大型电穿孔板、系统及其使用方法

专利名称：大型电穿孔板、系统及其使用方法
技术领域：
本申请涉及电穿孔。更具体而言，本发明涉及大型(例如，大容量、多孔等等)电穿孔板、与这种板结合使用的系统以及与这种板的使用有关的方法。
背景技术：
以下描述包括可用于理解本发明的信息。其并非承认这种信息就是现有技术，或者与要求保护的本发明有关，或者任何特别或隐含地提到的出版物就是现有技术。
电穿孔术是一种成熟的技术，其用于穿过膜移动外源性分子，其中该外源性分子包括核酸、药物、以及其它化合物，而该膜包括细胞膜以及形成脂质体和其它包脂囊泡(lipid-encapsulated vesicle)的膜。电穿孔术包括施加穿过样本的适当强度的电场，例如，该样本包含要能够进行引入所感兴趣分子的细胞。虽然电穿孔作用的机理并不完全清楚，但在本文中活组织电穿孔是公知的，包括细胞膜的脂双层的破裂，导致在膜中形成暂时性或永久性孔，允许外源性分子通过扩散进入细胞。
在本文中，以前的用于将外源性分子导入细胞以及其它包脂泡囊(lipid-enclosed vesicle)的体外方法，电穿孔术提供了以下所列的许多优点其可以用来同时处理全部细胞(或囊泡)群体；其可以用来将基本上任何大分子导入到细胞(或囊泡)中；其可以使用各种原发细胞系或株化细胞系(确立细胞株)，并且在用于某些细胞系时特别有效；以及在细胞类型和起源没有较大变型或适应的情况下其可用在原核细胞和真核细胞中。另外，电穿孔术可以用在悬浮液或培养物中的细胞上，以及组织或器官中的细胞上。细胞还可以是在暴露到要导入细胞中的分子物种之前进行电穿孔。实际上，细胞可以使得非常适于通过电穿孔进行转染或转化，其后，在暴露到要导入的分子(例如，编码一种或多种感兴趣的基因的表达载体)之前可以将它们进行贮存。
通常，体外电穿孔是通过将单通道装置(包括至少一对电极，即阴极和阳极)置于容纳样本的室(容器)如一次性试管，参见如Neumann et al.，Biophysical Journal，71，pp.868-77(1996)。通常，使用发生器施加电位，该发生器向含有获自患者的细胞群体的溶液或悬浮液发出高压电场脉冲，孔的形成是可逆的还是不可逆的除取决于细胞类型和发育阶段以外，还取决于激励参数如脉冲振幅、持续时间、波形形状、以及重复频率。可以相信，膜上孔的形成或者膜的穿透发生在细胞极上，细胞膜上的部位直接面对电极，因而，体验到最强的横跨膜的电场电位。不幸地是，在给定的电穿孔试验中，穿透程度会随细胞类型而变化，即使是给定群体中的细胞之间也是这样。变化还可以从使用相同的样本电解质条件和细胞类型的一次次试验中可以看到。另外，由于该方法可以在大的细胞群体(其个体的特征是不同的)中进行，因而，电穿孔条件通常可以仅选定来针对“平均”质量的具体细胞群体。
如上所述，电穿孔在传统上是在一次性单室试管中进行的，其通常用于电穿孔的最大容量约为1毫升(mL)。然而，这种技术冗长乏味、劳动强度大并且需要优化。迄今，增加电穿孔过程通过量的努力已经围绕多通道电极系统进行了考虑，这种系统已用于类似的高通过量外源性分子导入细胞，试图限制将细胞从培养容器转移到的电穿孔试管的需要。传统的多通道电穿孔装置包括多对电极，这些电极可以插入相应的多个室中，该室可容纳外源性物质和细胞。当前现有的多通道电穿孔装置包含8或96对同轴电极(Genetronics，Inc.，San Diego，Calif.)。这些装置用于标准的96孔板的电穿孔中，这种板由8行1 2列孔组成，其标准大小为约8.5厘米(cm)(宽)乘12.7厘米(长)，标准的孔间中心距约为9.0毫米(mm)。参见美国专利第6,352,853号。
虽然传统的用于多孔样本或群体的类似高通过量电穿孔装置已经发现了有限的应用，它们具有固有缺陷限制了它们更广泛的应用。这些缺陷包括这种装置采用两个独立的部件，也即多孔板和电极阵列，在加入各种试剂(例如，适宜缓冲液中包含宿主细胞的悬浮液以及要电穿孔到细胞中的外源性分子)后将多电极阵列插入多个孔中。在这种目前可得到的系统中，虽然多孔板可以是一次性的，但电极阵列不是一次性的，必须在每次使用后进行清洁，因此，极大地限制了这种系统的实际通过量及其自动化。这种系统的设计中的另一个主要缺陷是这种阵列的电极在导入孔后不能最优地设置在孔中，因为必须留下某些余隙空间以将电极插入到这些孔中。由于这种余隙空间减小了暴露在电场中样本的百分比，因此电穿孔效率必然会减小。而且，用于该系统的大多数电极阵列采用多个设置在中央针电极周围的圆柱形外电极。这种构造固有地导致了在每个孔的不同位置电场的强度变化。这种系统的另一个缺陷在于，由于这种系统中通常所用阵列中的电极对不能独立于阵列中的一个或多个电极对而得到激励，因而在任何一个板上只能试验一组激励参数。因此，对每一组选定的激励参数，优化试验需要使用至少一个多孔板。其它缺陷对本领域技术人员也可以知道，包括由于样本芯吸到电极上造成样本损耗。
另外，除上述不足外，当大量需要被电穿孔时，传统的技术通常依靠“流过(flow through)”系统，其中需要电穿孔的总量的一部分移到电穿孔室，并且施加电穿孔脉冲。然后，将该室倒空并根据需要重新注入多次，以对要进行穿孔的细胞总量中的所有细胞电穿孔。脉冲重复的原因是多方面的。例如，传统的高压电穿孔脉冲发生器通常在给定时间向仅仅约四个1毫升的试管提供能量。另一缺点在于，样本上的多脉冲要求对于样本中的细胞来说是有害的，在某些应用中其常常导致难以接受的细胞死亡率，这些应用中，已知分子转移到样本细胞中的发生率是较低的。例如，参见美国专利第6,207,488号、第5,676,646号以及第5,545,130号，用以说明流过电穿孔装置及它们的应用。
假设传统电穿孔装置由于其涉及通过量和容量，因而很明显需要适于高通过量的装置和系统以及其它大规模应用。如下所述，本发明针对这些及电穿孔技术的其它需要而做出。
定义在详细描述本发明之前，在本发明的说明书中所用的术语先进行定义。除这些术语之外，其它术语，必要时，在说明书中定义。除非在本文中有明确定义，本说明书中所用的技术术语具有该领域所公认的含义。
如这里所用的，术语“接触”是指任何将宿主细胞暴露到外源性分子的方法。例如，宿主细胞，或者宿主细胞群体，可以浸渍或泡在包含一种或多种外源性分子的电穿孔缓冲溶液中。宿主细胞与外源性分子之间的接触既可以发生在通过电穿孔应用电脉冲之前，也可以发生在其后。响应这种接触，外源性分子被“导入”宿主细胞中，同时，外部细胞进入宿主细胞并表现出短暂的或者稳定的效果，例如表达宿主细胞中的异种核酸分子(例如，产生通过表达载体编码的生物学绿色荧光蛋白质)。
“激励参数”是指在给定试验中通过一对电穿孔电极发出的特定激励特征。这些参数包括脉冲、持续时间、波形形状、重复频率以及脉冲之间的间隔。
