氧化还原酶的制作方法

专利名称：氧化还原酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及氧化还原酶，该氧化还原酶的片段及分离出的DNA序列，以该氧化还原酶或该片段为基础的融合蛋白质，及以对映体选择性的取得S-2-羟基酸酯类的方法。
现有技术2-羟基酸及其酯类为重要的手性基础合成构造块，由此，可衍生出多种在C2原子处仍保有手性的化合物，例如环氧化物、烷基酯类、肼基酯类、α-N-烷氧氨基酯类或α-氨基酯类。
先前已有许多研究致力于发展用于制备对映体异构上纯的2-羟基酸类及其酯类的方法，且已考虑过许多不同的化学及生物催化方式。直到现在仍无法发展出可满足工业制造规模要求的方法。以酶-催化方式引入手性中心的方法显示优于化学催化合成的方法，尤其是在制备2-羟基酸类及其酯类方面。
目前以酶-催化的方法包含三种不同的方法。一种途径为经由氧腈酶催化来合成手性氰醇类，再接着将其水解，此反应通常亦由酶催化(Biotransformations in Organic Chemistry，A Textbook.4thedition，Springer(2000)，K.Faber；Cyanohydrin formation)。此方法具有使用毒性HCN的缺点。
另一种方法是由脂酶(例如来自荧光假单孢菌)辅助来解析2-羟基酸酯类(J.Org.Chem.55，812-815(1991)，Kinetic Resolution of2-substituted Esters catalysed by a Lip ase Ex.Pseudomonasnuoreszens，Kalaritis，P.et al.)。此方法的缺点为理论产量仅有50％。
另一种方法为经由还原前手性2-含氧酸类或其酯类来合成手性2-羟基酸类及其酯类。以全酵母细胞，或以普通变形菌或奇异变形菌的细胞转化，或利用分离出的酶来进行的方法已为人所知。在以全酵母细胞转化的情况中，还原酶对2-含氧酸类的作用是来自于乳酸脱氢酶或苹果酸脱氢酶(Ramesh N.Patel Stereoselective Biocatalyse，NY(2000)，14.Stereoselective Synthesis of Chiral Compounds UsingWhole-Cell Biocatalysis，Paola D‘Arrigo，Giuseppe Pedrocchi-Fantoniand Stefano Servi)，而在以变形菌进行的还原反应中，此反应显然由一种经细胞膜连接的钼-依赖性铁-硫蛋白质所引起(Eur J Biochem(1994)；222(3)1025-32，The(2R)-hydroxycarboxylate-viologen-oxidoreductase from Proteusvulgaris is a molybdenum-containing iron-sulphur protein，TrautweinT，Krauss F，Lottspeich，F，Simon H)。
在已知的用来还原2-含氧酸酯类的方法中，其使用分离的酶类(D/L)-乳酸脱氢酶(US 5,686,275)、(D/L)-二羟基异己酸脱氢酶(US6,033,882)和D-扁桃酸脱氢酶(Appl Environ Microbiol 2002 Feb；68(2)947-51，Two forms of NAD-dependent D-mandelatedehydrogenase in Enterococcus faecalis IAM 10071.Tamura Y.et al10)，这些酶亦可以为克隆的、过表达的和市售形式的。这些酶为NADH-依赖性的，并且不会转化2-含氧酸酯类。现已进一步知道还原2-含氧酸类或其酯类的酶不会转化仲醇。
而且，以甲酸脱氢酶(如来自博伊丁假丝酵母或来自荧光假单孢菌的重组形式的)重新产生辅酶NAD的方法已为人所知(Biotechnology，Biotransformations I(Rehm and Reed)9.AlcoholDehydrogenases-Characteristics，Design of Reaction ConditionsJ.Peters，WILEY-VCH-Verlag，(1998))。本文中由实施例来陈述此种由来自表皮葡萄球菌的D-乳酸脱氢酶制备R-2-羟基-4-苯基丁酸的方法(Industrial Biotransformations，Liese，K.Seelbach，C.Wandrey，WILEY-VCH-Verlag，(2000))。利用甲酸脱氢酶来重新产生辅酶的缺点为该甲酸脱氢酶的特异活性低(4-10单位/毫克)，且制备此酶的花费高。因此，从经济观点来看，此酶需使用数次，而实质比较下，这造成更为复杂、更昂贵的控制过程。

发明内容
本发明的目的是以氧化还原酶去除所述现有技术方法的缺点。
根据本发明，此目的可在NADPH和水的存在下，由可将2-含氧酸酯类还原成相应的S-2-羟基酸酯类的氧化还原酶来实现。
尤其是，本发明涉及例如可从路氏乳杆菌(Lactobacillus(L.)reuteri)、克非利乳杆菌(L.kefiri)、坎得利乳杆菌(L.kandleri)、类布氏乳杆菌、纤维二糖乳杆菌或发酵乳杆菌取得的氧化还原酶。
本发明还涉及具有根据如附属序列表中所描述的SEQ ID NO19的DNA序列和SEQ ID NO18的氨基酸序列的路氏乳杆菌氧化还原酶。
本发明还涉及其中有超过70％的氨基酸与氨基酸序列SEQ IDNO18相一致的氧化还原酶，且根据2-氧-4-苯基丁酸乙酯转化成S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的反应，其具有超过1微摩尔/毫克的特异活性。优选的氧化还原酶为其中有80％-99.5％的氨基酸与SEQ ID NO18的氨基酸序列相一致的氧化还原酶，更优选的为有90％-99.5％相一致，尤优选有99％-99.5％的一致。根据SEQ ID NO18的氧化还原酶或其衍生物或类似物的特异活性利用实施例2中所描述的分析测量。
本发明还涉及一种氧化还原酶，其比具有氨基酸序列SEQ IDNO18的氧化还原酶多出1-50个氨基酸或减少1-50个氨基酸，且其根据2-氧-4-苯基丁酸乙酯转化成S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的反应而定具有超过1微摩尔/毫克的特异活性。优选的氧化还原酶为那些比氨基酸序列SEQ ID NO18多出或减少1-25个氨基酸的，尤其是多出或减少2-20个氨基酸的，而优选多出或减少3-10个氨基酸的。
本发明还涉及一种氧化还原酶，其具有SEQ ID NO18氨基酸序列，并曾以水溶性聚合物修饰过一次、二次、三次、四次或五次，且根据2-氧-4-苯基丁酸乙酯转化成S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的反应，其具有超过l微摩尔/毫克的特异活性。一种水溶性聚合物的实例为聚乙二醇。聚乙二醇优选连接根据SEQ ID NO18的氧化还原酶的N-端。根据SEQ ID NO18的氧化还原酶亦可连接至固体上，如聚乙烯、聚苯乙烯、多醣、纤维素或纤维素衍生物。
本发明还涉及一种具有5-30个氨基酸，代表氨基酸序列SEQ IDNO18的片段的氧化还原酶片段。此种片段优选具有6-25个氨基酸的氨基酸链的SEQ ID NO18的片段，以具8-20个氨基酸更优选，尤其是具10-18个氨基酸的，更特别为氨基酸序列SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。这类片段可用来，如从路氏乳杆菌或从任何其它微生物找寻本发明的氧化还原酶。
本发明还涉及一种融合蛋白质，其代表具氨基酸序列SEQ IDNO18，或其5-30个氨基酸的片段的氧化还原酶，且该氧化还原酶或该片段在N-端或羧基端经由肽键连接另一多肽。融合蛋白质可相对容易地，如从其它蛋白质中移出，或可大量表达在细胞中。
本发明还涉及特异结合根据SEQ ID NO18的氧化还原酶，或其根据SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的片段的抗体。这些抗体是根据已知方法，经由将合适的哺乳动物，如马、小鼠、大鼠或猪免疫接种，再取得该抗体来制备。这些抗体可为单克隆或多克隆的。
本发明也涉及分离出的核酸序列，其编码根据SEQ ID NO18、SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氧化还原酶。
