甜菜黑色焦枯病毒作为外源基因的表达载体的制作方法

专利名称：甜菜黑色焦枯病毒作为外源基因的表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程中使用的载体。具体的讲，是一种来源于病毒的可以携带外源基因在植物中表达的载体。
2.背景技术上世纪80年代以来，在我国新疆、宁夏、内蒙古、甘肃、黑龙江、吉林等甜菜主产区陆续发现了一种黑色焦枯型甜菜病毒病害，给生产带来了巨大的损失[崔星明等，石河子农学院学报，10(1)，73-78(1988)]。该病害在甜菜上的症状主要表现为叶片直立向上，叶脉间产生黑色焦枯病斑，叶缘内卷，根毛大量坏死等，对甜菜的危害已超过甜菜坏死黄脉病毒(Beet necrotic yellow vein virus，BNYVV)，并且日趋加重[刘杰贤等，中国甜菜，(3)，30-31(1995)]。1989年，仅宁夏发病面积便约占全区甜菜产区69.2％，其中，绝产或丧失使用价值的占4.6％。发明人经过10多年的研究，在国际上首次证明引起该病的病原微生物为一种新的病毒，并定名为甜菜黑色焦枯病毒(Beet blackscorch virus，BBSV)，同时还对BBSV的生物学、血清学、粒子形态及其传播方式等进行了深入全面的研究，获得了一系列的研究结果。
现已证明，BBSV是一种直径为28nm的球型病毒，外壳蛋白亚基为单一组分，分子量约为24.5kDa。自然条件下只侵染甜菜，人工机械接种条件下可侵染4科13种植物，如苋色藜、番杏和本生烟等。BBSV由甘蓝油壶菌(Olpidium brassicae)以游动孢子鞭毛体外带毒方式携带传播，血清学上只与烟草坏死病毒(Tobacco necrotic virus，TNV)柳树分离物具有较弱的血清学关系[蒋军喜等，江西农业大学学报，21(4)，525-528(1999)]。
甜菜黑色焦枯病毒是一种仅在我国发现的新病毒，在世界其他国家或地区还没有关于该病害的类似报道。中国是唯一开展对BBSV研究的国家，但目前对于该病毒的研究只局限于病毒的生物学、形态学和血清学等基础生物学的研究。本发明首次描述了BBSV基因组的核苷酸序列和结构特征，确认了基因组上不同基因的功能，在此基础上进一步对病毒基因组加以改造，使之成为能够携带外源基因并能在植物中高效表达的病毒载体。
3.发明内容1.测定了BBSV这种新病毒的全基因组核苷酸序列(SFQ ID NO 1)，确定了BBSV基因组的大小和结构。
序列分析表明，BBSV基因组为一条单链正意ss(+)RNA，由3641个核苷酸组成，包含6个开放阅读框(ORFs)。位于RNA 5’末端的ORF编码一个22kDa的蛋白P22，该蛋白的琥珀终止密码子通读(Reading-through，R/T)后可产生82kDa的通读蛋白P82，为病毒的依赖RNA的RNA聚合酶。在BBSV RNA 3’末端的ORF编码一个24.5kDa的外壳蛋白(CP)。在聚合酶基因和外壳蛋白基因之间有三个小的ORFs，分别编码4.2kDa蛋白P4.2和两个7kDa蛋白P7a和P7b(见图1)。经GenBank检索比较，BBSV虽然与烟草坏死病毒的D株系(TNV-D)的同源性最高，序列一致性程度也仅为61％。根据BBSV生物学和血清学表现、真菌传播特性、基因组的大小和结构，核苷酸序列同源性，以及在个别分离物中存在的卫星RNA组分等研究结果，发明人将BBSV定名为烟草坏死病毒属的一种新病毒。
2.构建了T7启动子控制下的BBSV侵染性cDNA克隆pUBF52，它含有SEQ ID NO 1核苷酸序列和T7启动子，BBSV基因组在T7启动子控制下能够得到转录，重新产生具有侵染活性的BBSV基因组RNA。
3.构建了CaMV 35S启动子控制下的BBSV侵染性cDNA克隆pRBS2，它含有SEQ IDNO 1核苷酸序列和CaMV 35S启动子，通过35启动子的作用，可以使BBSV的cDNA在植物体内得到转录，重新产生具有侵染活性的BBSV基因组RNA。
4.利用已获得的BBSV侵染性cDNA克隆pUBF52和pRBS2，对病毒基因组的不同区域进行突变改造，确认了BBSV基因组不同基因的作用，并对它们的功能区域进行了定位。
5.在对BBSV基因组功能基因进行精确定位的基础上，对BBSV基因组的不同区域进行缺失突变或者替换突变[本发明以水母绿色荧光蛋白(GFP)基因替换了BBSV的外壳蛋白基因为例]，在保证病毒的侵染能力和自身的复制能力并不受到明显影响的前提下，减弱病毒的致病能力，在此基础上构建出能够携带外源基因的病毒表达载体。
6.感染、转化寄主植物，测定了利用BBSV作为外源基因表达载体的效果。
将BBSV这一种目前仅在我国发现的新病毒，改造成为具有能够携带外源基因、便于操作、感染效率极高等特点的病毒载体，用于利用植物生产药用蛋白质，在材料上具有独创性。
4.