“外源性分子”指任何预期用来导入到宿主细胞中的分子(例如，携带一个或多个基因的表达载体或编码有要表达的蛋白或多肽的异种核酸、反义分子(anti-sense molecule)、核糖酶、小干扰RNA等)。小分子药物，以及其它以某种方式暂时或永久改变的化学物质，细胞或其功能，包括细胞中的任何蛋白或酶的生物化学活性。
术语“遗传修饰的”是指一种或多种异种核酸向一个或多个宿主细胞中的导入。“异种核酸”是指起源于外来物种的核酸分子，或者如果来自同一物种，则基本上从其原始形态进行修饰，或者将导致导入核酸的复制数量的增加。
“宿主细胞”是任何一种外源性分子可以被导入到其中的细胞。宿主细胞包括真核细胞和原核细胞。真核细胞包括动物细胞、植物细胞、以及真菌细胞。优选的动物细胞包括那些来自哺乳动物(例如，牛科、犬科、马科、猫科、鼠科、羊科和猪科动物)的细胞，包括人和灵长类动物、鱼(例如，斑马鱼、鲑鱼、鳟鱼、以及其它在商业上重要的物种)，昆虫(例如，果蝇、蚊子、蜜蜂)、蜘蛛类、鸟类、甲壳类、和软体类动物，以及来自前述任一种生物体的细胞系。优选的植物细胞包括那些来自作物如谷类和观赏植物以及作为木材生长的树的细胞。优选的原核细胞为细菌细胞、特别是在分子生物学上有用的物种。将异种核酸导入其中的宿主细胞是指“重组体宿主细胞”。宿主细胞还包括人造细胞、脂质体、以及通过电穿孔可将外源性分子导入其中的任何其它脂质包封的囊泡。为简洁起见，本文中“宿主细胞”还可以被简称为“细胞”。
实施“体外”方法是指在生物体外实施该方法，并且包括体外方法的概念，其中，举例来说，将细胞样本从患者身上取出，并使用本发明的装置和方法进行电穿孔，以将一种或多种外源性分子导入细胞，其后将处理过的细胞再导入患者体内。
“大型”意味着本发明的电穿孔板能满足高通过量和/或大容量的应用。这里，“高通过量”是指在同一个电穿孔板上可以进行两次或多次，优选地，4、16、32、64、96、192、288、384、576、768、672、1536、3072或6144次，或更多同样的或不同的电穿孔试验。
“大容量”应用是指其容量超过传统的电穿孔试管或其它用于进行单次电穿孔试验的器皿的容量。虽然有公知的器皿可以容纳高达约10mL，特别是在流过电穿孔装置的情况下，但通常来说，传统的电穿孔试管或其它器皿提供的容量高达约1mL。在本发明的情况下，器皿可以容纳的容量从至少约1微升(μL)到约10毫升或更多。优选的大容量应用允许用于含有细胞的溶液的电穿孔，该溶液的体积具有至少约5mL，优选地，至少为10mL到约100mL或者更多。
这里所用的术语“核酸”或“核酸分子”是指单独片段形式的作为一个更大结构组分的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸(在另一实例中为多聚核苷酸)。核酸可以是单链的也可以是双链的，包括非天然产生的基础或主链结构。这种分子包括DNA、RNA、cDNA、反义的、核糖酶、以及三重成形分子(triplex forming molecule)。核酸可以是天然生成的或合成的，并且包含低聚核苷酸。本发明的方法中采用的DNA编码蛋白质或多肽可以是组合的，举例来说，由提供合成基因的cDNA片段或低聚核苷酸组合而成，这种合成基因能够在重组体转录单元中被表达出来。本发明的多聚核苷酸或核酸序列包括DNA、RNA、cDNA序列。
根据本发明“可取得专利的”组合物、方法、机器或制造品指的是这些主题在进行分析时满足专利性的所有的法定要求。例如，关于新颖性、非显而易见性等等，如果后来的研究表明一个或多个权利要求包括了一个或多个可以否定新颖性、非显而易见性等的实施例，那么，该权利要求，通过限定为“可取得专利的”实施例，特别是排除不可取得专利的实施例以外的实施例，来进行限制。而且，这里所附的权利要求按照能够提供最宽的合理范围，以及能够维护其有效性来进行解释。另外，如果一个或多个专利性法定要求被修改，或者如果用于评价具体的专利性法定要求是否满足的标准从本申请被公布为专利到所附一个或多个权利要求的有效性受到质疑时有了改变，这些权利要求要以这种方式解释(1)维护其有效性；以及(2)提供这种情况下最宽的合理解释。
“植物”是指所有标准植物、植物部分、植物细胞、或者植物细胞群，例如植物组织。其细胞可以结合本发明的电穿孔板来使用的植物纲包括任何高等植物，无论是单子叶的或是双子叶的植物，以及任何多倍性水平的植物，包括多倍体、双倍体以及单倍体植物。“单子叶的植物”或称“单子叶植物”，包括芦笋、田地玉米(fieldcorn)和甜玉米、大麦、小麦、稻米、高粱、洋葱、珍珠粟、黑麦和燕麦。“双子叶的植物”或称“双子叶植物”的实例，包括番茄、烟草、棉花、油菜籽、蚕豆、大豆、胡椒、莴苣、豌豆、苜蓿、三叶草、甘蓝作物或称芸苔(例如，卷心菜、椰菜、花椰菜、抱子甘蓝)、萝卜、胡萝卜、甜菜、茄子、菠菜、黄瓜、南瓜、甜瓜、哈密瓜、向日葵、以及各种观赏植物。
“植物细胞”是指任何植物的完整细胞，包括来自叶、胼胝体、胚胎、或者种子的细胞，以及任何产生配子的细胞和任何再生成全植物的细胞。因此，包括能够再生成全植物的多种植物细胞都包括在植物细胞的定义内。在本文中，术语“完整的”是指来自组织的单细胞或单细胞群，其中细胞与原生质体相比，具有完整无损的或未处理的细胞壁。
“多个”是指一个以上。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种大型电穿孔板，以及采用这种板的系统和试剂盒(kit)，以克服现有用于将外源性分子导入细胞(特别是以体外方式)的技术的缺陷。本发明的另一目的是提供一种使用这种电穿孔板的方法，例如，以在体外将外源性分子导入宿主细胞。
因此，本发明的一个方面涉及一种电穿孔板，包括多个可激励的电穿孔孔，其排列在固体基板上，其中位于该板中的至少两个孔可以独立地被激励，即当能量提供给这两个孔中的每个孔中的电穿孔电极时，其它孔中的电极不需被激励，尽管它们可以被激励。每个孔包括至少两个设置在其中的电穿孔电极(至少一个阳极和至少一个阴极)，并且用作可在其中进行独立电穿孔反应的器皿。
在该方面的优选实施例中，电穿孔板的孔被排列成至少两行和两列。在特别优选的实施例中，行的数目不同于列的数目。通常，但并非必要地，行与列的比约为2∶3。在某些优选实施例中，本发明的板包括排列成8行12列的96个电穿孔孔。在另外的优选实施例中，板包括排列成16行24列的384个电穿孔孔。其它优选的板结构包括192、288、576、672、768、1536、3072、或6144个电穿孔孔。为便于自动处理和与现有的生物科学中所用的板基高通过量系统(plate-based high throughput system)兼容，优选地，与传统的不起电的多孔板(例如，目前在自动高通过量复合筛分系统中所用的板)相比，该板的总体尺寸(长、宽、和高)对于每个板都是相同的，与电穿孔孔的行、列数目无关。