本发明还涉及一种分离出的氧化还原酶的去氧核糖核酸序列(DNA序列)，该氧化还原酶可在NADPH和水的存在下，催化2-含氧酸酯类还原成相应的S-2-羟基酸酯类的反应，其中该DNA序列选自a)具有根据SEQ ID NO7、SEQ ID NO12、SEQ ID NO15或SEQ ID NO19或其各自互补链的核苷酸序列的DNA序列，b)与一或多种根据a)的DNA序列，或其互补链杂交的DNA序列，该杂交反应在严紧条件下进行，及c)由于遗传密码子的简并性，可编码由一或多种根据a)或b)的DNA序列所编码的蛋白质的DNA序列。
杂交作用描述于，如Sambrook and Russel in Molecular Cloning，a laboratory Manual，volume 1，chapter 1，protocol 30-32中。
本发明还涉及一种分离出的DNA序列，其中有超过70％的核酸碱基与根据SEQ ID NO7、SEQ ID NO12、SEQ ID NO15或SEQID NO19的DNA序列或其互补链相一致，且其编码一种根据2-氧-4-苯基丁酸乙酯转化成S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的反应具有超过1微摩尔/毫克的特异活性的蛋白质。优选的DNA序列为其中有80％-99.5％的核酸碱基与根据SEQ ID NO7、SEQ ID NO12、SEQID NO15或SEQ ID NO19的DNA序列相一致，尤其是90％-99.5％相一致，更优选有99％-99.5％相一致。
本发明还涉及一种具有10至50个核酸碱基的分离出的DNA序列，及一种相应于根据SEQ ID NO7、SEQ ID NO12、SEQ ID NO15或SEQ ID NO19或其互补链的DNA序列部分的序列。优选的为具有15-45个核酸碱基的核酸序列，尤其是具有20-40个核酸碱基的，更优选那些具有30-40个核酸碱基的。前述的核酸序列适合作为聚合酶链反应(PCR)的分子样本或引物。
本发明还涉及含有一或多种前述的核酸或DNA序列的克隆载体。本发明还涉及存在于细菌、酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞中的表达载体，其含有一或多种前述的核酸或DNA序列，且以合适方式连接一表达控制序列。
本发明还涉及一种为细菌、酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞的宿主细胞，且其已以上述任一种表达载体转化或转染过。
前述DNA序列或氨基酸序列的相似性是经由累计与个别蛋白质或DNA序列的部分序列相一致的氨基酸或核酸碱基数后，再除以氨基酸或核酸碱基的总数，并将结果乘以100来计算。
合适的克隆载体的实例有PPCR-Script、pCMV-Script、pBlueScript(Stratagene)、pDrive克隆载体(Quiagen)、pS Blue、pETBlue、pET LlC载体(Novagen)和TA-PCR克隆载体(Invitrogene)。
合适的表达载体的实例有pKK223-3，pTrc99a，pUC，pTZ，pSK，pBluescript，pGEM，pQE，pET，pHUB，pPLc，pKC30，pRM1/pRM9，pTrxFus，pAS1，pGEx，pMAL，pTrx)。
合适的表达控制序列的实例有trp-lac(tac)启动子、trp-lac(trc)启动子、lac启动子、T7启动子、λpL启动子。
路氏乳杆菌氧化还原酶为一种同二聚体，其在SDS凝胶中所测定出的分子量为30-35kDa，以凝胶过滤层析分析所测定出的分子量为60-65kDa。其最适温度在55℃至60℃的范围内，且其最适pH为从6.5至7.0。路氏乳杆菌氧化还原酶具有良好的温度和pH稳定性，且在4.5至8.5的pH范围和15℃至50℃的温度范围内可维持稳定至少5小时，还可在有机溶剂中显示出高稳定性。
尤其是，此酶可从乳杆菌属的微生物中分离出，并在分光光度测定分析中，于合适底物(如2-氧-4-苯基丁酸或2-含氧戊酸乙酯)的存在下，经由在340nm测量NADPH减少的情况来检测。
本发明是将路氏乳杆菌氧化还原酶克隆在大肠杆菌中，并在其中过表达，活性为10000单位/克至30000单位/克大肠杆菌湿重。因此，此酶并不昂贵，且可大量取得。在数据库中并未找到其相关序列，其仅可能与羟酰基-CoA脱氢酶群有非常远的关系。
本发明还涉及用来取得路氏乳杆菌氧化还原酶的方法。为了达到此目的，让编码路氏乳杆菌氧化还原酶的DNA在合适的原核或真核微生物中表达。优选的路氏乳杆菌氧化还原酶为在大肠杆菌株中转化并表达的，尤其是大肠杆菌BL21star(DE3)细胞(Invitrogen，目录编号C6010-03)，此种大肠杆菌细胞是从大肠杆菌BL21衍生出，其带有受lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因的染色体拷贝，无ompT和Lon蛋白酶，BL21 star在RNaseE(rne131)中带有突变。
路氏乳杆菌氧化还原酶可由如下述的方法取得培养重组的大肠杆菌细胞，诱导该氧化还原酶表达，接着，约10-18小时后，以超声波处理，或在球磨中以玻璃珠进行湿研磨(Retsch，10分钟，24Hz)来破裂该细胞。所取得的细胞提取物可直接使用或将其进一步纯化。为此，可例如将细胞提取物离心，再将所得上清液在丁基琼脂糖凝胶快速流动管柱(Butyl Sepharose Fast Flow)(pharmacia)上进行疏水性交互作用层析分析，再接着进行凝胶过滤(Superdex200 HR)来实现。
本发明还涉及一种用于以对映体选择方式取得S-2-羟基酸酯类的方法，其包含在氧化还原酶、NADPH和水的存在下，将2-含氧酸酯类还原成相应的S-2-羟基酸酯，再将所产生的S-2-羟基酸酯分离出来。
本发明方法所制得的手性S-2-羟基酸酯类的使用时间长，对映体异构纯度超过94％，且以所使用的2-含氧酸酯的量计算此方法具有高产量。
″NADPH″一词意指还原的烟酰胺腺嘌呤双核苷酸磷酸盐。″NADP″一词意指烟酰胺腺嘌呤双核苷酸磷酸盐。
″2-含氧酸酯类″一词意指，如式I的化合物R2-C(O)-C(O)-O-R1 (I)R1为1.-(C1-C20)-烷基，其中烷基为直链型或支链型，2.-(C2-C20)-烯基，其中烯基为直链型或支链型，并根据链长而含有一、二、三或四个双键，3.-(C2-C20)-炔基，其中炔基为直链型或支链型，且当合适时，含有一、二、三或四个三键，4.-(C6-C14)-芳基，5.-(C1-C8)-烷基-(C6-C14)-芳基，6.-(C5-C14)-杂环，其为未经取代，或被卤素、羟基、氨基或硝基取代一至三次，或7.-(C3-C7)-环烷基，R2为1.-(C1-C20)-烷基，其中烷基为直链型或支链型，2.-(C2-C20)-烯基，其中烯基为直链型或支链型，并根据链长而含有一、二、三或四个双键，3.-(C2-C20)-炔基，其中炔基为直链型或支链型，且当合适时，含有一、二、三或四个三键，
4.-(C6-C14)-芳基，5.-(C1-C8)-烷基-(C6-C14)-芳基，6.-(C5-C14)-杂环，其为未经取代，或被卤素、羟基、氨基或硝基取代一至三次，或7.-(C3-C7)-环烷基，其中如上述1至7所定义的基团为未经取代的，或彼此独立地被如下群体取代一至三次a)-OH，b)卤素，如氟、氯、溴或碘，c)-NO2，d)-C(O)-O-(C1-C20)-烷基，其中烷基为直链型或支链型，且为未经取代，或被卤素、羟基、氨基或硝基取代一至三次，或e)-(C5-C14)-杂环，其为未经取代，或被卤素、羟基、氨基或硝基取代一至三次。
″S-2-羟基酸酯类″一词意指式II的化合物R2-C(OH)-C(O)-O-R1(II)其中该-OH基相关于其所连接的碳原子而言为S构型，而R1和R2如式I中的定义。
芳基一词意指具6至14个环碳的芳族碳基团。-(C6-C14)-芳基的实例有苯基，萘基，如1-萘基、2-萘基，联苯基，如2-联苯基、3-联苯基和4-联苯基，蒽基或芴基。优选的芳基为联苯基、萘基，尤其是苯基。″卤素″一词是指氟、氯、溴和碘。″(C1-C20)-烷基″一词是指其碳链为直链型或支链型，且含有1至20个碳原子的烃基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基或癸基。
″-(C3-C7)-环烷基″一词是指环形烃基，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。