图1.BBSV基因组的结构与编码蛋白的大小图2.BBSV全长cDNA的PCR扩增结果A为λDNA/EcoR I+Hind III双酶切Marker；B为BBSV 3.64kb的全长cDNA的PCR扩增产物图3T7启动子控制下BBSV侵染性cDNA克隆pUBF52的体外转录产物A为pUBF52的体外转录物B为BBSV RNA图4T7启动子控制下BBSV侵染性cDNA克隆体外转录物侵染活性的Northern blot检测，其中g为BBSV基因组；sg1为亚基因组1；sg2为亚基因组2A为T7启动子控制下BBSV侵染性cDNA克隆pUBF52的体外转录物接种B为空白对照C为以BBSV RNA接种
图5T7启动子控制下BBSV侵染性cDNA克隆体外转录物侵染活性的Western blot检测A为空白对照B为以BBSV RNA接种C为以T7启动子控制下BBSV侵染性cDNA克隆pUBF52的体外转录物接种图635S启动子控制下的BBSV侵染性cDNA克隆侵染活性的Northern blot检测1为空白对照2为T7启动子控制下BBSV全长侵染性cDNA克隆pUBF52的体外转录物接种3为以BBSV RNA接种4和5为35S启动子控制下的BBSV侵染性cDNA克隆pUBS2接种图7BBSV基因组4种缺失突变体(pBDCP、pDCPn100、pDCPc6和pDCP18)结构示意8BBSV基因组不同缺失突变体体外转录物侵染活性的Northern blot检测A空白对照B接种物为BBSV的RNAC接种物为BBSV全长cDNA克隆体外转录物D-G接种物分别为BBSV外壳蛋白基因缺失突变体(pBDCP、pDCPn100、pDCPc6和pDCP18)的体外转录物图9用激光共聚焦显微镜(Confocal)观察水母绿色荧光蛋白(GFP)基因在BBSV病毒载体中的表达，绿色为表达的水母绿色荧光蛋白A为pUBF52(含BBSV全长cDNA，未插入GFP基因)体外转录物接种的苋色藜叶片B为pUB-GFP(由T7启动子控制)体外转录物接种的苋色藜叶片C为pRBS-GFP(由35S启动子控制)接种的苋色藜叶片5.具体实施方式
实施例1BBSV全基因组cDNA的克隆与序列分析从宁夏、新疆、内蒙古、甘肃、黑龙江、吉林等甜菜主产区表现黑色焦枯症状的甜菜上分离病毒，磨擦接种苋色藜(Chenopodium amaranticolor)和番杏(Tetragonia expansa)等寄主植物，采用PEG沉淀和差速离心等常规方法从苋色藜病叶中提取病毒，再经苯酚-氯仿抽提，获得BBSV的RNA。琼脂糖凝胶电泳检测结果，BBSV核酸为ssRNA，大小约为3.6-3.7kb，经Oligo(dT)纤维素柱洗脱实验证明，BBSV RNA的3′末端无Poly(A)尾序。
按照GIBCO BRL公司的标准操作程序，首先对BBSV宁夏分离物的RNA进行PolyA加尾。以Oligo(dT)12-18为引物，采用Promega公司cDNA合成试剂盒，对已加尾的病毒RNA进行cDNA合成。所得双链cDNA经T4 DNA Polymerase平端化处理后，克隆到pGEM-7Z(+)的SmaI位点。利用T4 Polynucleotide kinase以γ-32P-ATP对病毒RNA进行末端标记，与重组质粒进行点杂交，筛选出4个阳性克隆---pGB212、pGB159、pGB327和pGB146。采用Sanger的双脱氧终止法用ABI 377 DNA测序仪进行序列测定，其中pGB212、pGB159、pGB327三个阳性克隆具有相同的3’末端。根据所测序列，设计合成新的引物，继续进行cDNA的合成，最终获得BBSV近全长基因组。分别采用Invitrogen公司的5’RACE和3’RACE试剂盒获得并确认BBSV基因组的5’和3’末端序列，从而获得基因组全长序列。
按照《分子克隆实验指南》所述的基本分子生物学实验方法，根据BBSV基因组RNA末端序列设计引物BB-18和BB-14，以提纯的BBSV RNA为模板，进行逆转录--链式聚合酶反应(RT-PCR，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸4min)，可获得3641bp的BBSV全长cDNA(见图1)。