在很多实施例中，特别是在具有少于约384个电穿孔孔的板中，这些孔基本上是圆柱形或矩形盒，无论是哪一种情况，其在板的顶部的一端都是开放的。在另一些实施例中，特别是在具有较大数量的电穿孔孔时，例如，当从顶部看时，其长宽尺寸基本相同(呈方形)，其深度尺寸不同，通常大于长度和/或宽度尺寸。当然，在本发明的内容中，可以采用具有任何适当几何形状的孔，虽然优选的结构提供至少两个隔开的、基本平行的壁，在该壁上设置有一个或多个电极对。在任何情况下，优选地，当孔与孔之间比较时，板的电穿孔孔具有基本相同的尺寸。这种形状方面的一致性用于提供一种孔与孔之间基本相同的电穿孔响应，而其它一切都相同。由于电穿孔孔通常在顶部是敞开的(不存在可活动的盖板、密封等等)，每个孔都只具有一个底壁和至少一个侧壁(在圆柱形状的孔的情况下为一个，而在矩形或方形情况下为四个，等等)。可以理解，为有便于制造，举例来说，通过注模技术制造，当从侧面观察时，孔倾向于轻微锥形，其上部开口尺寸(即长和宽，或者直径)稍微大于孔底部的尺寸，因而便于将板从模具中取出。
可以理解，对于具有标准外部尺寸的电穿孔孔，电穿孔孔数目的增加通常会导致单个孔容量的减小。在本发明的一些实施例中，电穿孔板包含相对较少的孔(例如，96或甚至少至2-12)，使每个孔的容量在96孔板的情况下约为1亳升(ml)，在1 2孔的情况下约为10ml。优选的孔的容量范围为从约为10mL向下至约为1微升(μL)，虽然更小的尺寸也是可行的，特别是，举例来说，如果采用来自半导体制造业的光刻技术以产生包含容量在微米、甚至纳米级的电穿孔孔的情况下。
优选地，在根据本发明的电穿孔板的每个电穿孔孔(或室)中，孔中的一个电穿孔电极将安置、或设置成与该孔的另一电穿孔电极相对。优选地，给定壁上的电极基本上相互平行，以便于当在存在导电溶液的情况下，孔的电极在孔中产生均匀电场。在本文中，基本平行是指+/-10％，优选5％，甚至最好是1％或者更低。电极可以沿任何适当的方向设置，虽然优选地当板放置在表面上以接收细胞样本时进行观察时这些电极是被水平或垂直设置的。可能在任何给定的孔，例如大容量孔中的电极中，还包括多个单个电极(优选地排列成成对的对置电极，一个是阳极，而另一个是阴极)，其可以一起或者接连地被激励，并且其特定图案能够有助于电场在整个孔中基本上均匀分布。
优选地，将电穿孔电极集成到以流体密封方式的孔(以防止流体在加入孔中后泄漏)的侧壁中，使得其导电表面暴露到放置在孔中的样本中。可供选择地，为形成电极，电极材料(例如，金)可以沉积为在孔的侧壁上，优选地，沉积为薄膜、层或薄膜复合材料。用来沉积电极材料的方法包括浸渍、电镀(无电电镀或电解电镀)、喷涂、以及汽相沉积。电极(或者其暴露给宿主细胞的部分)优选地由生物兼容性的导电材料制成。这种材料的实例包括金、铝、钛、或非金属导电复合材料如石墨(或者聚合物，其填充或充分掺杂有足以使该复合材料用作可在本发明的实施中所用电极的一定量的导电材料)。
在某些实施例中，电极包括一种多电极材料的复合材料，例如铜、镍和金，以不同的时间在固体基板上施用其中每一种材料，从而构成多个电极材料层。优选地，在这种复合材料中，导电材料最外层(对向暴露的层)为生物兼容性的，虽然诸如，举例来说，成本、与下面的基板或附着层的兼容性(如果有的话)、制造或应用的便利、以及材料的导体特性这些因素可能影响本领域熟练技术人员在给定应用中的材料选择。
当施用于侧壁时，优选地，电极覆盖侧壁的多少按要求进行，以当结合其互补电极被激励时，在孔(电极间的容量部分)中产生基本相同的电场。可以理解，在采用了多个能以不同时间激励的电极组(例如对)的大型应用中，在电极(包括被激励的具体电极组)之间的含有细胞的溶液的容量部分中，不必是在整个室中，产生基本相同的电场。优选地，电极覆盖尽可能多的侧壁，因为这样除了允许电极间产生的电场的一致性最大化以外，还允许溶液容量范围可以更宽，可以达到要用到的给定孔的最大值。
电穿孔板中的每个电极都与一个导体(例如，导电的金属线或者触点)连接，该导体将能量从与该装置连接的电源送至具体的电极。在某些优选实施例中，给定列(或行)中的电穿孔孔中所用的电极以串联或者并联方式相互连接使得它们可以同时被激励或寻址，同时，没有与该被激励的孔连接的板的其它列(或行)中的电穿孔孔中所用的电极将不会被激励。在另一些优选实施例中，电穿孔板的每个孔所用的电极可以独立地被寻址，从而允许板的每个孔独立于板中所有其它孔而被激励。当然，在具有独立可寻址的孔的板中，需要对两个或多个孔进行类似的激励，例如，用来产生与特定激励参数转化率有关的统计数据。
本发明的电极板由适当的固体基板制成。在某些实施例中，实体基本由单一材料的同质复合物制成，而在某些其它实施例中，其可以由不同材料的复合材料制成。特别优选的基板是塑料，这是由于塑料廉价、易于形成所要求的形状(例如，通过各种模制方法，如注模)、抗断裂性、具有所需光学性能、以及易于加工(如果需要)。在优选实例中，固体基板的全部或部分对一种或多种波长(例如，可视电磁频谱中的波长)的光来说都是半透明的，而在其它实施例中，固体基板的全部或部分将是不透明的。
根据本发明的电极板还包括至少一个电连接件，允许将能量递送到板中的电极。任何适当的电连接件都可以采用，包括采用插头和插座的电连接件。在特别优选的实施例中，设置有多个接触点型电连接件，每个电极(或以相同参数被激励的一系列电极)通过这种单独的接触点连接到被激励的导体上。因此，每个接触点都是选择性地与至少一个电极连接，从而在需要时或者按照要求，允许电极被激励。接触点连接器的确切数目取决于在被独立激励的电穿孔孔(或者全部、或者部分行或列的孔)的数目以及在具体电路中是否设置了其它电子控制(如开关)。
当通过控制器进行控制时，电穿孔板上的电连接件允许能量施加到电极板上设置的一个或多个电极上，该控制器控制板中的某个电极(如果有的话)接收来自电源(例如脉冲发生器)的能量。可将该控制器内置在电源中，或者，可供选择地，其可以是一个单独的装置。
根据本发明的电穿孔板还可以包含跟踪或清单元件，例如，一系列提供唯一标识的光学可读条形码，从而在自动或半自动系统中可以跟踪特定的板。