″(C5-C14)-杂环″一词为单环或二环的5员至14员杂环，其为部分或完全饱和。杂原子的实例有N、O和S。(C5-C14)-杂环一词的实例为从如下群体衍生的基团吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、四唑、1，2，3，5-噁噻二唑-2-氧化物、三唑酮、噁二唑酮、异噁唑酮、噁二唑啶二酮、三唑，其被如下群体所取代F、-CN、-CF3，或-C(O)-O-(C1-C4)-烷基、3-羟基吡咯-2，4-二酮、5-氧-1，2，4-噻二唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、吲哚、异吲哚、吲唑、2，3-二氮杂萘、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、喹啉、-咔啉，及所述杂环的苯并-、环戊-、环己-或环庚-稠合衍生物。优选2-或3-吡咯基，苯吡咯基，如4-或5-苯基-2-吡咯基、2-呋喃基、2-噻吩基、4-咪唑基、甲基咪唑基，例如1-甲基-2-、-4-或-5-咪唑基、1，3-噻唑2-基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-、3-或4-吡啶基-N-氧化物、2-吡嗪基、2-、4-或5-嘧啶基，2-、3-或5-吲哚基、经取代的2-吲哚基，例如1-甲基-、5-甲基-、5-甲氧基-、5-苄氧基-、5-氯-，或4，5-二甲基-2-吲哚基、1-苄基-2-或-3-吲哚基、4，5，6，7-四氢-2-吲哚基、环庚[b]-5-吡咯基、2-、3-或4-喹啉基，1-、3-或4-异喹啉基，1-氧-1，2-二氢-3-异喹啉基，2-喹喔啉基，2-苯并呋喃基、2-苯并噻吩基、2-苯并噁唑基或苯并噻唑基或二氢吡啶基、吡咯烷基，如2-或3-(N-甲基吡咯啶基)、哌嗪、吗啉基、硫吗啉基、四氢噻吩基或苯并二氧戊环烷基。
式I的优选化合物的实例有2-含氧戊酸乙酯、2-氧-4-苯基丁酸乙酯、丙酮酸乙酯、苯基乙醛酸乙酯、乙基2-含氧-3-苯基丙酸、8-氯-6-氧辛酸乙酯、2-含氧丁酸乙酯、2-含氧己酸乙酯、苯基乙醛酸甲酯、2-含氧戊酸甲酯、丙酮酸甲酯、2-氧-4-苯基丁酸甲酯、甲基2-含氧-3-苯基丙酸、8-氯-6-氧辛酸甲酯、2-含氧丁酸甲酯和2-含氧己酸甲酯。
对应产生的S-2-羟基酸酯类有，如S-2-羟基戊酸乙酯、S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯、L-乳酸乙酯或S-扁桃酸乙酯。
合适的氧化还原酶从如路氏乳杆菌衍生得来。在本发明的方法中可使用完全或部分纯化的氧化还原酶，或包含在细胞中的氧化还原酶。此部分所使用的细胞可为天然的、被渗透化的或裂解的形式。优选使用根据SEQ ID NO18的克隆的氧化还原酶。
所使用的氧化还原酶的体积活性是从250单位/毫升(U/ml)至20000单位/毫升，以约4000单位/毫升优选。每公斤欲转化的式I化合物是使用5000至250000U的氧化还原酶，优选使用约10000U至50000U。此部分中，酶单位1U相当于每分钟(min)将1微摩尔2-含氧-苯基丁酸乙酯转化成S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯所需的酶量。
本发明还涉及以对映体选择的方式取得S-2-羟基酸酯的方法，其包含a)在氧化还原酶、NADPH和水的存在下，将2-含氧酸酯还原成相对应的S-2-羟基酸酯，b)同时，以脱氢酶和共同底物将由该氧化还原酶所产生的NADP还原成NADPH，及c)将所产生的手性S-2-羟基酸酯分离出。
合适的脱氢酶的实例有来自布氏热厌氧菌(Thermoanaerobiumbrockii)、克非利乳杆菌和短乳杆菌的酶，这些酶类需要辅酶NADPH(DE 19 610 984，EP 0 456 107，WO 97/32012)。
所使用的醇脱氢酶的合适共同底物为醇类，如乙醇、2-丙醇(异丙醇)、2-丁醇、2-戊醇或2-辛醇。
亦可利用已知的酶重新产生NADPH(如葡萄糖脱氢酶或NADPH-依赖性的甲酸脱氢酶)来还原NADP(Tishkov et al.，J.Biotechnol.Bioeng. 64，187-193，Pilot-scale production andisolation of recombinant NAD and NADP specific formatedehydrogenase)。
当使用葡萄糖脱氢酶时，适合用于本发明方法中的共同底物为葡萄糖。合适的甲酸脱氢酶的共同底物的实例为甲酸的盐类，如甲酸铵，甲酸钠或甲酸钙。
优选的为使用小乳杆菌(Lactobacillus minor)醇脱氢酶(DE 10119274)。在本发明的方法中可使用完全或部分纯化的醇脱氢酶，或含该醇脱氢酶的全细胞。此部分所使用的细胞可为天然的、被渗透化的或裂解的形式。每公斤欲转化的式I化合物是使用10000U至200000U的醇脱氢酶，优选使用约25000U至100000U的醇脱氢酶。此部分中，酶单位1U相当于每分钟(min)转化1微摩尔共同底物(如2-丙醇)所需的酶量。
优选的为在水中加入pH5-10，优选为6-9的缓冲液，如磷酸钾缓冲液、Tris/HCl缓冲液或三乙醇胺缓冲液。缓冲液浓度是从10mM至150mM，以从90mM至110mM优选，尤其是100mM。另外，缓冲液亦可含有用于稳定或活化酶的离子，如用于稳定小乳杆菌醇脱氢酶的镁离子。
本发明方法中的温度为，如约10℃-60℃，优选30℃-55℃。
本发明还涉及以对映体选择的方式取得S-2-羟基酸酯的方法，其包含a)在氧化还原酶、NADPH和水的存在下，将2-含氧酸酯还原成相对应的S-2-羟基酸酯，b)同时，以脱氢酶和共同底物将由该氧化还原酶所产生的NADP还原成NADPH，c)在有机溶剂的存在下进行该反应，及d)将所产生的手性S-2-羟基酸酯分离出。
优选的有机溶剂的实例有二乙醚、叔丁基甲醚、二异丙醚、二丁醚、醋酸丁酯、庚烷、己烷和环己烷。
当使用额外的溶剂时，反应混合物含有水相及有机相。有机相由其中已溶有底物的合适溶剂形成，或由不溶于水的底物本身形成。在此部分中，有机相约为全部反应体积的5％至80％，优选10％至40％。
在本发明的二-相系统中含有第一种液相和有机溶剂，而水形成第二种液相。当合适时亦可额外存在由不完全溶解的氧化还原酶及/或醇脱氢酶，或由式I化合物所产生的固体，或另一种液相。然而，优选不含固相的二-液相。优选，将该二种液相以机械方式混合，以在二种液相之间产生大表面区域。
辅因子NADPH的浓度是从0.001mM至0.1mM，尤其是从0.005mM至0.02mM(以水相计)。
优选，本发明的方法中额外使用另一种醇脱氢酶的稳定剂。合适的稳定剂的实例有甘油、山梨糖醇或二甲亚砜(DMSO)。
在本发明方法中所使用的式I化合物的量以全部体积计是从10％至60％，优选15％至50％，尤其是从20％至40％。
用来将NADP再生为NADPH的共同底物(如异丙醇)的量以全部体积计是从5％至50％，优选10％至30％，尤其是从15％至25％。
本发明的方法是在如玻璃或金属制的密闭反应瓶中进行。为了实现此目的，将成分分别转移至该反应瓶中，并将其在如氮气或空气下搅拌。根据所使用的底物和式I化合物，反应时间为从1小时至48小时，尤其是从2小时至24小时。
接着，形成反应混合物。为了实现此目的，去除水相，并将有机相过滤。当合适时，可再萃取水相一次，并如有机相一样进一步处理。当合适时，再将溶剂从透明有机相蒸发。如此可产生如产物S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，其对映异构体纯度超过94％，且基本上不含反应物2-氧-4-苯基丁酸乙酯。将产物蒸馏后，此方法的总产量以所使用的反应物量计为50％至95％。
实施例本发明将以下列实施例说明实施例1在乳杆菌属中筛选用于还原2-含氧酸酯类的氧化还原酶将不同乳杆菌属的菌株培养于下列培养基中，以进行筛选(在各情况中的数量是以克/升计)葡萄糖(20)、酵母提取物(5)、肉类提取物(10)、柠檬酸氢二铵(2)、醋酸钠(5)、硫酸镁(0.2)、硫酸锰(0.05)、磷酸氢二钾(2)。将培养基在121℃灭菌，并用来培养乳杆菌属(以下缩写为L.)，不需进一步调节pH或补充氧气。
然后，将12.5毫克细胞重新悬浮在800微升的破裂缓冲液(100mM三乙醇胺(TEA)，pH7.0)中，将其与1克玻璃珠混合，并将其在球磨(Retsch)中于4℃裂解10分钟。在每分钟12000转速(rpm)下离心2分钟，然后，取出上清液以活性筛选及测量对映异构体的过量。所使用的底物为2-含氧戊酸乙酯及2-氧-4-苯基丁酸乙酯。
活性筛选混合物860微升 0.1M KH2PO4/K2PO4pH＝7.0 1mM MgCl220微升 NADPH/NADH(10mM)20微升 裂解液100微升 底物(100mM)在340nm监测反应物1分钟。
ee测定混合物20微升裂解液100微升NADH/NADPH(50mM)60微升底物(2-氧-4-苯基丁酸乙酯100mM)24小时(h)后，以氯仿萃取用于测定ee的反应混合物，并以GC分析对映异构体的过量。
对映异构体的过量依下式计算ee(％)＝((R-醇-S-醇)/(R-醇+S-醇))×100。
表1