引物BB-18的序列为5′-TGTAATACGACTCACTATAGAAGAAACCTAACCAGTTCTCGTTGATCAGCGAT-3′，并与SEQ ID NO 1的1-34nt相对应，下划线为引入的T7RNA聚合酶启动子序列。
引物BB-14的序列为5′-TCCCCCGGGCCACCTGGAAGACCAGGTATAT-3′，与SEQ ID NO 1的3618-3641nt互补，下划线为引入的SmaI位点本实施例所涉及的各种试验方法和试验技术均为公知常识，按照《分子克隆实验指南》等所述的基本分子生物学实验方法，本领域的普通技术人员都能够实现。实施例2T7启动子控制下的BBSV侵染性cDNA克隆的构建、体外转录和侵染活性测定按照BBSV RNA末端序列设计引物BB-18和BB-14，其中BB-18引物的5′端引入T7 RNA聚合酶启动子序列，BB-14引物的5′端引入SmaI酶切位点(在BBSV全序列中无此位点)。以提纯的BBSV RNA为模板，RT-PCR扩增(94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸4min)，获得了3.64kb的BBSV全长cDNA(图2)。PCR产物经T4DNA聚合酶切平后，连入载体pUC18的SmaI位点。经筛选鉴定，获得了重组质粒pUBF52。
将重组质粒pUBF52用内切酶SmaI线形化后，以约100-200ng线性化的DNA为模板，用T7RNA聚合酶进行体外转录，可转录出了与BBSV病毒RNA大小相同的转录产物(图3)。将体外转录物摩擦接种苋色藜叶片，3-4天后，可以产生与BBSV RNA接种相同的小枯斑，发病严重程度及也无明显差别，说明BBSV基因组在T7启动子控制下能够得到转录，重新产生具有侵染活性的BBSV基因组RNA。实施例3T7启动子控制下的BBSV侵染性cDNA克隆的体外转录物侵染活性的Northern blot检测以pUBF52体外转录物和病毒RNA分别接种苋色藜叶片，提取叶片总RNA，经1％的变性琼脂糖凝胶电泳分离后，利用毛细管法，经20×SSC转移至Hybond-H+尼龙膜上。按照《分子克隆实验指南》所述的基本实验方法，以地高辛标记的BBSV 3′末端0.3kb非编码区为探针，经预杂交(42℃预杂交5-6小时)、杂交(42℃杂交12小时以上)、洗膜和显色等步骤进行Northern blot检测，结果显示除BBSV基因组RNA(大小为3641bp)主带外，还有两条小的亚基因组条带(图4)。说明pUBF52体外转录物和BBSV RNA一样不仅能侵染寄主植物，而且还能在寄主体内复制。实施例4T7启动子控制下的BBSV侵染性cDNA克隆的体外转录物侵染活性的Western blot检测用pUBF52体外转录物和病毒RNA分别接种苋色藜叶片，3-4天后取0.5-1.0克发病叶片，液氮中研磨，加入300μl的蛋白上样缓冲液(40mM Tris-Cl，pH6.8，10％甘油，2％SDS，5％β-巯基乙醇，0.1％溴酚蓝)，振荡后沸水浴10分钟，立即置于冰上冷却，离心取上清，经12.5％SDS-PAGE胶分离后，用电转移的方法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上，分别以发明人自制的BBSV特异性的抗血清和碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG为第一抗体和第二抗体，以NBT和BCIP为显色底物，对pUBF52体外转录物和病毒RNA在寄主植物体内的表达产物进行Western blot检测，结果显示，在pUBF52体外转录物接种的苋色藜叶片中可检测到与BBSV外壳蛋白大小一致(24.5kDa)的特异性条带(图5)，说明pUBF52体外转录物不仅能侵染寄主植物，而且还能在寄主体内复制并产生功能蛋白(如外壳蛋白)。实施例535S启动子控制下的BBSV侵染性cDNA克隆侵染活性的Northernblot检测根据SEQ ID NO 1核苷酸序列，设计并合成引物BB-26和BF-6，以pUBF52为模板，进行PCR扩增(94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸3min，共进行30个循环)，获得3641bp的BBSV全长cDNA，用T4DNA Polymerase平端化处理后，克隆进入含35S启动子的表达载体pRT103的BalI位点，获得重组表达质粒pRBS2。