本发明的一个有关方面涉及构造成用来接收大量细胞悬浮液以进行电穿孔的电穿孔板。在该方面的实施例中，板通常包括一个到大约50个，优选地为1个到少于约12个，单独的室。每个室都可以是顶部开放的，虽然这不是必要的。每个室还可以包括一个或多个口以允许流体流入和/或流出每个室。每个室还可以包括一个或多个内部挡板，以限制或控制室内的流体运动。在某些实施例中，电极可以设置在挡板上。在任何情况下，每个室都包括至少一个，优选地为多个设置在室壁上的电极组。包括每个电极组的电极设置在室的相对侧面上，每个电极组由多个电极组成，优选地，由阳极和阴极数目相等的偶数数目(例如，2、4、6、8、10、12或更多)的电极组成，虽然本发明认为电极组包含奇数(例如，1、3、5、7、9、11或更多)数目的电极也是可行的。实际上，电极组最少可以包括一个电极，在这种情况下，该电极将用来与这样配置的另一电极组相配合。特别优选地，电极组包括一对电极(例如一个阳极和一个阴极)。每个电极组可以独立地被给定室的其它电极组激励。同样，在一块板上包括多个室的实施例中，两个或多个室中的电极组可以同时或在不同时间被激励。
在包括多个电极组的特定室的电穿孔过程中，优选地，电极组按顺序地被激励。在电穿孔包括一系列脉冲(在每对电极组的电极之间)的实施例中，优选地，该施加在电极组的电极之间的一系列脉冲在该室中的另一电极组的电极被激励前就结束了。优选地，使用与用来为前组电极激励时相同的参数。在本文中的“按顺序地”，被认为，举例来说，邻近位于一个细长孔中的相对的电极将“按顺序地”被激励。可供选择地，脉冲可以来自孔的中部到孔的外端。
本发明的另一相关方面涉及一种试剂盒，包括根据本发明的电穿孔板，其中该板中的至少一个、一些、或者优选地，全部孔包含电受容能力的宿主细胞的等分试样。“电受容能力的(Electricallycompetent)”是指宿主细胞在适当电场施加时或施加后能轻易地吸收外源性分子。通常，细胞将悬浮在适于存储和运输的缓冲液中，细胞在其中可生存至少24小时，优选地为1-3天，甚至最好至少4-7天。可以理解的是，不同的细胞要求缓冲液包含不同的成分。而且，要求在冷冻状态下输送细胞，在这种情况下，将再次需要不同的缓冲液。因此，缓冲液的选择以及细胞组合可留给技术人员来确定。为了运输装有细胞的板，优选地，设置有适当的板盖(例如，可去除的箔片或者塑料盖)。为了防止单个孔中细胞悬浮液(呈液态或冷冻形态，视情况而定)的损失，优选地，该盖单个地密封每个孔。可将含有细胞的板单独进行包装或者以两个或多个含有细胞的板的捆形式进行包装。在每个包装中通常还提供包装说明书。
本发明的另一方面涉及采用根据本发明的电穿孔板的电穿孔系统。最低限度，这种系统将包括至少一个这种电穿孔板和适于与该电穿孔板的电连接器连接的电源。该电源还将包括控制器，或者不然的话，该系统将包括作为单独装置的控制器。该控制器控制板的各种电极的激励，优选地根据预设的程序进行控制，该程序可以是自定义的或者出厂设置(例如，选自列出多组预定程序的激励参数的菜单)。这种系统可选地包括板处理器，配置用来在电穿孔系统操作过程中控制电穿孔板。在优选实施例中，该板处理器包括与特定板中的电极组和导体相兼容的电连接件系统，从而当板放置在其中时，建立起适当的电连接，从而允许要求的激励参数传送给位于板中的独立可寻址的孔中的电极，或者在大容量板的情况下，传送给要同时被激励(例如，对置的对组)的每个电极组(对置的电极对)。可以理解的是，一个或多个电源、控制器、以及板处理器可以集成到单个的装置中，或者集成为比由独立电源、控制器或板处理器提供的多种功能数目要少的装置集合。
在该方面的其它实施例中，本系统还包括一个或多个板读出器，以收集来自板的电穿孔孔室的数据。在使用多孔板的高通过量系统中，读出器通常处于不同的位置。例如在电穿孔发生后，举例来说，在板处理器中，板可以被移动(例如，通过机器人或其它装置)到包含读出器的站。然后进行数据收集。在某些实施例中，这种系统还可以包括保温站，板(以及电从电穿孔后的细胞)在被移动到读取(或者数据收集)站前，在这里在要求的条件下被保温。
为收集数据，板读出器采用与在电穿孔板中进行的电穿孔试验中产生的数据兼容的读取装置，如果导入宿主细胞的外源性分子是编码有报道基因的核酸分子，并且该报道基因的表达产物是能够产生荧光的蛋白质，那么可以根据从特定的孔中发出多少荧光，用光度检测器(luminomitor)来收集数据。同样，根据需要，其它种类的外源性分子也可以进行标记，通常用与所采用的检测系统相兼容的部分。如果在不同的孔中使用不同的电穿孔条件、缓冲液、反应浓度等等，那么将可得到不同的结果。其它读取装置包括分光光度计(例如，用来测量外源性分子导入其中的宿主细胞悬浮液中光线的特定波长的吸收差、或者特定波长的范围)以及机器视觉装置(例如，用来评定电穿孔间外源性分子导入悬浮液中的宿主细胞中之后的细胞粘附)，虽然任何能够检测外源性分子处于其中的细胞的检测装置都可以采用。
在采用板读出器的实施例中，优选地，电穿孔系统还包括数据存储器，用来存储通过板读出器收集的数据，以在以后进行检查和分析。任何合适的数据存储器都可以采用。
可选地，电穿孔系统还可以包括板存储设备，用于在电穿孔试验期间或完成之后，优选地，在板读出器收集数据之后，存放电穿孔板。
在该方面的其它实施例中，电穿孔系统还包括优化计算机，适于利用存储在该存储器中电穿孔数据来优化电穿孔条件，该电穿孔条件可以是单独的、或者也可以是与其它试验条件相结合的。
而本发明的另一方面涉及一种将外源性分子导入宿主细胞的方法，包括利用电穿孔将外源性分子导入宿主细胞，该宿主细胞位于根据本发明的电穿孔板的电穿孔孔中容纳的悬浮液中。在这里，利用电穿孔“将外源性分子导入宿主细胞”是指使得宿主细胞能够利用电穿孔吸收外源性分子。电穿孔的结果是，外源性分子随后能够扩散到宿主细胞中。当然，也可以采用离子电渗疗法这样的技术，以进一步强化外源性分子被吸收到已经被电穿孔的宿主细胞中。在某些实施例中，外源性分子为核酸分子。在其它实施例中，它是小分子药物。可以理解的是，在给定的电穿孔反应中可以出现一种以上的外源性分子。
在某些方法中，宿主细胞通常为真核细胞或原核细胞。优选地，真核细胞包括动物细胞和植物细胞。特别优选地，动物细胞包括哺乳动物细胞(例如人和灵长类细胞，以及来自牛科、犬科、马科、猫科、鼠科、羊科、以及猪科动物的细胞)、昆虫细胞、鱼类细胞、鸟类细胞、蜘蛛类动物细胞、软体动物细胞、以及甲壳类动物细胞。特别优选地，植物细胞包括来自单子叶植物或双子叶植物的细胞。同样优选地细胞系由任何上述类型的细胞产生。
通过以下附图、详细描述、以及所附权利要求，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。


在参照下面的详细说明及附图的基础上，本发明的这些和其它方面可以变得更加明显。附图中表示了本发明的这些优选实施例，可将这些附图进行概述如下图1是根据本发明的多孔电穿孔板的例图。所绘出的板为一个96孔板2。将孔4编组成八行6、十二列8。每行的顶面10镀有导体以传输电流。与导体连接的电极12和14伸入孔内。阳极导体位于行的一侧，阴极及其导体位于另一侧。在该实施例中，与外部电源的电连接在板的边缘处进行，其中与电源连接的触点在阳极和阴极连接器的远端区域16和18处制成。
