专利名称：人睾丸特异基因hsd－1(spag8)编码蛋白质的生物学功能的制作方法
技术领域：
本发明为一个在精子发生过程中参与有丝分裂的人睾丸特异表达基因HSD-1(SPAG8)，其编码的蛋白质命名为hSMP-1，涉及生物医学高技术中新基因、新蛋白质的开发与应用领域。
背景技术：
1995年本实验室缪时英等采用含抗精子抗体、可引起精子凝集的不孕妇女血清作为探针筛选人睾丸λgt11表达型cDNA文库，获得一长约1.7kb的cDNA片段。后利用5’，3’-RACE的方法获得了2482bp的全长核苷酸，并将该基因命名为HSD-1。经克隆测序结合基因组信息学分析证实该基因由7个外显子和6个内含子组成，其mRNA的转录过程受到变位剪接的调控。多组织Northern blot分析显示，该基因仅在睾丸组织中特异表达。其编码的人精子膜蛋白hSMP-1在人睾丸的各级生精细胞中都有表达，提示该基因/蛋白与精子发生过程有关。动物实验表明hSMP-1羧端亲水性较强的肽段具有抗生育功能。2003年HSD-1基因被人类基因命名数据库命名为SPAG8。
发明目的阐明hSMP-1蛋白的生理生化功能，不仅对了解精子发生过程中的调控机理具有重要的意义，并且为相关疾病的基因诊断、基因治疗及抗生育研究提供可能的目标基因，为相关疾病治疗药物提供潜在的靶向载体。
内容与要求应用基因组信息学原理、cDNA文库筛选、DNA序列测定技术、5’，3’-RACE、酵母双杂交技术、基因表达与蛋白质纯化技术、抗血清制备、Western Blot检测、免疫组织化学等技术，克隆鉴定了编码Ran结合蛋白-RanBPM的全长cDNA序列；表达纯化了目的蛋白并免疫家兔制备了抗血清，进而进行了免疫组织化学分析；借助pull-down、免疫共沉淀技术、细胞免疫荧光及激光共聚焦显微等技术，验证了hSMP-1蛋白和RanBPM蛋白在体外和体内的相互作用；综合运用细胞培养、流式细胞分析、细胞免疫荧光及激光共聚焦显微等技术初步确定了hSMP-1蛋白的生物学功能。
该基因/蛋白质达到的技术指标为1.HSD-1基因编码蛋白质hSMP-1和位于微管组织中心的Ran结合蛋白-RanBPM在酵母系统中能够相互作用。
2.RanBPM与GST形成的融合蛋白于大肠杆菌中获得明显表达，经亲和层析纯化后的产物免疫家兔，制备了高滴度抗GST-RanBPM抗体。
3.RanBPM蛋白在人睾丸组织中主要表达于精原细胞与初级精母细胞(见图1)。
4.RanBPM蛋白和hSMP-1蛋白在体外和体内都具有相互作用(见图2，3，4)。
5.在CHO细胞中，RanBPM蛋白和hSMP-1蛋白呈现完全共定位(见图5)。
6.hSMP-1蛋白对微管的组装具有一定的抑制作用(见图6)。
7.hSMP-1蛋白的过量表达使细胞周期在G2/M期延长。在有丝分裂的过程中，该蛋白质与组成纺锤体的微管完全共定位(见图7，8，9)。
8.该基因及其编码蛋白质与微管的组装/去组装，以及有丝分裂过程中纺锤体的形成等生命现象密切相关。
图1.免疫组织化学方法检测RanBPM在人睾丸组织中的表达左图为对照组，蓝色为苏木精细胞核对照染色；右图为实验组，RanBPM主要定位于精原细胞与初级精母细胞。左图和右图均放大500倍。
图2.SDS-PAGE检测hSMP-1与RanBPM的体外结合1MBP-hSMP-1实验组；2MBP对照组；3纯化的MBP-hSMP-1蛋白；4纯化的MBP蛋白；5纯化的GST-RanBPM蛋白图3.亲和层析结合Western印迹检测hSMP-1与RanBPM的体外结合1睾丸抽提液；2MBP-hSMP-1实验组；3MBP对照组；4免疫前血清对照组此结果表明纯化的MBP-hSMP-1可以与睾丸抽提液中的RanBPM结合。
图4.细胞免疫共沉淀结合Western Blot检测hSMP-1与RanBPM的体内结合以ProteinA-Agarose结合兔抗RanBPM蛋白抗血清为亲和柱，加入转染了相应真核表达质粒的细胞裂解液进行免疫共沉淀实验。以抗hSMP-1的兔血清为第一抗体，AP结合的羊抗兔IgG为第二抗体进行Western Blot检测。组5中用免疫前兔血清代替兔抗hSMP-1蛋白抗血清。