DSMZ代表Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen，Mascheroder Weg 1b，38124 Braunschweig，德国。
表1透露出多种乳杆菌属的菌种具有NADPH-依赖性氧化还原酶，其以2-氧-4-苯基丁酸乙酯或2-含氧戊酸乙酯作为底物。
酶单位的定义1单位(1U)相当于每分钟转化1微摩尔底物所需的酶量。
实施例2从路氏乳杆菌中分离NADPH-依赖性的氧化还原酶依实施例1中的描述来培养有机体，以从路氏乳杆菌中分离出NADPH-依赖性氧化还原酶。达到平台期后，收获细胞，并以离心将细胞与培养基分开。使用玻璃珠，经由湿研磨来释出酶，但此亦可以其它裂解方法来实现。为了实现此目的，将20克路氏乳杆菌悬浮在80毫升裂解缓冲液(100mM三乙醇胺，1 mM MgCl2pH＝7.0)中，加入80毫升玻璃球后，以球磨来裂解细胞(10分钟，24Hz)。
然后，由加入242毫克(NH4)2SO4，并在4℃搅拌1小时来将离心后取得的粗提取物的调整为硫酸铵最终浓度50％。然后，经由在12000rpm离心10分钟来移除沉淀，并将所得上清液以FPLC进一步纯化。将酶经由在丁基琼脂糖凝胶快速流动管柱上进行的疏水性交互作用层析分析，和接下去的凝胶过滤作用(Superdex200 HR)来纯化。为了达到此目的，将经硫酸铵沉淀所得的上清液直接铺放至以100mMTEA pH＝7.0和1M(NH4)2SO4平衡过的丁基琼脂糖凝胶快速流动管柱上，并以下降的线性盐梯度进行洗脱。酶是在0M的(NH4)2SO4洗脱出。将活性级分合并，并将其由超滤(截断值10kDa)处理来减至合适的体积。在根据实施例1的分析系统(活性筛选混合物)中测定氧化还原酶的酶活性，并根据Lowry et al.，Journal of Biological Chemistry，193(1951)265-275或Peterson et al.，Analytical Biochemistry，100(1979)201-220来测定蛋白质的量。特异活性为酶的活性除以蛋白质的量，1单位(U)相当于每分钟转化1微摩尔的所需量。
然后，将粗酶制品以凝胶过滤作用(TEA 100mM pH＝7.0，0.15MNaCl和1mM MgCl2)进一步纯化，并同时测定该天然酶的分子量。所使用的分子量标准为过氧化氢酶(232kDa)、丁醛醇酶(158kDa)、白蛋白(69.8kDa)和卵清蛋自(49.4kDa)。
纯化作用表表2

以凝胶过滤作用测定出的天然状态蛋白质的分子量为60±5kDa。
实施例3测定N-端序列及测定在凝胶中分解后的内肽在凝胶过滤后，将酶制品在10％强度的十二烷基硫酸钠(SDS)凝胶中进行化学分离，并将其转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上。
将在约30至35kDa的主带以艾德曼(Edman)降解作用(Procise492(PE生物系统))进行N-端序列分析。可取得下列N-端序列SEQ ID 1MKNIMIAGAGVLGSQ以二硫代苏糖醇将相同蛋白质的SDS-PAGE带还原，以内蛋白酶Lys-C羧甲基化和消化。以300微米×150毫米毛细HPLC管柱(VydacRP18，LC Packings)将所得肽分开。以手工收集25份级分，并以用于适合序列分析的肽类的MALDI MS(Voyager-DE STR(PE生物系统))进行测序。以自动化艾德曼降解作用分析MH+＝1491.8的级分12，可得到下列序列SEQ ID 2
SDYERDLHLTDK实施例4酶的克隆4.1由PGR(聚合酶链反应)的辅助克隆特定的路氏乳杆菌基因片段根据Maniatis&Sambrook在″分子克隆″中所描述的方法从路氏乳杆菌萃取染色体DNA。以所产生的基因组DNA作为利用简并的引物的直接聚合酶链反应(PCR)中的模板。考虑通用基因密码(Seq No3、4、5和6)，从N-端氨基酸序列(Seq No1)衍生出该简并的5′引物，从内肽的氨基酸序列(Seq No2)衍生出3′引物。引物结构列于下面N＝A、T、C或G；Y＝T或C；R＝A或G此引物以已知方法制备。
5′-寡3ATGAARAAYATYATGATYGCHGGCGC5′-寡4ATGAARAAYATYATGATYGCHGGTGC3′-寡5RTGHARATCMCGTTCRTAATC3′-寡6RTGHARATCMCGTTCRTAGTC扩增在PCR缓冲液[10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2.5mMMgCl2、1mM去氧核苷三磷酸盐混合物(dNTP)混合物，30皮摩尔的各引物，和2.5单位的AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)]中进行。将AmpliTaq Gold聚合酶活化(10分钟，94℃)后，接着进行35个PCR循环(94℃，60秒；53℃，45秒；72℃，60秒)，然后，将反应物冷却至4℃，并将全部PCR混合物在1％琼脂糖凝胶上进行分析。
4.2 PCR扩增产物的亚克隆在凝胶纯化(Qiaex琼脂糖萃取试剂盒)后，将路氏乳杆菌(S)-ADH基因的特定片段在200bp鉴定出，连接入TA-克隆载体pCR2.1(Invitrogen)，德国Karlsrule)中。将2微升连接混合物转化入大肠杆菌top 10F′细胞中，再将所产生的菌落的DNA进行筛选，以确认其中是否含有整合了200bp PCR片段的pCR2.1质粒存在。为了达到此目的，以Eco RI核酸内切酶进行限制分析。接着，利用下列引物，以ABI DNA序列分析仪的协助来分析阳性菌落的序列M13 rev5′CAGGAAACAGCTATGACC 3′和M13 uni5′TGTAAAACGACGGCCAGT 3′。
159bp基因片段(Seq No7)的序列分析揭露具53个氨基酸的开放阅读框，其亦包括N端和内肽二者的序列片段。
4.3编码路氏乳杆菌(S)-ADH的全长基因节段的克隆以实施例4.2的159bp基因片段的核苷酸序列为基础来构造特异引物对(Seq No8、9、10和11)用于逆向(inverse)聚合酶链反应(iPCR)及随后的嵌套式(nesting)PCR。引物8和9与所发现的基因片段的3′端互补，而引物10和11与接近5′端的区域互补。
寡8ATCCGGCTTTAATGTCAGCGT寡9CGACGGATTAAGGCGCTGAAAAG寡10CTACCTAATACGCCAGCACCAG寡11GCCAGCACCAGCAATCAT以Eco RI核酸内切酶消化来自路氏乳杆菌细胞的染色体DNA，并以T4连接酶再连接。将所产生的环形染色体DNA片段作为iPCR的模板。在PCR缓冲液(见实施例2)，1mM MgCl2中进行下列聚合酶链反应的扩增循环，在各情况的缓冲液中含有30皮摩尔的引物8和10，25毫微克作为模板的再连接产物，及2.5单位的AmpliTaq GoldDNA聚合酶(Applied Biosystem)
循环1 94℃，10分钟循环2×30 94℃，1分钟57℃，45秒72℃，1分钟循环3 72℃，7分钟4℃，然后，以嵌套式PCR将PCR信号放大。在此反应中，最适MgCl2的浓度为2mM，以2微升第一批iPCR作为模板。梯度PCR决定出57℃为引物对9和11的最适温度。以AmpliTaq Gold DNA聚合酶进行下列扩增循环，以检测长度为1200bp的特定PCR产物循环1 95℃，10分钟循环2×40 95℃，45秒57℃，1分钟72℃，90秒循环3 72℃，7分钟4℃，∞将长度为1200bp的特定带以Qiaex凝胶提取试剂盒(Qiagen，德国希尔登)，经由1％琼脂糖凝胶纯化，并将其用于使用TA-PCR克隆载体pCR2.1的连接反应中。
将2微升连接混合物转化入大肠杆菌top 10F′细胞中后，对所产生的具氨苄青霉素抗性的菌落的质粒DNA进行筛选，以确认其中是否含有整合了1200bp PCR片段的pCR2.1质粒。为了达到此目的，以Eco RI核酸内切酶进行限制分析。接着，依4.2中的描述，利用引物M13 rev和M13 uni来分析阳性菌落的序列。
1241bpDNA片段(Seq No12)的序列分析揭露在5′端区域中具有148个氨基酸的开放阅读框。前15个N端氨基酸的序列相当于4.2的C-端氨基酸序列Seq No7。分析该1241bpDNA片段的C-端序列揭露出在路氏乳杆菌(S)-ADH基因的N端的闭合的调节性DNA节段。
以1241bpDNA片段的序列(其N-端区(447bp)代表路氏乳杆菌氧化还原酶基因的另一部分)为基础来构造特异引物(Seq No13和14)对用于另一逆向聚合酶链反应(iPCR)及随后嵌套式PCR。引物13和14与所发现的基因片段的3′延伸部分互补。