以35S启动子控制下的质粒pRBS2直接磨擦接种苋色藜叶片，同时以pUBF52(含T7启动子)的体外转录物和BBSV RNA分别接种苋色藜叶片作对照。4-5天后提取叶片总RNA，电泳后，将RNA转移至尼龙膜上，按照地高辛试剂盒所述的基本实验方法，经预杂交(42℃预杂交0.5小时)、杂交(42℃杂交4小时)、洗膜和显色等步骤进行Northern blot检测，结果显示35S启动子控制下的BBSV侵染性cDNA克隆和T7启动子控制下的BBSV侵染性cDNA克隆一样，都对BBSV的寄主植物苋色藜具有侵染性，说明35S启动子控制下的侵染性cDNA克隆不仅能侵染寄主植物，而且还能在寄主体内复制(图6)。
引物BF-6的序列为5′-GGGCACCTGGAAGACCAGGTA-3′，并与SEQ ID NO 1的3641-3618nt相互补引物BB-26的序列为5′-AAGAAACCTAACCAGTTTCTCG-3′，并与SEQ ID NO 1的1-22nt相对应实施例6BBSV基因组突变体侵染活性的Northern blot检测按照《分子克隆实验指南》所述的基本分子生物学实验方法，将位于BBSV基因组3’末端的外壳蛋白基因(位于SEQ ID NO 1核苷酸序列的2644-3342碱基处)全部或部分被删除，获得了BBSV基因组4种缺失突变体---pBDCP、pDCPn100、pDCPc6和pDCP18(图7)。采取构建BBSV全基因组侵染性cDNA克隆相同的方法，分别构建这4种缺失突变体的侵染性cDNA克隆。T7 RNA聚合酶体外转录后，将体外转录物分别接种苋色藜，3-4天后分别提取接种叶片的总RNA，以α-32P标记的BBSV 3′末端非编码区为探针，进行Northern blot检测，结果显示全长的侵染性克隆及4种缺失突变体均可检测到相应大小的RNA条带(图8)。说明BBSV外壳蛋白基因的4种缺失突变体在T7启动子控制下不仅能够得到转录，重新产生具有侵染活性的RNA，而且能够在寄主体内进行复制。实施例7所构建的BBSV载体可携带水母绿色荧光蛋白(GFP)基因并在植物中表达利用DNA重组技术，将外源基因[以水母绿色荧光蛋白(GFP)基因为例]插入到所构建的BBSV病毒载体中，检测所获得的重组BBSV载体是否可以携带病毒以外来源的基因并在植物中表达。
按照《分子克隆实验指南》所述的基本分子生物学实验方法，根据SEQ ID NO 1核苷酸序列，设计并合成引物BB-20和引物BB-21，以pUBF52为模板，进行反向PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，回收5.9kb的扩增产物，再以T4DNA聚合酶进行平端化处理，所获得的目的DNA片段包括载体pUC18序列和除外壳蛋白基因(位于SEQ ID NO 1核苷酸序列的2644-3342碱基处)外的BBSV基因组其余部分。根据水母绿色荧光蛋白(GFP)基因的核苷酸序列[Cormack，B.P.等，Gene，173，33-38(1996)]，设计并合成引物GFP1和引物GFP2，经PCR扩增获得完整的GFP基因。将上述5.9kb片段与GFP片段相连接，获得T7启动子控制并携带水母绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒pUB-GFP，其中BBSV基因组上的外壳蛋白基因被完整的GFP基因所替换。
采取相同的策略，对实施例5所构建的35S启动子控制下的BBSV侵染性cDNA克隆pRBS2进行替换改造，获得由35S启动子控制并携带水母绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒pRBS-GFP，其中BBSV基因组上的外壳蛋白基因被完整的GFP基因所替换。