1实验组GFP-hSMP-1和RanBPM共沉淀；2对照组GFP-hSMP-1在CHO-K1细胞中的表达；3对照组GFP在CHO-K1细胞中的表达；4对照组GFP和RanBPM不能共沉淀；5对照组GFP-hSMP-1和RanBPM不能与免疫前血清共沉淀。
图5.hSMP-1蛋白与RanBPM蛋白在CHO-K1细胞中的共定位研究A中红色荧光显示RanBPM在细胞中的定位；B中绿色荧光显示hSMP-1的定位；C为前两张图片叠加的结果。两种荧光叠加后呈现黄色，显示hSMP-1蛋白与RanBPM蛋白在CHO-K1细胞中完全共定位。
图6.hSMP-1蛋白对微管的组装具有一定的抑制作用A和D中的红色荧光为α-tubulin；B和E中的绿色荧光分别为GFP-hSMP-1和GFP；C和F分别为其左侧两张图片的叠加结果。结果发现，转染了pEGFP-C1载体的细胞低温处理，然后在37℃培养30min，因低温而解聚的微管蛋白被重新组装；而转染了pEGFP-C1-hSMP-1的细胞经低温处理后，37℃培养相同的时间，微管蛋白仍然以单体的形式存在，且与pEGFP-C1-hSMP-1完全共定位。推测这是由于hSMP-1抑制了微管的组装。
图7.细胞同步化后细胞周期的分析A释放后6h实验组G1期和G2/M期细胞数分别为23.9％、57.8％；B释放后6h对照组G1期和G2/M期细胞数分别为19.6％、59.8％；C释放后8h实验组G1期和G2/M期细胞数分别为48.6％、16.9％；D释放后8h对照组G1期和G2/M期细胞数分别为75.4％、4.1％。以上结果表明与对照组相比，实验组细胞在G2/M期延长。
图8.hSMP-1蛋白在CHO-K1中的表达定位研究左图显示的是hSMP-1蛋白在间期的表达定位，右图显示的是该蛋白质在分裂期的表达定位。图中蓝色代表细胞核，绿色为GFP-hSMP-1融合蛋白，红色为微管。三者叠加的结果见各图的右下方。结果显示细胞在间期时，hSMP-1蛋白位于微管组织中心区域；当细胞处于分裂期时，hSMP-1蛋白与组成纺锤体的微管完全共定位。
实施例1.hSMP-1蛋白相互作用蛋白质分子的筛选将HSD-1 cDNA的3’端429bp克隆入pAS2-1质粒，构建诱饵质粒。
用500μg人睾丸pACT2文库质粒转化带有pAS2-1-HSD-1的酵母菌株Y190，共得到转化子1.92×106，转化子总数大于睾丸文库的独立克隆数，可满足筛库要求。一周后在SD/Trp-Leu-His-+20mmol/L3-AT培养基上挑取较大的克隆进行β-半乳糖苷酶活性检测。随后将初步判断为阳性的克隆扩增并抽提酵母质粒，将酵母质粒电转化大肠杆菌HB101进行质粒挽救；将挽救的质粒重新转化Y190，以排除假阳性。最后获得一与诱饵质粒相互作用克隆，该克隆编码位于微管组织中心的Ran结合蛋白-RanBPM，全长500个氨基酸。
2.RanBPM的原核表达、纯化及抗血清的制备将RanBPM cDNA克隆至pGEX-4T1载体中，转化BL21细胞，经IPTG诱导后获得高效表达的GST-RanBPM融合蛋白。GST-RanBPM融合蛋白的纯化应用Pharmacia公司纯化试剂盒进行，利用SDS-PAGE检测蛋白质的纯度(图2)。纯度大于90％的蛋白质即可用于抗血清的制备。
将纯化的GST-RanBPM融合蛋白与弗氏完全佐剂混合，免疫新西兰大耳白兔，采用背部皮下多点注射，约20-30点。初始免疫后2、4、8周采用抗原和弗氏不完全佐剂混合进行加强免疫。酶联免疫吸附测定(ELISA)抗体滴度，Western Blot检测抗体特异性。