寡13CCAGAGGTGATTGAAGAAGCTAC寡14CCGGGAAATAAAGATGGTT以Af1 III核酸内切酶消化来自路氏乳杆菌细胞的染色体DNA，并以T4连接酶再连接。将所产生的环形染色体DNA片段作为iPCR的模板。在PCR缓冲液(见实施例4.1)，1mM MgCl2中进行下列聚合酶链反应的扩增循环，在各情况的缓冲液中含有30皮摩尔的引物7a/9a，25毫微克作为模板的再连接产物，及2.5单位的AmpliTaq GoldDNA聚合酶循环1 94℃，10分钟循环2×30 95℃，1分钟56℃，45秒72℃，1:45分钟循环3 72℃，7分钟4℃，∞然后，以嵌套式PCR将PCR信号放大。在此反应中，最适MgCl2的浓度为2mM，使用2微升的第一批iPCR作为该嵌套式PCR的模板。以AmpliTaq Gold DNA聚合酶进行下列扩增循环，以检测长度为950bp的特定PCR产物循环1 94℃，10分钟循环2×30 94℃，45秒56℃，1分钟72℃，1:45分钟循环3 72℃，7分钟4℃，∞
将长度为950bp的特定带以Qiaex凝胶萃取试剂盒，经由1％琼脂糖凝胶纯化，并将其用于使用TA-PCR克隆载体pCR2.1的连接反应中。
将2微升连接混合物转化入大肠杆菌top 10F′细胞中后，对所产生的具氨苄青霉素抗性菌落的质粒DNA进行筛选，以确认其中是否含有整合了950bp PCR片段的pCR2.1质粒。为了达到此目的，以Eco RI核酸内切酶进行限制分析。接着，依4.2中的描述，利用引物M13 rev和M13 uni来分析阳性菌落的序列。
插入pCR2.1载体的DNA片段的长度为822bp，其在N′端具有一包含126个氨基酸的开放阅读框，并终止于一终止密码和终端环(SeqNo15)。具12个氨基酸的5′肽相当于序列12的C-端。因此，由iPCR产生的822bpDNA片段包含编码路氏乳杆菌氧化还原酶的基因节段的C端。
4.4以PCR合成路氏乳杆菌氧化还原酶的全长基因以序列7和序列15为基础来构造用于接下去将全长基因克隆入合适的表达系统中的特异引物。以Nde I辨识序列修饰5′引物，以HindIII辨识序列修饰3′端引物(Seq No16；Seq No17)。
寡16GCGGAATTCCATATGAAGAATATCATGATTGCT寡17CCCAAGCTTAATGCTTCAGAAAATCTGG以路氏乳杆菌细胞的基因组DNA作为聚合酶链反应的模板。扩增是在PCR缓冲液[10mM Tris-HCl(pH8.0)；50mM KCl；10mM MgSO4；1mMdNTP混合物；30皮摩尔的各引物，和2.5单位的铂Pfx DNA(Platinum Pfx DNA)聚合酶(Invitrogen)]中，以300毫微克模板和下列温度循环进行扩增循环1 94℃，2分钟循环2×30 94℃，15秒
58℃，30秒68℃，75秒循环368℃，7分钟4℃，∞然后，经由1％琼脂糖凝胶纯化后，以Nde I和HindIII消化所产生的PCR产物，并以相同的核酸内切酶处理，将其连接入pET21a载体(Novogen)，Madison，美国)骨架中。将2微升连接混合物转化入大肠杆菌top 10F′细胞中后，以核酸内切酶Nde I和HindIII进行限制分析来检查具氨苄青霉素抗性菌落的质粒DNA是否正确连接。将表达构建体pET21-reut#10进行序列分析。路氏乳杆菌氧化还原酶基因具有共882bp(Seq No19)的开放阅读框，相当于含294个氨基酸的蛋白质(Seq No18)。
4.5在大肠杆菌中生产重组的(S)-ADH以含氧化还原酶基因的pET21-reut#10表达构建体转化感受态大肠杆菌StarBL21(De3)细胞。将菌株培养在含氨苄青霉素(50微克/毫升)的LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)中，直到在500nm处测得光学密度达到0.5。经由加入最终浓度1mM的异丙基-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导氧化还原酶的表达。在25℃和220rpm诱导8小时后，收获细胞，并将其冷冻在-20℃下。
在下列鉴定生化特性的实验中，将100毫克细胞与600微升裂解缓冲液和600微升玻璃珠混合在一起，并以球磨将其裂解10分钟。然后，将所得的细胞裂解液以稀释形式用于相应的测量中。该细胞裂解液对2-氧-4-苯基丁酸乙酯的活性为2000U-4000U/毫升。
因此，此酶所表达的活性为10000U/克至30000U/克大肠杆菌湿重。所以，此酶不贵且可大量取得。
实施例5重组的路氏乳杆菌氧化还原酶的特性鉴定5.1最适pH
制备下列测量缓冲液，其均为50mM，含有1mM MgCl2，并具有不同的pH值。
表3

依需要来稀释酶(1∶20)测量混合物(30℃)870微升 具不同pH的测量缓冲液20微升NADPH 10mM(8.6毫克/毫升水)10微升酶，稀释的2-3分钟 温育+100微升 底物溶液(100 mM 2-氧-4-苯基丁酸乙酯)经由测定在表3中所列的特定缓冲液中的酶反应来决定最适pH。对本发明的酶所测定出的最适pH介于6.5和7之间。此酶在pH4.5至8之间具有的活性为其最大活性的80％，而该活性在pH值低于4.0和高于8.5时会快速下降。
5.2 pH稳定性研究在pH4至11的范围内，酶活性对储存在不同pH值的缓冲液中的依赖性。为了实现此目的，制备在pH4至11的范围内的不同缓冲液(50mM)，然后，将在实施例4中过表达的酶在其中稀释200倍，并温育30、60和300分钟。所有缓冲液中含有1mM MgCl2。然后，从其中取出10微升用于平常的活性分析中。此处的起始值为将酶在磷酸钾缓冲液(50mM pH＝7.0)中稀释后立即取得的测量值。在预先限定的条件下，该值相当于0.70/分钟的消光变化，并设为100％，而所有接下去的测量值为此数的相关值。
我们发现重组的路氏乳杆菌氧化还原酶在pH4.5至8的范围内可维持稳定，并可温育至少5小时而不损失活性.5小时后，在pH4.0和9.0各发现50％和40％的剩余活性.pH值9.5以上会使酶立即失活。
5.3最适温度最适分析温度是经由在15℃至70℃的温度范围内，测量在标准测量混合物中的酶活性来决定。如表5中指出，最大的酶活性是在55℃，的后便快速下降。
表4

5.4温度稳定性以类似于5.2中所描述的方式来测定在15℃至70℃的范围内的温度稳定性。为了实现此目的，在各情况中，将稀释200倍的纯化的酶在特殊温度下培育60和180分钟，然后利用上述分析混合物在30℃测量。此处所使用的起始值亦为将酶在磷酸钾缓冲液(50mM pH＝7.0)中稀释后立即取得的测量值，此值亦设为100％。在15℃至50℃的温度范围内，酶的活性完全稳定，且直到培育3小时后仍显示出无活性损失。在55℃下，30分钟后便无法检测到酶的活性。
5.5底物谱/对映异构体的过量以一些酮类、含氧酸类及其酯类测量酶的活性来决定本发明的氧化还原酶的底物谱。为了实现此目的，使用具不同底物的标准测量混合物(实施例5.1)。以2-氧-4-苯基丁酸乙酯测得的活性设为100％，且所有其它底物与此数为相关值。此酶显示出对(R)-或(S)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，(R)-或(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，和(D)-或(L)-乳酸乙酯无NADP-依赖性的脱氢酶活性。
ee值经由制备下列反应混合物对选出的底物的来决定。
100微升 NADPH (50mM)60微升底物(100mM)和1至2单位的氧化还原酶24小时后，以氯仿萃取用于ee测定的反应混合物，并以GC来分析所产生的醇的对映异构体的过量。
表5

如表5中指出，重组的路氏乳杆菌氧化还原酶可以立体选择方式还原，尤其是2-含氧酸酯类成相应的2-羟基酸酯类。相应的2-含氧酸类无法作为底物，甲基酮类亦很难被还原，3-含氧酸酯类可被部分还原，但几乎不以立体选择方式还原。
5.6溶剂稳定性酶与有机溶剂接触时的稳定性经由以指定的溶剂混合物将路氏乳杆菌氧化还原酶稀释400倍(对于可与水相溶的有机溶剂)，并在室温中温育来研究。接着，在标准分析混合物中使用10微升酶溶液。此处亦将在缓冲液(磷酸钾缓冲液100mM pH＝7.0，1mM MgCl2)中稀释后立即取得的测量值设为100％，而所有其它值为此数的相关值。对于不能与水相溶混的有机溶剂，亦同样在磷酸钾缓冲液中进行稀释，将相同体积的有机溶剂加入混合物中，并将混合物在室温下，于一热混合器中，rpm＝170下温育。从水相测量活性。
表6

如表6中所指出，路氏乳杆菌氧化还原酶在有机溶剂中非常稳定。而且，与在纯缓冲液中温育相比较，此酶即使在可与水相溶混或与水不相溶混的有机溶剂中亦可维持稳定。
