501757573解脂假丝酵母脂肪酶19862 92 8445芽胞杆菌属物种的蛋白酶4920 642 13 72ChiroCLEC-BL蛋白酶2860 1233 1354051ChiroCLEC PC脂肪酶127622 5653皱摺假丝酵母酯酶 178120 2259382实施例8下面的表8说明多种酰基转移酶、酯酶、脂肪酶和蛋白酶显示出在用MES缓冲溶液缓冲的、pH约为5.8至6.2的8.6％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明显地转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG。猪肝酯酶、南极洲假丝酵母B脂肪酶、芽胞杆菌属物种的蛋白酶和轻度交联的结晶状枯草蛋白酶(ChirClec-BL)均显示出特别高水平的活性。
表8针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选(38℃处理21小时/8.6％甲醇-水/0.2M MES)酶注释 pHKLGMeKLGASA BuKLG(ppm)猪肝酯酶 5.8 2373 4167 717 83葱头假单胞菌脂肪酶 5.9 173169 25 7384猪胰脂肪酶 5.9 303320 78 6860皱摺假丝酵母脂肪酶 5.9 260112 271 7351α-胰凝乳蛋白酶 5.9 5061239 146 4707青霉素酰基转移酶 6 1761172 98 5392黑色曲霉脂肪酶 5.9 493259 84 6364米赫毛霉脂肪酶 5.9 243283 54 7067无酶 5.9 198173 2 7137无酶 5.9 216153 0 7115无酶 5.9 223154 1 7319南极洲假丝酵母‘A’脂肪酶5.9 222142 148 6683解脂假丝酵母脂肪酶 6 721123 25 6721南极洲假丝酵母‘B’脂肪酶5.9 2708 709 20 28Humicola lanuginosa脂肪酶5.9 176129 10 7215芽胞杆菌属物种的蛋白酶 5.8 5553 603 0 33ChiroCLEC-CR(干燥的) 6.1 229170 2 7191ChiroCLEC-BL(干燥的) 5.9 4293 1282 6 1376ChiroCLEC-PC(葱头假单胞菌-干燥的)6.1 240268 2 7539德列马根霉脂肪酶6 178 0 0 7097雪白根霉脂肪酶 6.2178 18161 7102米根霉脂肪酶6.1159 11926 7611粘稠色杆菌脂肪酶6 415 1812 7275白地霉脂肪酶6.1146 1226 6140爪哇毛霉脂肪酶 6.2167 95 1417422米曲霉蛋白酶6.12193 1462 39 2904皱摺假丝酵母酯酶5.8129 13217 7164实施例9下面的表9说明对前述实施例中高活性的酶检测其活性的统计再现性。在严格控制pH的条件下比较来自上述实施例的8种酶，它们均被鉴定为显示出特别高水平的活性。在重新进行分析的过程中，所有以前鉴定的具有高水平活性的酶均保持了高水平的活性。这些酶显示出在用0.2M MES缓冲溶液缓冲的、pH约为5.6至6的8.6％甲醇-水溶液中把丁基-KLG明显地转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG。在该比较实施例中，南极洲假丝酵母B脂肪酶、猪肝酯酶与芽胞杆菌属物种的蛋白酶均显示出特别高水平的活性。猪肝酯酶显示出对酯基转移作用以及明显地转化为抗坏血酸的选择性。
表9针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选(38℃处理19小时/8.6％甲醇-水/0.2M MES缓冲溶液)酶 注释 PH KLGMeKLG ASA BuKLG(ppm)N蛋白酶蛋白酶 6 7001166297 5435南极洲假丝酵母B脂肪酶 5.84347 2207283 0猪肝酯酶 酯酶 5.91947 4258650 0芽胞杆菌属物种的蛋白酶 蛋白酶 5.65137 745 55 0ChiroClec-BL(干燥的) 枯草蛋白酶 5.83485 1235215 3045Prozyme-6 蛋白酶 5.83405 151873 1624蛋白酶M蛋白酶 6 554668 271 63292A蛋白酶 蛋白酶 5.91585 1501153 3954无酶 6 135149 14 8170无酶 5.9136127 16 8418无酶 6 142133 13 8570实施例10下面的表10比较了除有机溶剂的浓度更高以外其它与实施例9中相同的酶。