3.睾丸组织切片的免疫组织化学分析用改良Bovin液固定5μm厚睾丸组织冰冻切片10min。PBS洗2次，每次5min。3％H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性。5-10％正常羊血清(PBS配)室温封闭10min。倾去封闭液，滴加适当稀释的抗RanBPM抗血清，4℃过夜。PBS洗3次，每次5min。滴加适当稀释的生物素标记二抗，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次5min。滴加适当稀释的辣根过氧化物酶标记的链亲和素霉卵白素复合物，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次5min。AEC(Aminoethyl Carbazole)显色(4mg AEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml 0.1mol/L乙酸缓冲液，pH5.2，加入15μl 30％H2O2，过滤后即可)40min。自来水充分冲洗，苏木精复染，封片(图1)。
4.pull-down实验证明hSMP-1蛋白和RanBPM蛋白在体外的相互作用将编码hSMP-1蛋白羧基端143个氨基酸的cDNA克隆至pMAL-c2X(New England Biolabs)载体中，用CaCl2法转化BL21细胞，经IPTG诱导后获得高效表达的带麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的融合蛋白。
首先小量培养鉴定融合蛋白表达水平及该融合蛋白在细胞内的表达形式，然后进行大量表达，自经过鉴定的质粒保存板中挑单菌落入100ml新鲜LB的锥形瓶，37℃剧烈摇动培养过夜。将过夜菌液按1/10比例接种到一个含500ml LB的2000ml锥形瓶中，37℃剧烈摇动培养1-1.5h，使菌液的AD600nm值达0.4-0.6。加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，诱导表达2h。收集培养物，5000rpm离心10min，弃上清。PBS洗菌体沉淀，用PBS按照5ml/g重悬，冰浴下以工作10s/冷却20s/300W/20次的参数，超声破碎细胞。12000rpm离心20min，分别取少量上清和沉淀，进行SDS-PAGE检测，分析蛋白质在胞内表达形式。其余于-70℃冻存备用。同时按照相同的方法转化pMAL-c2X载体，并大量表达MBP蛋白。
采用New England Biolabs公司的amylose resin产品进行蛋白质的纯化。经鉴定MBP蛋白与MBP-hSMP-1蛋白都表达在上清中。首先用预冷的column buffer平衡50μl amylose resin，然后将amyloseresin与上清液混合，4℃孵育2～3小时，以column buffer漂洗amylose resin 3～5次后，将其重悬于50μl1×SDS上样缓冲液中，100℃煮沸10min，电泳检测蛋白质的纯度(图2)。
取MBP-hSMP-1融合蛋白溶液和MBP蛋白溶液分别与50μl amylose resin混合，4℃孵育2h后，向层析柱中分别加入纯化的GST-RanBPM蛋白，4℃孵育2h。用column buffer冲洗后，加入洗脱液，使其缓慢流出。收集流出液，用10％SDS-PAGE电泳检测洗脱的蛋白质(图2)。
取MBP-hSMP-1融合蛋白溶液和MBP蛋白溶液分别与50μl amylose resin混合，4℃孵育2h后，向两个体系中分别加入以EBC(50mM Tris-Cl，pH8.0，120mM NaCl，0.5％NP-40，50mM NaF，50μg/ml PMSF，10μg/ml aprotinin and leupeptin)溶液制备的人睾丸提取液，4℃孵育3h。