5.7测定NADPH和2-含氧戊酸乙酯的Km和Vmax选择下列反应混合物来测定NADPH和2-含氧戊酸乙酯的Km和VmaxA.变化的NADPH/固定底物浓度970微升 在磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)中的2-含氧戊酸乙酯溶液20微升 NADPH(最终浓度200-5μm)10微升 酶溶液(1∶300)B.变化的底物浓度/固定的NADPH970微升 在磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)中的2-含氧戊酸乙酯溶液(浓度从10至0.1mM)20微升 NADPH(最终浓度0.2mM)10微升 酶溶液(1∶300)

所使用的酶溶液为从0.1克的重组大肠杆菌细胞取得的经1∶300稀释的细胞裂解液(600微升)。
5.8 2-氧-4-苯基丁酸乙酯的制备性转化方法A.以来自布氏热厌氧菌的仲醇脱氢酶来重新产生辅酶在制备方法方面，将由下列各项组成的混合物在室温温育，并持续混合24小时4毫升的磷酸钾缓冲液(100mM，pH＝7.0)、2毫升的异丙醇、4毫升的2-氧-4-苯基丁酸乙酯、0.064毫克的NADP、1000单位的路氏乳杆菌氧化还原酶和10毫克的布氏热厌氧菌ADH(福禄卡(Fluka)，约100单位，以2-丙醇的氧化为根据)。24小时后，底物2-氧-4-苯基丁酸乙酯已完全转化成2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。97％的产品为相应的S-醇。
B.以仲醇脱氢酶(KRED 1004，Biocatalytics，Pasadena)来重新产生辅酶在制备方法方面，将由下列各项组成的混合物在室温温育，并持续混合2小时4毫升的磷酸钾缓冲液(100mM，pH＝7.0)、2毫升的异丙醇、4毫升的2-氧-4-苯基丁酸乙酯、0.064毫克的NADP、1000单位的路氏乳杆菌氧化还原酶和1毫克的KRED 1004。2小时后，底物2-氧-4-苯基丁酸乙酯已完全转化成2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。98％的产品为相应的S-醇。
序列表<110>氧化还原酶 GmbH<120>Oxidoreductase from Lactobacillus reuteri<130>(TH)4061<160>19<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>15<212>PRT<213>路氏乳杆菌 <400>1Met Lys Asn Ile Met Ile Ala Gly Ala Gly Val Leu Gly Ser Gln1 5 10 15<210>2<211>12<212>PRT<213>路氏乳杆菌<220>
<221>肽<222>(1)..(12)<223>
<400>2Ser Asp Tyr Glu Arg Asp Leu His Leu Thr Asp Lys1 5 10<210>3<211>26<212>DNA<213>人工的<400>3atgaaraaya tyatgatygc hggcgc 26<210>4<211>26<212>DNA<213>人工的<400>4atgaaraaya tyatgatygc hggtgc 26
<210>5<211>21<212>DNA<213>人工的<400>5rtgharatcm cgttcrtaat c 21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工的<400>6rtgharatcm cgttcrtagt c 21<210>7<211>159<212>DNA<213>路氏乳杆菌<400>7atgaagaata tcatgattgc tggtgctggc gtattaggta gtcagattgc atatcaaacg60gctttatccg gctttaatgt cagcgtatat aatcaccata ttgataccgc tgagcgacgg120attaaggcgc tgaaaagtga ttaccgaacgt gatttacat 159<210>8<211>21<212>DNA<213>人工的<400>8atccggcttt aatgtcagcg t 21<210>9<211>23<212>DNA<213>人工的<400>9cgacggattaaggcgctgaa aag 23<210>10<211>22<212>DNA<213>人工的
<400>10ctacctaata cgccagcacc ag22<210>11<211>18<212>DNA<213>人工的<400>11gccagcacca gcaatcat 18<210>12<211>1257<212>DNA<213>路氏乳杆菌<400>12cgacggatta aggcgctgaa aagtgattat gaacgtgact tgcatttgac tgataaggaa60tttcaacagg gccttaataa tattaaagtg attactgatg atgttgcgac cgcggttaaa120gatgctgatt taatgattga agcattacca gaatcgttag agttaaagga gcagttttac180gaagaggttt cagaattagc ccctgaaaaa acaatctttg ctagcaactc ctctacattt240atccctagcc aactagctcc ttatactgat cggccagaaa aatttcttaa tatgcacttt300gctaaccaaa tttggaaatt taatgtggtc gaaattatgg gcacctccca aacaagtcca360gaggtgattg aagaagctac aaagtttgcc cgggaaataa agatggttcc tgttatcctt420aataaagaac aacacggtta tattctgaat tcatggtgaa tcaggaatgc ctggttatga480ctttggtgac gattatggta agcctcttga taagactgct gttgaagcac ttcatgacgc540aatcatggct gaagatgaag tcatcttggt tccaactggt tcatacacta acattgcatt600actctttagc gaatacccag aagtaaagag tcacattaag caaatcgttg cgatgggtgg660ttcattctct ggcggtaaca tgaccagtgt agctgaattt aacgtcttca ctgatccgga720tgctgctaag attatgtaca atgcgggtgt tccaattgta actgttggat tggatgttac780cttaaaggcg ctcttaactg cggatacgat tgaaaaactt ggtagtctta ataagactgg840tgaaatgcta catggattaa tcacgcacta taatgatggt agtgatcaag ggcgtccaat900gcacgatgtt aatactatct tctaccttct tcatccagaa gcatttacta cgaaggacat960
gtgggttgat gttcaaacag acggtccagc aatcggtgct actgttggtg acattcgcgc1020tgcttaccat gatggcaaga ccaacgcaaa agtttgttta gatattgatg ctgaatactt1080caataagtgg ttcttagaag aagtaagcaa aatgaaataa gatactaaga gctgagagtt1140tgctttcggc tctttttatt actttctagt gtaagcgctt cacgatataa tagtaatagt1200taaagtaagg aggaaatacc aaatgaagaa tataatgatt gctggtgctg gcaagcc 1257<210>13<211>23<212>DNA<213>人工的<400>13ccagaggtga ttgaagaagc tac23<210>14<211>19<212>DNA<213>人工的<400>14ccgggaaata aagatggtt 19<210>15<211>822<212>DNA<213>路氏乳杆菌<400>15ccgggaaata aagatggttc ctgttatcct taataaagaa caacacggtt atattctgaa60ttcccttttg attccgttac ttgcatctgg tcttagttta tgggctaaag gagttgctga120tccagcgatg attgataagg attggatgat ttcgacaggt gcaccaatgg gaccatttgg180tattttagat atggttggtt tacggacagc agcgcaaatc gaacggaatg cctatgccca240gactaaggat gaaagtcata aggaaattgc cgataagatg gaacagatga ttcaagaagg300gcacgaagga aaagaatcgg gacaaggatt ttataattat ccgaatccag ccttcattga360tccagatttt ctgaagcatt aagattaagt attgaaaacg ttaggaaagg gagcaagata420agagtcgctc gtgactgtta tctcactccc ttattttgcg ctccaatttt cacgtaatcc480
