专利名称：一种与人头发及牙齿发育相关蛋白及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物领域中的一种功能蛋白质及其编码基因，特别涉及一种与人头发及牙齿发育相关蛋白及其编码基因。
背景技术：
X连锁外胚层发育不全无汗综合征(hypohidrotic ectodermal dysplasia，XLHED)是以汗腺、毛发及牙齿等外胚层来源组织发育不全或形态缺陷为特征的遗传性疾病，人群中发病率为1～7/10000，其典型临床特征表现为少汗或无汗，毛发稀或全秃，牙齿缺陷或牙形态异常等症状(Nature Genetics，1996，13409-416；NatureGenetics，1998，53205-209；Arch Dematol Res，2003，29538-42)，但个体间表型差异存在较高异质性。外胚层发育不全无汗综合征(anhydrite ectodermic dysphasia，EDA)相关基因已被克隆，定位于X染色体短臂Xp12-13.1区，它编码的蛋白质称为ectodysplasin-A(EDA)，是肿瘤坏死因子超家族成员。该基因由12个外显子组成，其中的8个外显子(第1、3、4、5、6、7、8和9外显子)编码EDA。
EDA一般呈X连锁隐性遗传，男性受累者临床表现明显，而携带突变基因女性，通常无明显表型或表型变化轻微。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种与人头发及牙齿发育相关蛋白及其编码基因。
本发明所提供的与人头发及牙齿发育相关蛋白，名称为PUMC-04-01，是EDA的自氨基端第65位氨基酸残基由精氨酸残基突变为甘氨酸残基的蛋白质。
与人头发及牙齿发育相关蛋白具有序列表中序列1的氨基酸残基序列。
序列表中的序列1由147个氨基酸残基组成。
编码上述与人头发及牙齿发育相关蛋白的基因(名称为PUMC-04-01)也属于本发明的保护范围。
所述与人头发及牙齿发育相关蛋白编码基因具体可为第一外显子的自5′端第193位由C突变为G的EDA基因。
含有上述与人头发及牙齿发育相关蛋白编码基因的表达载体、细胞系及工程菌也属于本发明的保护范围。
本发明以蒙古族七代患有先天性缺牙并伴有头发卷曲特征的大家系为研究样本，得到了与人头发及牙齿发育相关蛋白及其编码基因。研究表明与人头发及牙齿发育相关蛋白及其编码基因是蒙古族先天缺少牙齿合伴头发卷曲临床表型的相关基因(14例男性受累者100％为193G/G纯合型)。该基因是在EDA基因的第193位野生型胞嘧啶核苷酸被鸟嘌呤核苷酸取代，即发生193C→G颠换，使野生正常密码CGC→GGC，致使所编码的第65位精氨酸变为甘氨酸。此突变发生在跨膜蛋白EDA的膜外部分，该区域富含亲水精氨酸，被甘氨酸取代后，将使EDA基因编码蛋白构像发生轻微改变，从而影响牙齿和头发发育过程中的信号传递，导致新表型的出现。
先天性缺牙属X连锁隐性遗传性疾病。男性受累者临床表型变化明显但严重程度不一；女性突变基因携带者无临床表现或表现轻微，70％以上女性携带者在其生育受累男孩之前是无法从临床表型判断其是正常还是突变基因携带者。所以，基于上述临床特点，本发明提供的与人头发及牙齿发育相关蛋白及其编码基因为X-连锁先天缺少牙齿疾病的基因诊断提供了必要性和可能性，如进行婚前遗传咨询鉴定女性是否携带本发明的与人头发及牙齿发育相关蛋白的编码基因；进行基于DNA的产前诊断，可减少男性受累者和携带突变纯合等位基因女性即先天无牙颌患者的出生率，以达到提高人口素质的目的。
图1为蒙古族先天缺牙并伴有卷发大家系系谱2a为先天缺牙伴头发卷曲先证者VI9牙齿的X线全景曲面断层片及牙位记录2b为先天缺牙伴头发卷曲先证者VI9外观正面3a为VI6牙齿的X线全景曲面断层片图3b为IV3牙齿的X线全景曲面断层片图3c为VI11牙齿的X线全景曲面断层片图3d1为V29牙齿的X线全景曲面断层片图3d2为V29外观正面3e为VI45牙齿的X线全景曲面断层片图3f为V23牙齿的X线全景曲面断层片图3g1为V3牙齿的X线全景曲面断层片图3g2为V3外观正面4为EDA基因突变位置及其对应氨基酸变化具体实施方式