用column buffer冲洗后，将amyloseresin转移至1.5ml离心管中，向离心管中加入1×SDS上样缓冲液100μl，悬浮凝胶珠，100℃煮沸10分钟，取20μl行10％SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE结束后，将塑料支架平放，依次放置海绵垫、3层滤纸、凝胶、NC膜、3层滤纸、海绵垫，驱除各层间气泡，夹好支架，在冰浴中进行电转，40V，8-10h；或100V，1h 20min(PVDF膜需经100％甲醇浸透，电转液平衡20min后方可使用)。电转结束后，将膜置于去离子水中漂洗5min。切下边侧的蛋白质分子量Marker条带，浸入0.2％氨基黑染液染色1-2min，然后10％乙酸脱色至可见蛋白质条带，蒸馏水漂洗观察转移效果，并密封保存留待以后作为分析结果时分子量的参照。转移的滤膜勿干，准备用于杂交。将做好标记的滤膜经TBS漂洗后，加入适量封闭液(含5％脱脂奶粉、1％正常羊血清的TBS-T溶液)中，室温轻摇2h。将滤膜放入杂交袋内，按照0.1ml/cm2加入1∶1000的抗RanBPM抗血清，除尽气泡，封口。于4℃轻摇过夜。取出滤膜，用TBS-T洗三次，每次10min。将膜放入塑料袋内，按照0.1ml/cm2加入碱性磷酸酶标记的抗兔血清。赶除气泡，封口。室温振荡2h。取出滤膜，用TBS-T洗三次，每次10min。用显色缓冲液(100mM NaCl，5mM MgCl2，100mM Tris-HCl pH9.5)洗膜5min。将滤膜浸入含100μl ReagentA与100μl Reagent B(Bio-Rad)的10ml显色缓冲液中，于室温下轻轻摇晃使蛋白质条带显现，蒸馏水中漂洗，4℃避光保存并扫描(图3)。
5.细胞免疫共沉淀实验证明hSMP-1蛋白和RanBPM蛋白在体内的相互作用由于Hela细胞中有RanBPM的内源性表达，因此选择Hela细胞作为实验模型。首先将HSD-1 cDNA克隆入pEGFP-C1(Clontech公司)，构建融合的绿色荧光蛋白表达载体，并对重组质粒进行测序鉴定。待细胞长至90％汇合度时，将pEGFP-C1-hSMP-1和pEGFP-C1质粒用Lipofectamine2000分别转染入细胞。48h后收集细胞。每瓶中加入1ml冰预冷的EBC细胞裂解液(50mM Tris-Cl，pH8.0，120mM NaCl，0.5％NP-40，50mM NaF，50μg/ml PMSF，10μg/ml aprotinin and leupeptin)，放置冰上裂解1h，其间追加一次PMSF，并且间隔10min用细胞刮搅动一次。细胞裂解物于4℃ 14000rpm离心20min后收集上清。向1ml细胞裂解液中加入40μl anti-RanBPM的兔抗血清；另取1ml细胞裂解液，加入40μl正常兔血清，作为对照组。4℃振摇1h后再分别加入40μl proteinA agarose，4℃振摇过夜。ProteinA agarose用NETN溶液(20mM Tris-Cl，pH8.0，100mM NaCl，0.5％NP-40，1mM EDTA)漂洗后，重悬于50μl 1×SDS上样缓冲液中，100℃煮沸10min，用抗hSMP-1的兔血清作为一抗，碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG作为二抗进行WesternBlot检测(图4)。
6.hSMP-1蛋白和RanBPM蛋白在CHO-K1细胞中的共定位将RanBPM cDNA克隆入pDsRed1-N1(Clontech公司)，构建融合的红色荧光蛋白表达载体，并对重组质粒进行测序鉴定。在CHO-K1细胞中进行pEGFP-C1-hSMP-1和pDsRed1-N1-RanBPM两种质粒的共转染，以检测两者的定位情况。实验方法如下准备将盖玻片分次置于浓酸中浸泡2h，用去离子水洗净后室温干燥。将经酸处理的盖玻片置于10倍稀释的多聚赖氨酸溶液中，室温放置5min后取出，置于60℃干燥1h或室温过夜。用前将盖玻片浸泡于75％乙醇中至少30min。