ggttgcaaca atggcaaaat tacggtacag tagtagagaa cgtgaaacaa aaaatgtttc540acgaaaggag acctaataaa tgaatcctga acaatttcaa caagcattag ctgatcatgg600tattacctta tcagcagaac aaatgcaaca atttgctgac tattaccaat tattagttga660aactaatgaa catggtgggt tgatgttcaa cagacggtcc agcatcggtg ctactgtggt720gacattcgcg ctgcttacat gatggcagac caacgcaaag tttgttagat atgatgctga780atacttcaat aagtggttct taaagaagta gcaaatgaat ag 822<210>16<211>33<212>DNA<213>人工的<400>16gcggaattcc atatgaagaa tatcatgatt gct 33<210>17<211>28<212>DNA<213>人工的<400>17cccaagctta atgcttcaga aaatctgg 28<210>18<211>294<212>PRT<213>路氏乳杆菌<400>18Met Lys Asn Ile Met Ile Ala Gly Ala Gly Val Leu Gly Ser Gln Ile1 5 10 15Ala Tyr Gln Thr Ala Leu Ser Gly Phe Asn Val Ser Val Tyr Asn His20 25 30His Ile Asp Thr Ala Glu Arg Arg Ile Lys Ala Leu Lys Ser Asp Tyr35 40 45
Glu Arg Asp Leu His Leu Thr Asp Lys Glu Phe Gln Gln Gly Leu Asn50 55 60Asn Ile Lys Val Ile Thr Asp Asp Val Ala Thr Ala Val Lys Asp Ala65 70 75 80Asp Leu Met Ile Glu Ala Leu Pro Glu Ser Leu Glu Leu Lys Glu Gln85 90 95Phe Tyr Glu Glu Val Ser Glu Leu Ala Pro Glu Lys Thr Ile Phe Ala100 105 110Ser Asn Ser Ser Thr Phe Ile Pro Ser Gln Leu Ala Pro Tyr Thr Asp115 120 125Arg Pro Glu Lys Phe Leu Asn Met His Phe Ala Asn Gln Ile Trp Lys130 135 140Phe Asn Val Val Glu Ile Met Gly Thr Ser Gln Thr Ser Pro Glu Val145 150 155 160Ile Glu Glu Ala Thr Lys Phe Ala Arg Glu Ile Lys Met Val Pro Val165 170 175Ile Leu Asn Lys Glu Gln His Gly Tyr Ile Leu Asn Ser Leu Leu Ile180 185 190Pro Leu Leu Ala Ser Gly Leu Ser Leu Trp Ala Lys Gly Val Ala Asp195 200 205Pro Ala Met Ile Asp Lys Asp Trp Met Ile Ser Thr Gly Ala Pro Met210 215 220Gly Pro Phe Gly Ile Leu Asp Met Val Gly Leu Arg Thr Ala Ala Gln225 230 235 240
Ile Glu Arg Asn Ala Tyr Ala Gln Thr Lys Asp Glu Ser His Lys Glu245 250 255Ile Ala Asp Lys Met Glu Gln Met Ile Gln Glu Gly His Glu Gly Lys260 265 270Glu Ser Gly Gln Gly Phe Tyr Asn Tyr Pro Asn Pro Ala Phe Met Asp275 280 286Pro Asp Phe Leu Lys His290<210>19<211>885<212>DNA<213>路氏乳杆菌<400>19atgaagaata tcatgattgc tggtgctggc gtattaggta gtcagattgc atatcaaacg60gctttatccg gctttaatgt cagcgtatat aatcaccata ttgataccgc tgagcgacgg120attaaggcgc tgaaaagtga ttatgaacgt gacttgcatt tgactgataa ggaatttcaa180cagggcctta ataatattaa agtgattact gatgatgttg cgaccgcggt taaagatgct240gatttaatga ttgaagcatt accagaatcg ttagagttaa aggagcagtt ttacgaagag300gtttcagaat tagcccctga aaaaacaatc tttgctagca actcctctac atttatccct360agccaactag ctccttatac tgatcggcca gaaaaatttc ttaatatgca ctttgctaac420caaatttgga aatttaatgt ggtcgaaatt atgggcacct cccaaacaag tccagaggtg480attgaagaag ctacaaagtt tgcccgggaa ataaagatgg ttcctgttat ccttaataaa540gaacaacacg gttatattct gaattccctt ttgattccgt tacttgcatc tggtcttagt600ttatgggcta aaggagttgc tgatccagcg atgattgata aggattggat gatttcgaca660ggtgcaccaa tgggaccatt tggtatttta gatatggttg gtttacggac agcagcgcaa720atcgaacgga atgcctatgc ccagactaag gatgaaagtc ataaggaaat tgccgataag780atggaacaga tgattcaaga agggcacgaa ggaaaagaat cgggacaagg attttataat840
tatccgaatc cagccttcat ggatccagat tttctgaagc attaa 88权利要求
1.一种氧化还原酶，其在NADPH和水的存在下，将2-含氧酸酯类还原成相应的S-2-羟基酸酯类。
2.权利要求1的氧化还原酶，其可自路氏乳杆菌、克非利乳杆菌、坎得利乳杆菌、类布氏乳杆菌、纤维二糖乳杆菌或发酵乳杆菌取得。
3.权利要求1或2的氧化还原酶，其具有SEQ ID NO18的氨基酸序列。
4.权利要求1-3中一或多项的氧化还原酶，其中该氧化还原酶中超过70％的氨基酸是与氨基酸序列SEQ ID NO18相同，且根据2-氧-4-苯基丁酸乙酯转化成S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的反应，该氧化还原酶具有超过1微摩尔/毫克的特异活性。
5.权利要求4的氧化还原酶，其中80％至99.5％，特别是90％至99.5％，特别优选99％至99.5％的氨基酸与SEQ ID NO18的氨基酸序列相同。