实施例1、与头发及牙齿发育相关蛋白及其编码基因的获得
1、样本选择研究样本来自蒙古族大家系。蒙古族长期以放牧为主要生活方式，由于地理环境及民俗等原因形成一个相对隔离人群，从而导致遗传性状多样性和特殊的疾病谱。先证者由遗传门诊发现并由口腔科确诊为先天性缺少牙齿。对其家系102名成员进行现场调查，绘出本家系系谱图(见图1)，填写外胚层发育不全综合征有关症状调查表以及知情同意书。其中56名主要成员进行详细身体检查(如一般情况、B超、心电图、皮肤、汗腺、掌跖角化程度、毛发、指甲、眼部和粘膜等症状的检查)。选择8名患者拍摄X线全景曲面断层片。本病在该家系已传7代，发病从I2携带者引起。III7和III8姑表兄妹婚配，生育3个女儿，其中一个有典型XLHED特征，另两个是肯定的突变基因携带者。调查了解IV9为先天无牙颌畸形，已死亡。该蒙古族先天缺失牙家系共有患者22名，前三代5名患者已经死亡。现有16名患者，男性14名，女性2名。患者最高年龄72岁，最小4岁，男性患者症状较重(牙齿最多20颗牙，最少7颗牙)。女性患者症状较轻(如V3表现11、21、31、41缺如，V31表现12、22缺如)。家系成员身体素质和饮食正常。
2、研究样本的特征研究样本为蒙古族七代患有先天性缺牙并伴有头发卷曲特征的大家系，现有受累成员16例，其中男14例，女2例。该样本中的受累成员具有与迄今为止国内外报导的XLHED患者完全不同的特点不是少或无发，而是头发稠密且卷曲。其家系谱如图1所示，图1中，七代先天缺失牙家系系谱中 为先证者；⊙携带突变基因表型正常者；■先天缺失牙男性受累者；●突变基因纯合型女性；□男性表型正常者；○女性表型正常者； 少4颗和2颗牙齿的杂合女性；⊙＝■为近亲婚配。
(1)先证者特征先证者VI9为14岁男孩，学生。其临床表型特征如图2a和图2b所示，临床表现为共有16颗牙齿，由于无4颗第二双尖牙牙胚而4颗第二乳磨牙滞留。除4颗乳磨牙和4颗第一磨牙外，其余牙齿形态异常均呈锥形，排列稀疏。头发乌黑呈卷曲状，上唇稍上翻(图2b)。皮肤、汗腺、掌跖角化程度、毛发、指甲、眼部和粘膜等部位的检查未发现异常。
(2)受累者的临床表现VI6，男，18岁，学生。临床表现为共有20颗牙齿，其中两颗乳牙(即2V、4V)在X线全景曲面断层片(图3a)显示上双侧侧切牙为埋伏牙，头发卷曲，上唇稍上翻，掌跖角化明显。IV3，男，72岁，牧民，共有7颗牙(图3b)，身体健康，无其它疾病症状。VI11，男，6岁，未上学，现有牙齿6颗，X线全景曲面断层片(图3c)显示有5颗埋伏牙(即16、17、26、36、46)，头发卷曲。V29，男，45岁，共有9颗牙(图3d1)，头发卷曲，嘴唇稍上翻(图3d2)。三年前患有脑血栓，现康复中。VI45，男，19岁，学生，共有10颗牙，其中4颗是第二乳磨牙(图3e)，头发卷曲，上唇稍上翻。V23，男，50岁，共有14颗牙(图3f)，头发卷曲，上唇稍上翻。V3，女，40岁，共有26颗牙，上下双侧中切牙缺如，双侧下第3磨牙未萌出(图3g1)，头发稍微卷曲(图392)。V31，女，42岁，共有30颗牙，上双侧侧切牙缺如。
(3)该家系的特殊性该先证者及所有受累成员与目前报告的EDA受累者具有明显不同的临床特征该先证者及所有受累成员只有先天性缺失牙齿，汗腺、唾液腺和皮肤等功能正常；缺少牙齿与头发稠密卷曲相伴存在是迄今全世界未见报告的特殊病例(NatureGenetics，1996，13409-416；Nature Genetics，1998，53205-209；Arch DematolRes，2003，29538-42)。以上不同临床表型为EDA基因结构与功能研究提供了最好的范例。