将pRBS-GFP的质粒DNA和pUB-GFP的体外转录物分别接种苋色藜，3-4天后再分别以地高辛标记的BBSV基因组探针和GFP基因探针进行Northern blot检测，结果显示，所构建的两种BBSV载体(pRBS-GFP和pUB-GFP)中的BBSV基因组和GFP基因均能在在接种植物中转录和复制。用激光共聚焦显微镜(Confocal)扫描pUB-GFP体外转录物接种的苋色藜叶片，均可观察到绿色荧光蛋白的存在，说明GFP基因在所构建的两种BBSV病毒载体不仅能转录，而且能随着BBSV基因组的表达而得到表达(图9)。
引物BB-20的序列为5′-TTATTGACTATACTAGAAAGC-3′，并与SEQ ID NO 1的2643-2623nt相互补引物BB-21的序列为5′-ATCCCACATCCTGGTGTGG-3′，并与SEQ ID NO 1的3342-3361nt相对应引物GFP1的序列为5′-ATGAGTAAAGGAGAAGAA-3′，并与GFP基因的1-18nt相对应引物GFP2的序列为5′-TTATTTGTATAGTTCATCC-3′，并与GFP基因的717-698nt相互补6.SEQ ID NO 1的信息序列特征(A)(长度)3641个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)(拓扑结构)线性(1)分子类型cDNA(2)序列描述SEQ ID NO 11 AAGAAACCTAACCAGTTTCTCGTTGATCAGCGATCATGGATTCAATCCCGTATGTGATCC61TGCGCATACTCGATTTTATCTTCCACTCCATCTTCTTTCCATCTTTACTCTTTATCATCA121 ACCACAACACCACCATCCTGTGGGCATGTGCCTGTGCCTATGGGTTCTACCGTGCATTCC181 GCCTCATCTTCAAGATAAAGGTGGAAGTACACCCAGCCACCCGAGCCGTCTTCAAGGATA241 TGGTCACTCGCTTCCAGCGGGAGAGTATGTTCTCACCTGACGACGAAGTGCCGGAGGGCA301 TCCCTATCCACGAGGATGTTGACCTTGTTAGCGACCCCACACACAAAGATATTAAGAGGG361 TCCGTGCTAGCAGGCGAGTCTCTTATGCCGTGAGGGTTGCCCATGTAGCCAAGTCTAAGG421 TGGGATTGCTCGCCAATACCAAGGCGAATGAGCTGGTGTACTCCCGTCTTTGCCGAGACG481 AGATGGTTACCCACGGTGTGCGCCCATCGCACATTGCACACGCAGTGCCGCTTGCTGTCG541 CGGCCTGCTTCATACCGTTGGACAGTGATTTCCTTGCAGCTTCTATTAGAAACTGCGATG601 AGATGGAGGAGCGGAGGGCCGTACTAGGGCCCTCATATGGAAAATAGGGAGGCCTACTCT661 GCACCAGCGGGTTTACCACGCCTACTTGGCGTGGTAATCCAGAGGGTTTGCTGGTGAAGA721 GAGGACCACCTCTGGCCAAACCTAGGAAACTGTACCGTTTTTCTGGGTTTGGGACTCATA781 TACGGTACGGAGTGCACGATCACTCATTGGGCAATGTGCGGAAGGGACTTGTTGTGCGGC841 TATTCATGGTTGAAACCAAGGATGGCTTAGCTCCAACACCACAGCCCACCCTGGCGTGTA901 CGCCAAGTTATCCCGGTTTCATGACTGTTAGTGGCCAACCTAACCTCGACCACCAGATTA961 