南极洲假丝酵母B和芽胞杆菌属物种的蛋白酶显示出特别高水平的活性，这是因为在用0.2M MES缓冲溶液缓冲的、pH约为5.6至6.2的38％甲醇-水溶液中它们显示出把丁基-KLG明显地转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG。对猪肝酯酶而言，与实施例9所示的结果相比，尽管其活性仍很显著、但却观察到活性有所下降。
表10针对丁基-KLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选(38℃处理19小时/38％甲醇-水/0.2M MES缓冲溶液)酶 注释 pHKLGMeKLGASA BuKLG(ppm)N蛋白酶 蛋白酶 5.9 1761144 126 8153南极洲假丝酵母B 脂肪酶 5.8 1701 5710 213 199猪肝酯酶 酯酶 6 2031654 173 7030芽胞杆菌属物种的蛋白酶 蛋白酶 5.6 3104 4032 182 213ChiroClec-BL(干燥的) 蛋白酶 5.8 1261 1693 102 5572Prozyme-6蛋白酶 6 3501268 47 7517蛋白酶M 蛋白酶 6.2 141408 199 94002A蛋白酶 蛋白酶 6.1 178626 90 8666无酶 6 69 221 8 9418无酶 5.9 61 189 7 8790无酶 6 63 203 9 9367实施例11下面的表11比较了除将pH缓冲到大约5.2以外其它与实施例9中相同的酶。南极洲假丝酵母B和猪肝酯酶显示出特别高水平的活性，这是因为在用0.2M吡啶/吡啶 盐酸化物缓冲溶液缓冲的、pH约为4.9至5.3的8.6％甲醇-水溶液中它们显示出把丁基-KLG明显地转化成MeKLG和KLG。对芽胞杆菌属物种的蛋白酶而言，与实施例9相比，尽管其活性仍很显著、但却观察到活性有所下降。
表11针对BUKLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选(38℃处理约19小时/8.6％甲醇-水/0.2M吡啶/吡啶鎓盐酸化物)酶注释 pHKLG MeKLG ASA BuKLG(ppm)N蛋白酶 蛋白酶5.2 87 237 47 8320南极洲假丝酵母B 脂肪酶4.9 3460309753 0猪肝酯酶 酯酶 5.2 1613578737 390芽胞杆菌属物种的蛋白酶蛋白酶5.1 1613247370 3757ChiroClec-BL(干燥的) 蛋白酶5.1 987 136067 5603Prozyme-6 蛋白酶5.2 700 840 7 6470蛋白酶M 蛋白酶5.3 187 357 0 83872A蛋白酶 蛋白酶5.2 480 643 0 7523无酶5.3 97 0 153 9750无酶5.2 73 0 80 9547实施例12下面的表12比较了除有机溶剂的浓度更高以外其它与实施例11中相同的酶。南极洲假丝酵母B显示出特别高水平的活性，这是因为在用0.2M吡啶/吡啶 盐酸化物缓冲溶液缓冲的、pH约为4.7至5.1的38％甲醇-水溶液中它显示出把丁基-KLG明显地转化成MeKLG和KLG。与实施例9和11相比，所有酶均显示出活性有所下降。
表12针对BUKLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选(38℃处理约19小时/H 4.9/38％甲醇-水)酶注释PH KLG MeKLG ASA BuKLGN蛋白酶 蛋白酶 4.80 0 17 9093南极洲假丝酵母B 脂肪酶 4.719536470 0 5373猪肝酯酶 酯酶4.947 1970 11750芽胞杆菌属物种的蛋白酶蛋白酶 4.9333 2113 30 10043ChiroClec-BL(干燥的) 蛋白酶 4.997 4477 10950Prozyme-6 蛋白酶 4.90 1133 12730蛋白酶M 蛋白酶 5.173 2030 158872A蛋白酶 蛋白酶 5 67 1500 13920无酶 4.987 13 27 11753实施例13下面的表13比较了除将pH缓冲到大约2.3以外其它与实施例9和11中相同的酶。对于在用0.2M磷酸盐缓冲溶液缓冲的、pH约为2.3-2.7的8.6％甲醇-水溶液中把丁基-KLG转化成抗坏血酸、MeKLG和KLG而言，与实施例9和11相比，所有测试的酶均显示出活性有所下降。