6.权利要求1-5中一或多项的氧化还原酶，其比具有氨基酸序列SEQ ID NO18的氧化还原酶多或少1至50个氨基酸，并且根据2-氧-4-苯基丁酸乙酯转化成S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的反应，该酶具有超过1微摩尔/毫克的特异活性。
7.权利要求4的氧化还原酶，其比SEQ ID NO18的氨基酸序列中的氨基酸多或少1至25个氨基酸，特别是2至20个氨基酸的，优选3至10个氨基酸。
8.权利要求1-6中一或多项的氧化还原酶，其具有SEQ ID NO18的氨基酸序列，并已经由水溶性聚合物修饰一次、二次、三次、四次或五次，且根据2-氧-4-苯基丁酸乙酯转化成S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的反应，其具有超过1微摩尔/毫克的特异活性。
9.权利要求8的氧化还原酶，其中该水溶性聚合物为聚乙二醇。
10.一种氧化还原酶片段，其代表氨基酸序列SEQ ID NO18的片段，该片段具有5至30个氨基酸。
11.权利要求10的片段，其为具有6至25个氨基酸，尤其是具有8-20个氨基酸的，优选具有10至18个氨基酸的氨基酸链的SEQ IDNO18的片段，其特别为氨基酸序列SEQ ID NO1或SEQ ID NO2。
12.一种融合蛋白质，其代表具有氨基酸序列SEQ ID NO18的氧化还原酶或其具有5-30个氨基酸的片段，且该氧化还原酶或其片段在其N-端或羧基端经由肽键结合至另一多肽。
13.一种抗体，其特异性结合至根据SEQ ID NO18的氧化还原酶，或其根据SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的片段。
14.一种分离的核酸序列，其编码SEQ ID NO18、SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氧化还原酶。
15.一种分离的氧化还原酶的DNA序列，该氧化还原酶如权利要求1至9及12中任一项所述，在NADPH和水的存在下催化2-含氧酸酯类还原成相应的S-2-羟基酸酯类，其中该DNA序列选自a)具有SEQ ID NO7、SEQ ID NO12、SEQ ID NO15或SEQ ID NO19或其各自互补链的核苷酸序列的DNA序列，b)与一或多个a)的DNA序列或其互补链杂交的DNA序列，该杂交反应在严紧条件下进行，和c)由于遗传密码子的简并性，编码也由一或多个a)或b)的DNA序列所编码的蛋白质的DNA序列。
16.一种分离的DNA序列，其中超过70％的核酸碱基与SEQ IDNO7、SEQ ID NO12、SEQ ID NO15或SEQ ID NO19或其互补链的DNA序列相同，且其编码根据2-氧-4-苯基丁酸乙酯转化成S-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的反应具有超过1微摩尔/毫克的特异活性的蛋白质。
17.权利要求16的分离的DNA序列，其中80％至99.5％，特别是90％至99.5％，优选99％至99.5％的核酸碱基与根据SEQ ID NO7、SEQ ID NO12、SEQ ID NO15或SEQ ID NO19的DNA序列相同。
18.一种分离的DNA序列，其代表具有10至50个核酸碱基及具有对应于根据SEQ ID NO7、SEQ ID NO12、SEQ ID NO15或SEQ ID NO19或其互补链的部分DNA序列的序列。
19.权利要求18的分离的DNA序列，其为具有15-45个，特别是20至40个，特别优选30至40个核酸碱基的核酸序列。
20.一种克隆载体，其具有一或多个权利要求14至19的DNA序列。
21.一种表达载体，其具有一或多个权利要求14至19的DNA序列，且经合适的方式连接一表达控制序列。
22.一种宿主细胞，其为细菌、酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞，且其已由权利要求21的表达载体转化或转染。
23.一种用于对映体选择性地获得S-2-羟基酸酯的方法，其包含在权利要求1至9及12中任一项的氧化还原酶、NADPH及水的存在下，将2-含氧酸酯还原成相应的S-2-羟基酸酯，及分离所产生的S-2-羟基酸酯。
24.权利要求23的方法，其中所使用的2-含氧酸酯为式I化合物R2-C(O)-C(O)-O-R1 (I)其中R1为1.-(C1-C20)-烷基，其中烷基为直链型或支链型，2.-(C2-C20)-烯基，其中烯基为直链型或支链型，并根据链长而含有一、二、三或四个双键，3.-(C2-C20)-炔基，其中炔基为直链型或支链型，且当合适时，含有一、二、三或四个三键，4.-(C6-C14)-芳基，5.-(C1-C8)-烷基-(C6-C14)-芳基，6.-(C5-C14)-杂环，其为未经取代的，或为被卤素、羟基、氨基或硝基取代一至三次的，或7.-(C3-C7)-环烷基，且R2为1.-(C1-C20)-烷基，其中烷基为直链型或支链型，2.-(C2-C20)-烯基，其中烯基为直链型或支链型，并根据链长而含有一、二、三或四个双键，3.-(C2-C20)-炔基，其中炔基为直链型或支链型，且当合适时，含有一、二、三或四个三键，4.-(C6-C14)-芳基，5.-(C1-C8)-烷基-(C6-C14)-芳基，6.-(C5-C14)-杂环，其为未经取代的，或被卤素、羟基、氨基或硝基取代一至三次的，或7.-(C3-C7)-环烷基，其中如上述1至7所定义的基团为未经取代的，或彼此独立地被如下群体取代一至三次a)-OH，b)卤素，如氟、氯、溴或碘，c)-NO2，d)-C(O)-O-(C1-C20)-烷基，其中烷基为直链型或支链型，且为未经取代的，或被卤素、羟基、氨基或硝基取代一至三次的，或e)-(C5-C14)-杂环，其为未经取代的，或被卤素、羟基、氨基或硝基取代一至三次的。
25.一种用于对映体选择性地获得S-2-羟基酸酯的方法，其包含a)在权利要求1至9及12中任一项的氧化还原酶、NADPH及水的存在下，将2-含氧酸酯还原成对应的S-2-羟基酸酯，b)同时利用脱氢酶和共同底物将由该氧化还原酶所产生的NADP还原成NADPH，及c)分离所产生的手性S-2-羟基酸酯。
26.权利要求25的方法，其中所使用的2-含氧酸酯为权利要求24所述的式I化合物。
27.权利要求25或26的方法，其中所使用的脱氢酶为来自布氏热厌氧菌、克非利乳杆菌或短乳杆菌的醇脱氢酶，且所使用的共同底物为乙醇、2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇或2-辛醇。
28.权利要求25或26的方法，其中所使用的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶，且所使用的共同底物为葡萄糖，或者所使用的脱氢酶为NADPH-依赖性甲酸脱氢酶，且所使用的共同底物为甲酸盐，诸如甲酸铵，甲酸钠或甲酸钙。
29.一种用于对映体选择性地获得S-2-羟基酸酯的方法，其包含a)在权利要求1至9及12中任一项的氧化还原酶、NADPH及水的存在下，将2-含氧酸酯还原成相应的S-2-羟基酸酯，b)同时利用脱氢酶和共同底物将由该氧化还原酶所产生的NADP还原成NADPH，c)在有机溶剂的存在下进行该反应，及d)分离所产生的手性S-2-羟基酸酯。
30.权利要求29的方法，其中所使用的2-含氧酸酯为权利要求24所述的式I化合物。
31.权利要求29或30的方法，其中所使用的脱氢酶为来自布氏热厌氧菌、克非利乳杆菌或短乳杆菌的醇脱氢酶，且所使用的共同底物为乙醇、2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇或2-辛醇。
32.权利要求29或30的方法，其中所使用的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶，且所使用的共同底物为葡萄糖，或者所使用的脱氢酶为NADPH-依赖性甲酸脱氢酶，且所使用的共同底物为甲酸盐，诸如甲酸铵，甲酸钠或甲酸钙。
33.权利要求29-32中一或多项的方法，其中所使用的有机溶剂为乙醚、叔丁基甲醚、二异丙醚、二丁醚、醋酸丁酯、庚烷、己烷或环己烷。
34.权利要求29-32中一或多项的方法，其中该有机相为全部反应体积的5％至80％，优选10％至40％。
全文摘要
本发明涉及一种可从乳杆菌取得的NADPH－依赖性氧化还原酶，涉及以对映体选择的方式将2－含氧酸酯类还原成相应的手性S－2－羟基酸酯类的酶的方法，以及经由酶－偶联的辅酶再生反应，以对映体选择方式取得S－2－羟基酸酯类的酶的方法。
文档编号C12P7/62GK1517436SQ20041000206
公开日2004年8月4日 申请日期2004年1月9日 优先权日2003年1月9日
发明者M·鲍克瓦, A·谷普达, A·泽姆尔, M 鲍克瓦, 沾, 范 申请人:于利希酶产品有限公司