3、与头发及牙齿发育相关蛋白及其编码基因的获得应用聚合酶链反应产物直接测序方法，分析EDA基因第1～9外显子及其旁侧核苷酸序列。根据GenBank(accession No.u59227，AF060992-060998)数据设计扩增1-9外显子所需引物，以基因组DNA为模板，应用PCR扩增方法扩增先证者VI9与家系中表型正常者V28，V27，V25的EDA基因第1、3、4、5、6、7、8和9外显子及其旁侧核苷酸序列，PCR产物直接测序确定其组成及突变碱基部位。其中，PCR反应体系(25μL)基因组DNA 0.05-0.10μg，正反向引物各4pmol，dNTP各2mmol/L，5μL 5×缓冲液(Tris-HCl 10mM pH8.0，2mmol/L MgCl2，5mmol/L KCl)，Taq DNA聚合酶0.5单位(上海复华公司产品)；PCR扩增参数94℃预变性3min后，按“94℃/40s-表1中的相应退火温度/40s-72℃/40s”程序，进行30个循环，72℃再延伸5mim。各外显子特异引物及退火温度如表1。PCR产物经羟基磷灰石柱层析(Qiaquick Purification Kit，Germany)纯化，应用双脱氧末端终止法分析核苷酸序列(北京华大中生生物技术公司)，测定结果与GenBank数据库相应序列比对，确定突变碱基位置及类型。
表1 突变检测引物序列及退火温度
PCR产物测序结果与GenBank(Accession No.U59227，AF060992-060998)序列比对，结果显示表型正常者EDA基因外显子1、3、4、5、6、7、8、9序列与GenBank给定序列完全一致。而先天缺牙伴头发卷曲者与同家系中正常表型者比较，只在第一外显子193位发生胞嘧啶→鸟嘌呤的单核苷酸取代，即C→G颠换，使野生正常密码CGC→GGC，致使所编码第65位精氨酸变为甘氨酸(图4)；外显子3、4、5、6、7、8、9序列相同。图4中a为正常表型者EDA基因第一外显子193C/C纯合型；b为先证者及所有男性受累者第一外显子的193G/G纯合型；c为先证者母亲第一外显子193C/G杂合型。d为R65G氨基酸取代；箭头示193位。将第一外显子的自5′端第193位由C突变为G的EDA基因命名为PUMC-04-01，其编码的蛋白质是EDA的自氨基端第65位氨基酸残基由精氨酸残基突变为甘氨酸残基的蛋白质，将其命名为PUMC-04-01。
实施例2、家系中EDA基因第一外显子193C→G颠换与表型共分离的确认1、以14例男性患者的基因组DNA为模板，在正向引物GTCGGCCGGGACCTCCTC和反向引物GCCGCCGCCCCTACTAGG的引导下按照实施例1的方法进行聚合酶链反应，应用双脱氧末端终止法分析PCR产物的核苷酸序列(北京华大中生生物技术公司)结果表明家系中(除先证者外)所有13例男性受累者第一外显子193位都是鸟嘌呤核苷酸(G)，一致率为100％。
2、家系中女性EDA基因第一外显子193位核苷酸检测按照步骤1的方法对家系中的女性的基因组DNA进行聚合酶链反应，并对PCR产物应用双脱氧末端终止法进行测序，序列分析结果表明先证者母亲IV8为193C/G杂合子；缺少4颗和2颗牙齿的V3和V31均为193C/G杂合子；牙齿数目形态都正常的女性V1、V6、V8、V11、V20、V46、IV10和VI3同是193C/G杂合型，与其生育受累小孩的表型一致；其余女性为193C/C纯合子。
3、选取50例与疾病家系无血缘关系且牙齿、毛发、皮肤和汗腺正常的健康蒙古族女性受试者，按照步骤1的方法对其基因组DNA进行聚合酶链反应，并对PCR产物应用双脱氧末端终止法进行测序，结果表明与疾病家系无血缘关系且牙齿、毛发、皮肤和汗腺正常的健康蒙古族人群EDA基因第一外显子193位核苷酸均为胞嘧啶核苷酸，即C/C纯合型。
4、EDA基因第一外显子193位核苷酸(C或G)的民族差异性为确定EDA基因第一外显子193位核苷酸C→G颠换突变作为基因诊断的可能性、准确性和可行性，比较了汉、蒙族间该位点核苷酸种类。选取50例皮肤、毛发和汗腺等表型正常的汉族健康受试者(取自北京市房山区第一医院，男女各半)按照步骤1的方法对其基因组DNA进行聚合酶链反应，并对PCR产物应用双脱氧末端终止法进行测序。基因序列分析结果表明，健康受试者EDA基因第一外显子193位均为胞嘧啶核苷酸，即C/C纯合型。