图2描绘了根据本发明的用于多孔电穿孔板的典型的电穿孔系统的各种部件。
图3描绘了根据本发明的大容量电穿孔板的各种典型实施例。图3A是根据本发明的大容量电穿孔板30的例图，其中该板适于大容量应用，其包括三个同样的电穿孔室32，每个电穿孔室都能容纳高达约15mL的细胞悬浮液。如图所示，每个电穿孔室32都安装在底板30上。每个室包括入口34和出口38，以及用于充入和清空该室的通气孔36。另外，在所描绘的实施例中，每个室具有便于操纵的人机工程部分40。
在图3B所示的例图中，以剖视图示出了在图3A中的电穿孔板的一个室上一种典型的电极布局。在这里，表示出了设置在室32内的一个壁上的三个电极39，该壁上的每个电极与另一电极通过壁上的绝缘部分41分开。在室中，这些电极39中的每个都成对地配有一个位于相对的壁上的电极39(未示出)，每个电极对都可以被独立地激励。优选地，每个电极对的电极都具有相同的尺寸并彼此直接相对地设置。优选地，每个电极对的电极还间隔成使得一个电极的表面平行于另一电极的表面，以确保在电极之间产生基本等强度的电场。在图3B所示的实施例中，室32的装有溶液的部分沿出口38的方向倾斜，以辅助将细胞悬浮液从室中排出。
图3C示出了图3A中的室32的可选实施例，与垂直设置的情况相对比，其中电极39为基本水平设置。如图3B中的实施例，所绘的位于室的一个内壁上的电极39彼此通过壁的一个小绝缘部41隔离开。
图3D和3E示出的实施例中，室32具有一系列内部缓冲板42(图3D)、44(图3E)，其可选地包括在该装置中。当具有该缓冲板时，其用于限制室39的样本容纳部45中的液体运动。在所描述的实施例中，每个室还具有样本入口34和样本出口38，以允许样本单向流入和流出该室。图3D示出穿过室32截取的剖面，以示出代表性的缓冲板42的构造。如所描绘的，每个缓冲板从室的顶部向下延伸，在室32的底面37与缓冲板的下表面48之间留有开口43。虽然具有多个其开口尺寸不同的缓冲板的结构也可以考虑，但优选地，当在室中以这种方式包括多个缓冲板时，位于一个缓冲板下的开口与其它缓冲板下的开口具有同样的尺寸。可以理解的是，缓冲板在其长度上还可以包括一个或多个具有不同形状和尺寸的附加开口，并且它们除连接到室内顶部外，还可以连接到室的一个或多个侧面。
图3E示出了一个相关的实施例，其中室32包括多个从室内的侧壁以交错方式延伸的缓冲板44，以使一个缓冲板44在其最接近相对的壁面49的面47之间留有开口43。可以理解的是，任何包含一个或多个缓冲板的适当实施例，不管缓冲板的结构如何，都是本发明所考虑的。实际上，缓冲板也可以包含多个电极(未示出)。
图3F示出了根据本发明的用于大型电穿孔板30的室32的另一典型实施例。具体而言，图3F示出了这种板的单个室从顶部向下看的视图，这种板包括四个电极对48a-d，每个电极对的阳极52与该电极对的阴极50直接相对地设置。在所描述的实施例中，将每个电极集成到并垂直地设置在室壁中，并与该具体的电极对的另一构件直接相对。在每个装有电极的壁中，电极通过该特定的壁上的绝缘部分41彼此分开。该板和室还包括将特定电极组中的每个阳极和阳极连接到能够与电源(未示出)连接的电触点上用以激励这些电极的导体(未示出)。在所描述的实施例中，每个电极组(此处为电极对)可以独立于其它电极组而激励。
本领域技术人员可以知道，附图中表示的实施例只是代表性的，并不描绘本发明的实际范围。例如，根据本发明的电穿孔板的各种部件可以有差别地布置，或者包括额外的和/或不同的部件。
具体实施例方式
在详细描述本发明前，可以理解本发明不限于所描述的具体电穿孔板、系统和方法，因为这些都可以改变。还可以理解的是，这里所用的术语是只是为了描述特定实施例，不是用来限制本发明的保护范围，该范围由所附权利要求来限定。
1.导入本发明的核心涉及大型电穿孔板。在某些优选实施例中，这些板具有至少两个孔，并且可以多至96、192、288、384、576、768、672、1536、3072、6144或更多同样的孔，这些孔包含可以独立激励或寻址的电穿孔电极。在另一优选实施例中，根据本发明的穿孔板包括至少一个、可以多至2-30或更多大容量的室，用于容纳含有电穿孔细胞的悬浮液。在这些实施例中，每个室包括可以独立激励或寻址的多个电极组。
可以理解的是，在本发明的情况下，“独立激励的”或“独立寻址的”等等，是指一对电穿孔电极(或大量的电极，包括电极组，例如对置的电极对)单独或远离任何其它电穿孔电极对而接收能量的能力。这种能力取决于板的设计，可以通过很多方式实现。例如，每个电穿孔电极对都可以分别地从其它电极对接线，其中每个电极对都是其自身独立电路的一部分，该电路由将电极连接到电触点以与电源连接。可供选择地，多个电极，优选地为电极对，可以配置成同一电路的元件，每个电极对具有与之相配合的开关。因此，当电路通电时，开关将决定具体电极对是否被激励。当然，也可以制造具有这种电路组合的板。这时用于单个孔(或室)的电极对(或组)可以独立操作，该孔(或其电极)被称为“可独立寻址的”。同样，在其它实施例中，其中板设计为使得若干个而非全部电极对或组为电路的一部分，并因而可以一起被通电(即在同一时间，没有开关动作)，这些电极对(及其相应的孔)与板中的其它电极(和孔)相对比，被称为独立可寻址的。
除电穿孔板和由装有电耐受能力的宿主细胞的这种板组成的试剂盒以外，本发明还涉及使用这种板的电穿孔系统。至少，这种电穿孔系统将包括对出现在电穿孔板中的电路供电的板处理器。因而，板处理器将包括提供所需电能以激励板的电极的电源，以及一个控制电路何时及如何供电的控制器(以及哪个开关，如果有的话，将打开或闭合)。控制器和电源可以是单独的单元，虽然优选地这些功能存在于单个的装置中。一个电穿孔系统还能包括一个或多个板读出器、数据存储装置、和/或计算机(例如，用来优化电穿孔参数、控制板的运动及处理等)。
本发明的这些及其它方面的优选实施例在下面全面描述。
2.电穿孔板本发明涉及电穿孔板，用在进行电穿孔试验中的制造物。至于用于高通过量应用的实施例，该板每个都包括多个可带电的孔，其中至少两个孔可以独立地被激励。这些孔设置在一个固体基板上，并被进行各个阶段的制造。为对每个孔通电，至少两个电极(一个阳极和一个阴极)永久性设置在其中。如同孔本身一样，这些电极被进行各个阶段的制造。这些电极用外部电源(在电穿孔现场通常被称为“脉冲发生器”)激励。类似地，在板包括一个或多个大容量室的实施例中，每个室都包括多个可以独立地被激励的电极组。电极组中的每个电极优选地都被设置在室壁中，室壁通常由固体基板制成。可以理解的是，室可以单独制造，然后再在合适的阶段连接到支撑件上。因此，用于将电极组连接到电源上的电路可以仅集成在室体本身中，或者可供选择地，可以包括有些留在室中，有些留在支撑件上的部件。在另一实施例中，室和支撑被制成整体单元，在该情况下，最终的单元将包括导体和电连接件，这些是为通过电源向该装置的电极供电所必需的。