ACATACGAGCATTCTTCGGATTTTATTCTGGTCGCAAATTAGAGAGGTACCAACAGGCCG1021TGGAGTCGTTAGCAATCCGCCCAATAGGGGTACAGGATGCTGGGCTTAGCACGTGTGTTA1081AGGCTGAAAAATTAAACATCTCAGCCAAACCCGACCCGGCACCTAGGGTTATTCAGCCTA1141GGTCGCCGAGGTACAATGTGGAAGTTGGACGGTTCCTCAGACACGCTGAGGAACATCTGT1201TCGACGCCATCAACCGTGTGTATGGTGGGCGAACGGTATTCAAGGGGTTGAATGCCGATC1261AGGCTGGCATGGAGATGCAAGCTATGTGGCAAGAATTCGACAATCCTGTGGGTATTGGTA1321TGGATGCCTCTCGTTTCGACCAACACGTCTCTAAGGAGGCGTTGGAGTTTGAACACAAAA1381TCTGGCTATCCATGTACCATGGGGCTGACAGGAAAACATTGTCGAAGCTGTTGGGGATGC1441AAATCCACAACCGCGGTCTTGCCAGATGCCCTGATGGAGAAATCAGGTACACGGTTAAGG1501GGTGTCGTATGTCTGGGGACATCAACACATCTTCTGGAAACTGCTATATCATGTGTGCTT1561CGGTGCACAATTATTGCAGCCAGTTGGGTGTCAAGAGATTCAGGCTTGCCAACAATGGTG1621ATGATTGCATGCTTGTCGTCGAAGCCAAGGATGAAGCACGTGTCAGGCAGGGACTCATCG1681AGTATTATAGGGAATTGGGTTTCACCATGAAAGTGGAACCTACAGTCTATGAACTCGAGC1741ACTTGGAGTTTTGCCAGACACGTCCAGTCCTTGTCGATGGGGCATATCGAATGGTGCGCA1801ATCTTCACCAGGGCATGTGTAAGGATGTTCACTCCTTGCACGATCTTGGTAGTAGGAAAG1861CTGCTGAAGCTCGGGTTTCAGCGGTTGGTACTGGAGGCCGCGTGATGAATGATGGAGTAC1921CAGTGCTCAAATCATTCTTCATGCAGTTTCCCCTATCCTCTGGACCTAAAACCAAGTCTG1981ACATGAGTGTACCGTTGCAGGAAGATTGGAAATACAAATTCAATCGGACTGGGTGTTTCA2041AGAACTTGGCACCCACTCCACAATCCCGCTACTCATTTTGGCGTGCGTTTGGAGTGCTAC2101CAGTAGAACAGATTGCCCTGGAGAATGGGTTTTCTCGTCTCAGCTTTGATAAGCTGGACC2161AGGACACCCAGGAAGAAGTCAGCCTCCTCCAGTTCTCTGGGGCATGAAAACCTAACCACT2221TTTCATGGAACAACAGCGGAGTGAACAACGTCGTGATCGTAGAGTGAGAAGTAGATCGGA2281GGACAGGAAGTCTATGTCTGATGTAGGGCAATCTGCTGTCAATAGGGAAGCAGATGTCAA2341GAAAGATATGGGTCCATCGGTTTCTATGACGGTGGTGGGGGAGAACGTAGAGTTTACACA2401ACATTTCCACTTCTGAAATGAGCATCATTTATGTCGTACAGGAGAAGCCTTCTGGGTTTC2461TCGTGTGGGCATTGGTTGTTGCAATTGTGTGCATTATTGGACTCTTATCGTACACTCCAC2521CTGAAAGACTTAACCACTCTTATCACGAAAACAATCAGAAGACGCAATACATAACTATTG2581GAGGAGCATCCACTAGTAAAGTTGCCACGAACTGAATTTTCTGCTTTCTAGTATAGTCAA2641TAAATGGCACCTAAGCGCAATAAAGGAGGCAAGAAGTCCCGCATGTCCGATGAGACAGTG2701CGGGCTCCTGCTGCAGGAGGCGTTGTACAACGCACACCTGGCATTCCTCCCCGCATTAGG2761TCCACCACTATTGGTACGCGTGGCACCAACACTGAGCTGCTCGCTGGAGTGAATGTCGCT2821GCGGCGGGAGCTTTCTCAGTTGTTGGCGCTGGTCTTTTCCCCAGCAACCTTGGTTGGCTC2881AATGGGATTGCTTCCAATTATAGCAAATTTAGATGGCTTGCTATCAAGCTCATCTACATT2941CCCATTGTTCCTACCACTACCGCTGGGGCAATGACCATGGCTTTAACGTATGATCCTGCT3001GATGCTACGCCAACTAGTTTCCAACAAGTGCAACAGATGTATAACAGCATCACAGCACCT3061GTCTGGGCTGGATTTGATGGAGCTACTGTTCAGCTGCTAGGGGAGAGACCAACAACTGGG3121GCTGTGTGCATTGATGTGGATGTAAATCGGTTTGGATTTACATGGTACAGGTATGCTACG3181CTTGCTGCCATTACCGCACTCACTGCAAATGATAGGAATCTTTATATTCCTAGTGTTGGC3241AATGTGGCTACGTCTGGTGGTACTGCAGCCACCAATGTTGGCAATCTGATGATAAAGTAC3301AGCATTGAGCTCATTGAGCCAATACCTGCTGCCATTAATTAGATCCCACATCCTGGTGTG3361GTTAATCCAGTGAAAAATATTAGGAAATCCTTGGGATTCACACCCCAGGGAGGATGGCTT3421GCATAGTGCAGGTATGTTGAGTTACACTATGAGGTATTGGTGCTGAATCCTGGTAAACAG3481GCTTGACAGGTTTGGGTTGTTCCAGACCGATGTATTACCCAAGATACTCATGGTACTGTA3541CTAGAAAACACTATGCGTGCGCACACGGCTGGCTATGTCCTATCATAGCTGGGGGCCCCG3601GAGTGCGAAACCCTCTTATATACCTGGTCTTCCAGGTGCCC
权利要求
1.一种分离出的cDNA分子，其特征在于，它包括与SEQ ID NO 1中从核苷酸1-3641同源性高达70％的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的cDNA分子，来源于甜菜黑色焦枯病毒(Beet blackscorch virus，BBSV)，为BBSV的RNA基因组序列。
3.一种质粒载体，它含有SEQ ID NO 1核苷酸序列和位于其上游的T7启动子。其特征在于，通过T7启动子的作用，可以使BBSV的cDNA在病毒体外得到转录，重新产生具有侵染活性的BBSV基因组RNA。
4.一种如权利要求3所述的质粒载体，其特征在于利用DNA重组技术，将外源基因插入到完整的或者经突变改造的BBSV基因组中，并随着BBSV基因组的表达而得到表达；而且BBSV在携带其他外来基因的同时，自身的复制能力并不受到影响。
5.一种质粒载体，它含有SEQ ID NO 1核苷酸序列和位于其上游的CaMV 35S启动子。其特征在于通过35S启动子的作用，可以使BBSV的cDNA在植物体内得到转录，重新产生具有侵染活性的BBSV基因组RNA。
6.一种如权利要求5所述的质粒载体，其特征在于利用DNA重组技术，将外源基因插入到35启动子控制下的完整的或者经突变改造的BBSV基因组中，并随着BBSV基因组的表达而得到表达；而且BBSV在携带其他外来基因的同时，自身的复制能力并不受到影响。
7.将权利要求5或权利要求6所述的任意一种载体转入植物的方法，使外源基因可以在所获得的转基因植物中表达。
全文摘要
本发明描述了甜菜黑色焦枯病毒(Beet black scorch virus，BBSV)的全部核苷酸序列。BBSV全基因组的cDNA克隆在真核和原核启动子控制下能够得到转录，产生的病毒RNA对寄主植物具有感染能力。并以插入水母绿色荧光蛋白(GFP)基因为例，表明所获得的重组BBSV可作为载体，携带病毒以外来源的基因并在植物中表达。
文档编号C12N15/63GK1473933SQ02155378
公开日2004年2月11日 申请日期2002年12月11日 优先权日2002年12月11日
发明者于嘉林, 蔡祝南, 李大伟, 韩成贵, 刘仪, 曹云鹤, 原雪峰, 丁群 申请人:中国农业大学