本发明提供的与人头发及牙齿发育相关蛋白及其编码基因可应用于婚前遗传咨询鉴定女性是否携带本发明的与人头发及牙齿发育相关蛋白的编码基因；基于DNA的产前诊断，可减少男性受累者和携带突变纯合等位基因女性即先天无牙颌患者的出生率，以达到提高人口素质的目的。
序列表<160>1<210>1<211>147<212>PRT<213>人属人(Homo sapiens)<400>1Met Gly Tyr Pro Glu Val Glu Arg Arg Glu Leu Leu Pro Ala Ala Ala1 5 10 15Pro Arg Glu Arg Gly Ser Gln Gly Cys Gly Cys Gly Gly Ala Pro Ala20 25 30Arg Ala Gly Glu Gly Asn Ser Cys Leu Leu Phe Leu Gly Phe Phe Gly35 40 45Leu Ser Leu Ala Leu His Leu Leu Thr Leu Cys Cys Tyr Leu Glu Leu50 55 60Gly Ser Glu Leu Arg Arg Glu Arg Gly Ala Glu Ser Arg Leu Gly Gly65 70 75 80Ser Gly Thr Pro Gly Thr Ser Gly Thr Leu Ser Ser Leu Gly Gly Leu85 90 95Asp Pro Asp Ser Pro Ile Thr Ser His Leu Gly Gln Pro Ser Pro Lys100 105 110Gln Gln Pro Leu Glu Pro Gly Lys Ala Ala Leu His Ser Asp Ser Gln115 120 125Asp Gly His Gin Val Ser His Leu Val Gly Ala Ala Ala Ala Pro Ser130 135 140Pro Arg Gly14权利要求
1.一种与人头发及牙齿发育相关蛋白，是EDA的自氨基端第65位氨基酸残基由精氨酸残基突变为甘氨酸残基的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述与人头发及牙齿发育相关蛋白具有序列表中序列1的氨基酸残基序列。
3.编码权利要求1或2所述的与人头发及牙齿发育相关蛋白的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述与人头发及牙齿发育相关蛋白编码基因为第一外显子的自5′端第193位由C突变为G的EDA基因。
5.含有权利要求3或4所述的与人头发及牙齿发育相关蛋白编码基因的表达载体。
6.含有权利要求3或4所述的与人头发及牙齿发育相关蛋白编码基因的细胞系。
7.含有权利要求3或4所述的与人头发及牙齿发育相关蛋白编码基因的工程菌。
全文摘要
本发明公开了一种与人头发及牙齿发育相关蛋白及其编码基因。本发明所提供的与人头发及牙齿发育相关蛋白是EDA的自氨基端第65位氨基酸由精氨酸突变为甘氨酸的蛋白质。本发明的与人头发及牙齿发育相关蛋白及其编码基因为X－连锁先天缺少牙齿疾病的基因诊断提供了必要性和可能性，如进行婚前遗传咨询鉴定女性是否携带本发明的与人头发及牙齿发育相关蛋白的编码基因；进行基于DNA的产前诊断，可减少男性受累者和携带突变纯合等位基因女性即先天无牙颌患者的出生率，以达到提高人口素质的目的。
文档编号C12N15/63GK1763088SQ200410083848
公开日2006年4月26日 申请日期2004年10月20日 优先权日2004年10月20日
发明者邱长春, 白海花 申请人:东营协和基因技术有限公司, 中国医学科学院基础医学研究所, 内蒙古民族大学