a.设计如这里所描述的，根据本发明的高通过量的电穿孔板包括多个可带电的孔，其中至少两个被独立地供电。因为这种板看起来能够结合自动的高通过量筛分系统使用，所以优选地，该板被设计成在这种环境下操作，虽然这种兼容性并非关键。大多数高通过量生物分子筛分系统的开发者依据生物分子筛分学会出版、美国国家标准协会(Danbury Connecticut)批准的标准。其中，这种标准(草案、暂行或正式采用)已经限定了要用在这些系统中的板的一套通用尺寸。通常，标准在于板底面尺寸、高度尺寸、底面外侧法兰尺寸、孔的位置(例如，对于96、384以及1536孔的板)以及侧壁刚度等方面。这些尺寸的板可以很容易通过很多制药、生物技术以及农业生物科学公司以及学院和研究机构中所用的机器人系统以及自动硬件平台来处理。为促进这种高通过量应用的即时电穿孔板的广泛采用，要求这些板符合这些或随后发展的标准以支持自动化和交叉的平台兼容。
这种实施例的优选例包括那些其中电穿孔板包括按行和列编组起来的多个孔的实例。在这些实施例中的某些实施例中，给定列(或行)中的两个或多个孔(可以是、也可以不是该列中的全部孔)一起被激励，但板的其它列(或行)中的孔独立地被激励。在另外的实施例中，给定列或行的全部孔的电极可以一起被激励，但独立于板的其它电极。在这种实施例中，优选地，要一起被激励的特定列(或组列或其部分)操作性连接，从而当一个电极对被激励时，所有这些电极都可以通过具有特定激励参数的电能被激励。列或行的“部分”孔(或电极)指该列或行的孔(或电极)的两个或更多，但少于其全部。
在其它实施例中，本发明的电极板包括一个或多个用于进行大型电穿孔的大容量室。在这些实施例中，每个室包括多个可带电电极组，每个电极组最低限定包括至少两个电极。每个电极组可以独立被激励。可以理解的是，这种板可以设计成使得板和室制造成一个单一部分。可供选择地，板可以设计成包括两个或多个根据需要或要求可以组装的零件。例如，板可以包括支持件，制造用来接收一个或多个大容量室。在这些实施例中，这些室可以具有相同或不同的尺寸，即每个室可以具有容纳相同或不同数量的细胞。在多件组件中，支持件可以包含或者也可以不包含电部件。在支持件不具有电部件的实施例中，室单元包括必要的电路或连接器以在连接到适当的电源(即电穿孔脉冲发生器)后允许对电极激励。在支持件确切包括某一必要的电部件以对电极激励的实施例中，支持件或室包括进行电极和适当的电源之间所要求的连接所必要的这种连接器或部件。当然，本发明考虑了用于本发明的板的过剩电位构造。同样，根据本发明的板的确切设计留给本领域技术人员来处理。
b.固体基板根据本发明的电穿孔板可以用任何合适的固体基板来制成。优选的基板是那些可以通过模制方法和/或机器加工按要求规格制成的基板。特别优选的是可以通过注模或类似方法形成要求形状的塑料或其它聚合物。这种情况下，聚碳酸酯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(ABS)、以及聚苯乙烯是特别优选的，尽管任何能够塑造成根据本发明的大型电穿孔板的材料(或不同材料的组合物)都可以采用。在采用塑料的实施例中，可以理解的是，可将塑料用多种材料进行浸渍和/或加强以提供所要求的特性，例如改进的刚度、热耗散、对电流的绝缘等等。
塑料的另一优点是在根据本发明的电穿孔板的不同部分可以采用不同颜色和不同透明度的能力。例如，很多检测系统是基于特定波长的检测光。因此，在很多实施例中，电穿孔板的底部由透明塑料制成，而形成孔的侧面的塑料部分是由不透明塑料制成。
虽然塑料可以作为根据本发明的用于形成电穿孔板的固体基板的优选实例，但其它实施例采用陶瓷或金属。由于这些材料机器制备技术在本领域中是公知的，因而本领域技术人员考虑到本说明书，在本发明的实施中可以方便地采用这些材料。
c.电极电极可以由适当的导电材料或材料组合物，包括这些材料的复合物来制造或形成。优选地，电极所用的材料是生物兼容性的。当用多种材料(例如一种导电材料(例如金)镀在一种导电材料(例如镍)上，该导电材料又镀在一种导电材料(例如铜、或者掺杂有导电材料的载体上))制成电极时，优选地，至少最外层，即暴露在细胞悬浮液中的层，是生物兼容性的。优选地，生物兼容性材料包括金和钛。当然，其它导体(铝、各种不锈钢等)也可以使用，其选择由本领域熟练技术人员根据特定应用来确定。
电极和导体可以通过任何适当的方法加入电穿孔板中。例如，在某些实施例中，电极材料按照要求的位置进行电镀或以其它方式沉积在固体基板上。在其它实施例中，固体基板进行机械加工以接收用于一个或多个预成型孔的电极。
d.制造根据本发明的一个特别优选的实施例的高通过量电穿孔板(参见图1)通过下面所述的多步骤方法已经制造出来。具有用于96孔电穿孔板的基本结构的聚碳酸酯框架通过注模制成。该96孔布置成8行12列。然后，将每个孔的沿其行的方向布置的侧壁以及邻近每个孔的行的顶部用诸如ABS或聚碳酸酯/ABS(PC-ABS)塑料混合物模制形成，以使板在其适于用来电镀金属或其它用作电极或导体的材料的特定表面上提供表面特性。在这些孔被模制后，将板暴露在蚀刻溶液中，以制得涂覆(例如通过电镀)有电极复合材料的表面。
在此电穿孔板中，使用能够在聚碳酸酯与ABS材料之间进行了区分的电镀技术在固体基板(例如，在聚碳酸酯框架上由ABS形成的孔)的特定部位依次沉积不同的金属层形成相对较薄的膜层。最初，用无电镀铜电镀技术在板的ABS部分上镀覆标称厚度约为10微英寸(mi)的相对较薄的铜膜。这种情况下选用铜是由于其能将孔粘合到ABS上并在塑料和金属之间提供过渡结合。接下来，使用电镀技术在最初的铜层上沉积标称厚度约为1/1000英寸(1mil)的相对较厚的铜膜。在这样的板中，这些铜层提供大的载流能力。铜涂覆后，在铜上沉积标称厚度约为100mi的镍薄膜。使用镍是因为它的导电特性，并且因为它可以很好地与铜层粘合，并形成用于镀金的良好基底。最后，在镍上镀覆金饰层。由于其相对较贵，使用受控电镀技术来电镀金。金层的标称厚度约为10mi。可以理解，出于成本考虑，铜和镍层标称厚度可以改变50％或更多。实施本发明时可用的电极，包括上面所述的多层电极，优选地能够在不同电穿孔条件(包括使用标准缓冲盐溶液，400伏，10毫秒(msec))下使用，制造用于各种不同电穿孔条件的特定板。实际上，假定所有孔中有些孔与板中的其它孔相比可以独立电寻址(即激励)，那么可以用一个单个的板来检测多个不同的电穿孔条件。为质量控制目的，可以对这些电极，例如上面所述的三层电极进行了计算，使铜层具有0.18欧姆的标称径迹电阻(track resistance)，镍层为0.73欧姆，金层为2.5欧姆，使总电阻约为0.136欧姆。可以相信，约75％的施加电流(即电穿孔脉冲)将流经铜，虽然其会流入镍层再到铜层，到达样本。