将处于对数生长期的细胞接种于放置了盖玻片的35mm培养皿中，每孔3×105个细胞，37℃，5％CO2培养至90％饱和度。用50μl无抗生素无血清DMEM分别稀释5μg质粒和5μl Lipofectamine 2000。室温放置2min后将稀释的质粒和Lipofectamine 2000混匀，室温放置20min。将上述混合物加到6孔培养板中，来回振荡混匀后放置于CO2孵箱。转染4-6h后，将培养基换为有血清DMEM培养基，于37℃，5％CO2孵箱中继续培养。
细胞化学荧光染色1)细胞固定用PBS清洗细胞两次，取出盖玻片，用滤纸将残留液体吸干，以4％多聚甲醛固定液室温固定10min。2)PBS漂洗，3×5min。3)封片取10μl封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片，周围用指甲油封住。4)激光共聚焦显微镜(LEICA TCS NT)观察。结果显示，两种蛋白在CHO-K1细胞中呈完全的共定位(图5)。
7.hSMP-1蛋白能抑制微管的组装按上述方法将pEGFP-C1-hSMP-1质粒和pEGFP-C1质粒分别转染CHO-K1细胞，24h后将细胞4℃放置90min，然后换成正常培养基37℃培养30min。收集细胞，进行细胞免疫荧光染色，实验方法如下1)细胞固定用PBS清洗细胞两次，取出盖玻片，用滤纸将残留液体吸干，以4％多聚甲醛固定液室温固定10min。2)PBS漂洗，3×5min。3)细胞透化室温下，0.5％Triton/PBS透化处理10min。4)PBS漂洗，3×5min。5)细胞封闭以3％BSA/PBS封闭，37℃，30min或4℃过夜。6)一抗孵育小鼠α-tubulin抗体按1∶100稀释，37℃，30min。7)PBS漂洗，3×5min。8)二抗孵育羊抗鼠抗体按1∶50稀释，37℃，30min。9)PBS漂洗，3×5min。10)去离子水漂洗，2×5min。11)封片取10μl封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片，周围用指甲油封住。12)用激光共聚焦显微镜(LEICA TCS NT)观察(图6)。
8.稳定表达hSMP-1蛋白的细胞株的筛选取处于对数生长期的CHO-K1细胞按5×104/孔的密度传代于12个35mm培养皿，24h后向各培养皿中分别按以下浓度加入G4180，50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml，1000μg/ml。每3天换液，培养10-14天，以使35mm培养皿内细胞全部死亡的最低浓度为G418最低致死浓度。实验结果发现G418最低致死浓度为500μg/ml。
培养CHO-K1细胞，分别转染pEGFP-C1-hSMP-1和pEGFP-C1质粒。转染后24-72h，观察细胞状态。待细胞接近完全汇合时，1∶6-1∶10传代。然后加入终浓度为500μg/ml的G418，每2-3天换一次液。待长出细胞克隆后，置于荧光显微镜下观察。用记号笔在有绿色荧光的克隆的相应位置标记，然后在超净台上用无菌牙签挑取阳性克隆，接种于24孔板中，继续培养。待细胞长满后，转移至25cm2的培养瓶中继续培养。收集培养瓶中的细胞，加入100μl 1×SDS上样缓冲液裂解细胞，Western检测是否有目的蛋白的表达。
9.应用表达hSMP-1蛋白的稳定克隆，研究hSMP-1蛋白对细胞周期的影响及其在不同时相的表达定位情况将稳定表达GFP-hSMP-1融合蛋白、GFP蛋白的CHO-K1细胞按照3×105/孔的密度分别传至60mm培养皿中。待细胞生长至指数生长期时，向培养基中加入终浓度为2mM的脱氧胸苷，作用12h后换成正常培养基，间隔8-10h后再次加入终浓度为2mM的脱氧胸苷，使绝大部分细胞同步化于S期。换成正常培养基释放，间隔2-4h取样，以流式细胞计量仪分析细胞周期。实验方法如下1)用胰酶消化收集细胞，PBS洗两遍。