表13针对BUKLG的水解/甲醇分解进行酶的筛选(38℃处理20小时/8.6％甲醇-水/pH2.3 0.2M磷酸盐缓冲溶液)酶注释 PHKLG MeKLGASABuKLGN蛋白酶 蛋白酶 2.4 203 03 8980南极洲假丝酵母B 脂肪酶 2.4 397 323 0 8463猪肝酯酶 酯酶 2.4 417 93 0 9500芽胞杆菌属物种的蛋白酶蛋白酶 2.3 347 00 10987ChiroClec-BL(干燥的) 蛋白酶 2.3 387 00 10580Prozyme-6 蛋白酶 2.4 440 00 12357蛋白酶M 蛋白酶 2.6 137 333 0 122372A蛋白酶 蛋白酶 2.7 163 347 0 10600无酶 2.3 487 00 10417无酶 2.3 413 00 9897无酶 2.3 407 00 9873实施例14下面的表14比较了在将pH缓冲到大约6时实施例9和11的前5种酶催化KLG酯化为甲基KLG(MeKLG)的能力或其催化KLG的环闭合以生成抗坏血酸的能力。与实施例9和11相比均观察到低水平的活性。
表14针对KLG的甲醇分解进行酶的筛选(38℃处理19小时/8.6％甲醇-水/0.2M MES缓冲溶液)酶 注释 pH KLG MeKLG ASA BuKLGN蛋白酶蛋白酶 63791 0 0 0南极洲假丝酵母B脂肪酶 64258 0 0 0猪肝酯酶 酯酶 64393 0 0 0芽胞杆菌属物种的蛋白酶 蛋白酶 64099 0 0 0ChiroClec-BL(干燥的) 枯草蛋白酶 6.1 3270 0 0 0无酶 64340 0 0 0无酶 63295 0 0 0无酶 64029 0 0 0实施例15下面的表15说明了在pH为3-3.2的8.6％甲醇水溶液中使用南极洲假丝酵母B脂肪酶作为催化剂由KLG生产MeKLG。选取该缓冲溶液作为KLG及其钠盐的混合物(约为1/9)。前三项包括酶催化剂并且在相同的条件下一式三份。随后的三项也一式三份，并且除没有酶存在之外其它与前三项的条件相同。前三项显示出在有南极洲假丝酵母B脂肪酶的情况下KLG明显地酯化为MeKLG。随后的三项说明在没有南极洲假丝酵母B脂肪酶的情况下没有进行上述转化。
表15针对KLG的酯化进行酶的筛选在38℃下处理68小时/在水相中含8.6％的甲醇/缓冲溶液＝KLG+NaKLG酶 注释pHKLG MeKLGASA BuKLG南极洲假丝酵母B8.6％ MeOH+KLG 3.1 9227460 0 0南极洲假丝酵母B8.6％ MeOH+KLG 3.1 9303530 0 0南极洲假丝酵母B8.6％ MeOH+KLG 3.2 9213413 0 0无酶 8.6％ MeOH+KLG 2.9 9530 0 0 0无酶 8.6％ MeOH+KLG 2.9 9477 0 0 0无酶 8.6％ MeOH+KLG 2.9 9600 0 0 0实施例16本实施例说明在进行HPLC分析的条件下抗坏血酸的缓慢分解。通过在水中溶解KLG、MeKLG、抗坏血酸(ASA)和丁基-KLG至合适的浓度来制备HPLC样品的标准品。把这些标准品样品放入管形瓶中、装满并密封，在室温下储存，并定期进行分析。根据标准品的面积响应来标定HPLC，其中在标准品制备完毕之后应尽可能快地将其注入HPLC中。下面的表16显示出50、100和500ppm的KLG、MeKLG、抗坏血酸和丁基-KLG标准品在制备样品后的0时(标定时间)、在大约6.5小时以及在大约12小时时记录的响应。
表16制备的量 发现的量时间KLG MeKLG ASABuKLG(分钟)050ppm标准品51 51.4 53.4 50.6400 39.9 47.7 28.3 42.7715 52 43 0 38.20100ppm 标准品102 103 107101400 94.3 106.8 96.6 100.1715 81.8 90.2 57.2 94.20500ppm 标准品510 514 534506400 479 496 487512715 493 495 473499对于其它的标准品、尤其是针对100ppm或者更低浓度的标准品而言，抗坏血酸的响应在整个时间范围内是非线性的。假定在HPLC分析之前对实施例2-16的处理包括在38℃下、在水浴摇床上处理大约16小时或者更长的时间，那么由此可见生成的抗坏血酸的实际水平要高于报道值。