在加入电极层后，使用在紫外光下固化的粘合剂将由塑料(例如聚合物或聚苯乙烯)制成的透明、绝缘底部结合到板的其它部分，从而确保每个孔的底部完全密封以防止孔与孔之间的泄漏。板底部像板的其它部件一样，可以是透明的、半透明的、或者不透明的。已经知道当板要用于荧光基化验(luminescence-based assay)时，白色的底部是优选的。在任何情况下，在将适当的底部固定到板上后，优选地，对板进行密封和消毒。
在根据本发明的高通过量电穿孔板的另一特别优选实施例中，将绝缘聚合物重复模制(over-mold)到配置的导电电极阵列上，从而，最终提供一个具有按8×12阵列布置的96孔的板，使得每个孔都包含至少一对电极，并且其中电极中的某些电极可以独立于板中其它孔的电极而被激励。
3.应用因为本发明的高通量电穿孔板提供至少两个包含可独立被激励或寻址的电极的孔，因此在一个单个的板上可以进行多个电穿孔试验。类似地，由于根据本发明的某些大型电穿孔板包括一个或多个大容量电穿孔室，每个室包含两个或多个可独立被激励或寻址的电极组，大量的细胞可以在一个单个的容器中被充分电穿孔。而且，当结合这种板使用时，现有的电穿孔电源可以被更有效地使用，因为其现在能够在不同的时间对板的不同区域，或者对一个单个的室的不同电极组激励，从而允许电源在激励之间进行充电。因此，电穿孔条件使用传统脉冲发生器就可以被优化。
本发明的另一应用包括将外源性化学药品如核酸分子导入宿主有机体(寄助物)(如真核和原核宿主细胞)中，这是因为这种技术是很多种试验、分析和治疗的核心。例如，当寻找对DNA库有益的基因时，必须首先将该库导入一个适当的宿主细胞群。由于典型的DNA库(例如，诸如人、小鼠、玉米等生物的基因库)非常复杂(即包含成千、上万、甚至更多不同的基因)，因而，需要完全表现库中每个基因的独立克隆的数量非常大。为建立完全表现一种生物体的基因组的库，举例来说，将DNA导入宿主细胞的效率变得很有限。通过优化该方法，建立和筛分DNA库的能力得以提高。
类似地，很多其它试验分析受限于将DNA导入宿主细胞的能力。当克隆大的DNA片段，以进行整个基因组分析(即使用细菌人造染色体)时，或者当进行基因随机诱变，随后克隆所有电位改变形式时，成功常常取决于最初的转换池(transformation pool)的尺寸。此外，改善将核酸导入宿主细胞的方法的研制条件增加了试验成功的机率。
除试验使用外，电穿孔可以用于治疗目的。在这里，本发明的板可以用来将具有治疗作用的外源性分子导入到患者细胞中，特别是以体外形式。治疗外源性分子的实例包括核酸分子。核酸可以被释放以产出所谓“基因治疗”的效果。可供选择地，本发明的大型电穿孔板可以体外形式被采用，以将来自从其它药物种类(例如，小分子药物、治疗蛋白等)的药物导入细胞。处理后，可以将该细胞导入患者体内。通常，该细胞将导入到从其身上取出该细胞的患者体内。
在开发和改进电穿孔方法论中，要识别影响外源性分子如核酸的转移效率的因素。这些因素包括电场强度、脉冲衰变时间、脉冲形状、反应温度、细胞类型、悬浮液缓冲成分、以及要转移的外源性分子(如核酸分子)的物种(包括一种以上的物种)的浓度和大小。给出了这些能够影响电穿孔试验效率的参数数量，在研究和商业设置中，限定那些能够使所需要的分子(例如，重组核酸)高效率地导入具体宿主细胞系的条件是很重要的。因此，为增加生物分子研究中电穿孔的使用和再现性的增加，优化是很重要的。
为进行优化，本发明的电穿孔系统典型地还包括优化计算机，其适用于使用存储在存储器中的数据，单独地或与其它试验条件相结合，优化电穿孔条件。因为根据本发明的高通过量的电穿孔板包括多个独立可寻址的孔，因此可以进行多个电穿孔试验。在这里，“电穿孔试验”是指在为给定孔(优选为多个孔)中的电极激励所用的特定组的激励参数。因此，在单个的板上可以进行多个不同的电穿孔试验。对特定细胞系或细胞群体来说，对结果数据的分析能使电穿孔条件优化。优选地，优化是通过使用统计方法和技术，如多变量分析来进行的，从而可以确定最佳的电穿孔条件(或至少是用于给定宿主细胞、缓冲剂、以及外源性分子的激励参数)。
***在本说明书中提到的所有专利和专利申请、出版物、科学论文以及其它参考资料都代表着本发明所属领域的技术人员的水平，其中的每一份资料在此都以同样的程度一并作为参考，就好比每篇资料都被完全独立地并入作为参考。申请人保留将来自任何这种专利和专利申请、出版物、科学论文、以电子方式得到的信息、以及其它参考材料或文献的任何或其它材料和信息物理地结合到本说明书中的权利。
本说明书中所描述的具体的电穿孔板、系统以及方法是代表性的优选实施例，是示例型的而不是对本发明涵盖范围的限制。其它的目的、方面、以及实施例可由本领域技术人员在考虑本说明书的基础上而想到，因而也包含在本发明权利要求范围所限定的本发明的精神内。可以理解的是，对于本领域技术人员来说，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种替换和更改。在缺乏某一要素或多个要素的情况下，也可实施在此所述具有说明性的本发明，但此处并没有专门披露其限制或限定因素。而且，术语“包括”、“包含”、以及“含有”等，要按照宽泛而不是限制的含义来理解。必须注意，这里以及所附权利要求中所用到的，单数形式“a”、“an”、和“the”也包括复数关系，除非上下文明确指出有其它含义。
术语及表达式的使用是用术语加以描述而不是用其进行限定，这些术语及表达式的使用并不排除本发明所述和所示的特征或其部分内容的任何现有或以后发展的等同特征，但本领域技术人员可以认识到，在本发明权利要求的范围内进行各种改动是完全可能的。因此可以理解，虽然本发明是通过优选实施例和可选的特征被明确披露，但是本领域技术人员可对所披露的概念进行改动和/或变更，这些改动和变更落入本发明所要求的保护范围之内。
本发明已经在此进行了广泛而一般性描述。每个更窄的物种和落入所披露的属内的亚属种群也构成本发明的一部分。这包括本发明的属的描述，其中附带的或否定性限制排除了任何来自属的主题，不管这些去除的材料是否在此具体引用。
其它的实施例均在下述权利要求的范围内。此外，本发明的特征或其内容是按照马库什(Markush)组加以描述的。本领域技术人员可以认识到本发明因此也可按照任何马库什(Markush)组的独立成分或成分的子组加以描述。
权利要求