2)以0.5mlPBS重悬细胞，迅速打入5ml 70％预冷乙醇中，吹打均匀，4℃固定12h以上。3)PBS洗去乙醇，1,500rpm，5min。4)0.5mlPBS重悬细胞，加入RNaseA至终浓度50μg/ml，37℃，30min。5)加入PI至终浓度50μg/ml，37℃，30min。6)用流式细胞仪测定细胞周期。(图7)同时取样进行细胞免疫荧光染色1)细胞固定用PBS清洗细胞两次，取出盖玻片，用滤纸将残留液体吸干，以4％多聚甲醛固定液室温固定10min。2)PBS漂洗，3×5min。3)细胞透化室温下，0.5％Triton/PBS透化处理10min。4)PBS漂洗，3×5min。5)细胞封闭以3％BSA/PBS封闭，37℃，30min或4℃过夜。6)一抗孵育小鼠α-tubulin抗体按1∶100稀释，37℃，30min。7)PBS漂洗，3×5min。8)二抗孵育羊抗鼠抗体按1∶50稀释，37℃，30min。9)PBS漂洗，3×5min。10)Hochest33258染细胞核，室温下5-10min。11)去离子水漂洗，2×5min。12)取10μl封片剂滴在载玻片上，将盖玻片有细胞的一面朝下封片，周围用指甲油封住。13)用激光共聚焦显微镜(LEICA TCS SP)观察(图8)。
权利要求
1.本发明涉及一个人睾丸特异表达的HSD-1基因(2003年该基因被人类基因命名数据库命名为SPAG8)编码的蛋白质，命名为hSMP-1。
2.根据权利要求1所述之hSMP-1蛋白，其特征在于该蛋白质在酵母双杂交系统中能够与位于微管组织中心的Ran结合蛋白-RanBPM相互作用。
3.根据权利要求1、2所述之hSMP-1蛋白，其特征在于RanBPM蛋白和hSMP-1蛋白在体外和体内都具有相互作用。
4.根据权利要求1、2、3所述之hSMP-1蛋白，其特征在于在酵母双杂交系统中与该蛋白质相互作用的RanBPM蛋白在人睾丸组织中主要表达于精原细胞与初级精母细胞。
5.根据权利要求1、2、3、4所述之hSMP-1蛋白，其特征在于在CHO细胞中，RanBPM蛋白和hSMP-1蛋白呈现完全共定位。
6.根据权利要求1、2、3、4、5所述之hSMP-1蛋白，其特征在于该蛋白质对微管的组装具有一定的抑制作用。
7.根据权利要求1、2、3、4、5、6所述之hSMP-1蛋白，其特征在于该蛋白质的过量表达使细胞周期在G2/M期延长。同时在有丝分裂的过程中，该蛋白质与组成纺锤体的微管完全共定位。
8.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7所述之hSMP-1蛋白，其特征在于该蛋白质与微管的组装/去组装，以及有丝分裂过程中纺锤体的形成等生命现象密切相关。在抗生育领域以及新药的设计与开发中具有潜在的应用前景。
全文摘要
本发明涉及一个人睾丸特异表达的基因编码蛋白质的生物学功能，该基因命名为HSD－1，其编码蛋白质命名为hSMP－1。2003年HSD－1基因被人类基因命名数据库命名为SPAG8。内容包括以hSMP－1蛋白作为“诱饵”，利用酵母双杂交的方法筛选人睾丸cDNA文库，得到编码RanBPM的cDNA片段。免疫组化结果显示，RanBPM在人睾丸组织中主要定位于精原细胞与初级精母细胞。之后分别从体外和体内两个方面证实了hSMP－1蛋白和RanBPM蛋白的相互作用。细胞免疫荧光结果显示，在CHO－K1细胞中，过表达的“诱饵”蛋白和“捕获”蛋白呈现完全共定位。一系列研究发现hSMP－1蛋白可调节微管的活生，参与有丝分裂的过程，引起细胞周期的变化。阐明其生理生化功能对了解基因表达调控规律和生殖细胞的发生机理具有重要的意义。
文档编号C12N15/12GK1667121SQ20041000479
公开日2005年9月14日 申请日期2004年3月11日 优先权日2004年3月11日
发明者唐晓玲, 张建超, 才迎, 缪时英, 宗书东, 王琳芳 申请人:中国医学科学院基础医学研究所