具体地参考本发明优选的具体实例已经对本发明进行了详细的描述，但应当了解的是可以在本发明的精神和范围内实现变化和改进。
序列表(1)一般信息(i)申请人Hubbs，John C.
(ii)发明名称用于制备抗坏血酸、2-酮-L-古洛糖酸及2-酮-L-古洛糖酸酯的酶促方法(iii)序列数3(iv)通讯地址(A)收信人Eastman化学公司(B)街道邮政信箱511(C)城市Kingsport(D)州田纳西(E)国家美国(F)邮政编码37662-5075(v)计算机可读形式(A)存储媒体类型*(B)计算机*(C)操作系统*(D)软件*(vi)目前申请资料(A)申请号*(B)申请日*(C)分类*(vii)在先申请资料(A)申请号US 60/017,879(B)申请日1996年5月17日(viii)律师/代理人资料(A)姓名Cheryl J.Tubach(B)登记号*(C)参考/案件目录号70432(ix)电信资料(A)电话423-229-6189(B)传真423-229-1239(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度379个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO1Met Met Arg Lys Lys Ser Phe Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met1 5 10 15Leu Val Phe Thr Met Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro20 25 30Ala Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val35 40 45Lys Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys50 55 60Val Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp65 70 75 80Lys Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val85 90 95Glu Glu Asp His Val Ala His Ala Leu Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly100 105 110Ile Pro Leu Ile Lys Ala AsP Lys Val Gln Ala Gln Gly Phe Lys 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权利要求
1.一种用于制备2-酮-L-古洛糖酸酯的方法，该方法包括以下步骤(a)制备第一种2-酮-L-古洛糖酸酯的醇溶液并且该醇对应于将要生成的第二种2-酮-L-古洛糖酸酯的烷基部分；以及(b)然后在溶液中将所说的第一种2-酮-L-古洛糖酸酯与水解酶催化剂接触以生成所说的第二种2-酮-L-古洛糖酸酯。
2.权利要求1的方法，其中所说的水解酶催化剂选自由蛋白酶、酯酶、脂肪酶和酰胺酶组成的组中。
3.权利要求1的方法，其中在制备所说的醇溶液中使用助溶剂。
4.权利要求3的方法，其中所说的助溶剂选自由水、C1至C6的醇及其混合物组成的组中。
全文摘要
本发明的目的在于用于制备抗坏血酸、2－酮－L－古洛糖酸及2－酮－L－古洛糖酸酯的有效、高产的方法。该方法包括将合适的起始原料与水解酶催化剂、比如蛋白酶、酯酶、脂肪酶或酰胺酶反应。
文档编号C12N9/84GK1412315SQ0211996
公开日2003年4月23日 申请日期1997年5月16日 优先权日1996年5月17日
发明者J·C·胡布斯 申请人:伊斯曼化学公司