1.一种电穿孔板，包括a.多个可激励的电穿孔孔，排列在固体基板上，其中，每个电穿孔孔包括至少两个设置在其中的电穿孔电极，并且其中在至少两个所述孔中的至少两个电穿孔电极能够独立地被激励；以及b.电连接件，用于将所述电穿孔电极连接到电源。
2.根据权利要求1所述的电穿孔板，包括约2、12、24、96、192、288、384、576、768、672、1536、3072或6144个电穿孔孔。
3.根据权利要求1所述的电穿孔板，其中，所述电穿孔孔具有基本相同的尺寸。
4.根据权利要求1所述的电穿孔板，其中，所述电穿孔孔基本上呈圆柱形或矩形。
5.根据权利要求1所述的电穿孔板，其中，每个电穿孔孔的容量是在约1μL至约10mL之间。
6.根据权利要求1所述的电穿孔板，其中，所述电穿孔孔的容量是在约1μL至约1mL之间。
7.根据权利要求1所述的电穿孔板，其中，所述电穿孔孔的容量是在约1mL至约10mL之间。
8.根据权利要求1所述的电穿孔板，其中，将所述电穿孔孔中的一个电穿孔电极设置在另一电穿孔电极的对面。
9.根据权利要求1所述的电穿孔板，其中，每个电穿孔孔包括至少一个侧壁以及底壁。
10.根据权利要求9所述的电穿孔板，其中，将电穿孔孔中的所述电穿孔电极一体结合到所述侧壁中。
11.根据权利要求1所述的电穿孔板，其中，所述电穿孔孔布置成多个行和列。
12.根据权利要求11所述的电穿孔板，其中，将一行的所述电穿孔孔中的所述电穿孔电极可操作地进行连接以同时被激励。
13.根据权利要求12所述的电穿孔板，其中，一行的所述电穿孔孔中可操作地连接的电穿孔电极能够独立地被所述电穿孔板的其它行的电穿孔孔中的所述电穿孔电极激励。
14.根据权利要求13所述的电穿孔板，其中，每行中的所述电穿孔电极均独立地被所述电穿孔板的其它行的电穿孔电极激励。
15.根据权利要求1所述的电穿孔板，其中，每个孔中的所述电极均包括多个电极，每个电极均是独立可激励的。
16.根据权利要求15所述的电穿孔板，其中，所述多个电极包括2至12对之间的电极。
17.根据权利要求16所述的电穿孔板，其中，每对电极中的电极包括彼此相对地设置在所述孔中的阴极和阳极。
18.根据权利要求17所述的电穿孔板，其中，至少两个相邻对的电极作为电极组同时被激励。
19.根据权利要求1所述的电穿孔板，其中，每个电穿孔孔中的所述电穿孔电极均是独立可激励的。
20.根据权利要求1所述的电穿孔板，其中，包括所述固体基板的材料是选自由塑料、金属、和陶瓷组成的组。
21.根据权利要求1所述的电穿孔板，其中，所述固体基板是透明的。
22.根据权利要求1所述的电穿孔板，其中，所述固体基板是半透明的。
23.根据权利要求1所述的电穿孔板，其中，所述固体基板是不透明的。
24.根据权利要求1所述的电穿孔板，其中，所述电穿孔电极被集成在所述固体基板中。
25.根据权利要求1所述的电穿孔板，其中，所述电穿孔电极沉积在所述固体基板的表面上。
26.根据权利要求1所述的电穿孔板，其中，所述电穿孔电极是通过汽相沉积进行沉积的。
27.根据权利要求26所述的电穿孔板，其中，所述电穿孔电极包括导电材料或多种导电材料的复合材料。
28.根据权利要求26所述的电穿孔板，其中，所述电连接件包括插头和插座。
29.根据权利要求26所述的电穿孔板，其中，所述电连接件包括独立的电触点，用于每对独立被激励的电穿孔电极。
30.一种电穿孔系统，包括a.根据权利要求1所述的电穿孔板；以及b.电源，用于连接到所述电穿孔板的电连接器。
31.根据权利要求30所述的电穿孔系统，还包括板处理器，用于在所述电穿孔系统操作过程中容纳所述电穿孔板。
32.根据权利要求30所述的电穿孔系统，还包括板读出器。
33.根据权利要求32所述的电穿孔系统，其中，所述板读出器使用选自由机器视觉装置、分光光度计、和光度检测器组成的组中的读取元件，以便通过检查所述电穿孔板的一个或多个电穿孔孔中的内含物来收集电穿孔数据。
34.根据权利要求32所述的电穿孔系统，其中，所述板读出器被集成到所述板处理器中。
35.根据权利要求30所述的电穿孔系统，其中，所述板处理器为机器人板处理器。
36.根据权利要求35所述的电穿孔系统，还包括板存放设备，用于在电穿孔试验期间或完成之后存放电穿孔板。
37.根据权利要求36所述的电穿孔系统，其中，所述板存放设备是保温箱，用于容纳多个电穿孔板。
38.根据权利要求33所述的电穿孔系统，还包括数据存储装置，用来存储通过所述板读出器收集的数据。
39.根据权利要求38所述的电穿孔板，还包括优化计算机，适于根据存储在所述存储器中的电穿孔数据来优化电穿孔条件。
40.一种将外源性分子导入宿主细胞的方法，包括利用电穿孔将所述外源性分子导入所述宿主细胞，所述宿主细胞位于根据权利要求1所述的电穿孔板的电穿孔孔中容纳的悬浮液中。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述外源性分子为核酸。
42.根据权利要求40所述的方法，其中，所述宿主细胞选自由真核细胞和原核细胞组成的组。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述真核细胞选自由动物细胞和植物细胞组成的组。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述真核细胞是动物细胞，所述动物细胞选自由哺乳动物细胞、昆虫细胞、鱼类细胞、鸟类细胞、蜘蛛类动物细胞、软体动物细胞、和甲壳类动物细胞组成的组。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述真核细胞是哺乳动物细胞，所述哺乳动物选自由牛属动物、犬齿动物、马科动物、猫科动物、鼠科动物、羊科动物、和猪科动物组成的组。
46.根据权利要求43所述方法，其中，所述真核细胞是来自哺乳动物细胞系的细胞。
47.根据权利要求43所述的方法，其中，所述真核细胞是来自单子叶植物或双子叶植物的植物细胞。
全文摘要
本发明公开了一种电穿孔板(2)，包括多个排列在固体基板上的可激励电穿孔孔(4)或室，其中，板(2)中的至少两个孔(4)可以独立地被激励。每个孔(4)包含至少两个设置在其中的电穿孔电极(12、14)，并用作在其中能够进行单独电穿孔反应的容器。另外，本发明公开了一种使用根据本发明的电穿孔板(2)的电穿孔系统以及一种使用这种电穿孔板(2)和系统的方法，例如，用以优化电穿孔条件。
文档编号C12N1/00GK1732260SQ200380107770
公开日2006年2月8日 申请日期2003年12月3日 优先权日2002年12月3日
发明者安德烈·S·盖米林, 丹尼尔·D·霍尔特, 克里斯琴·S·安德烈 申请人:基因特伦尼克斯公司