专利名称：一种用于除皱祛疤的注射液的制备方法
技术领域：
本发明涉及组织工程技术，尤其涉及一种用于除皱祛疤的注射液的制备方法。
背景技术：
在现有技术中，所使用的除皱祛疤的注射液由浓度为1000万-4000万加5％的葡萄糖液组成。在这种注射液的制备方法中，原代细胞的培养多选用悬液法，这种方法的缺点是成功率不高。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术中存在的问题，提供了一种注射液，经临床试验具有良好的除皱祛疤效果。
根据本发明的上述目的，本发明的用于除皱祛疤的注射液的制备方法，包括A.从患者身上取下皮肤组织；B.将所取下的皮肤组织放入培养箱进行扩增培养；C.将扩增培养的成纤维细胞按每毫升900万个-980万个的比例加入标准注射液中，制成细胞悬浊液。
所述步骤A进一步包括用5％的碘块消毒液在耳后或胳膊内侧消毒，然后用2％的利多卡因进行局部表面麻醉。用取皮器将3-4平方毫米的全层皮肤取下，放入组织保存液中，将创伤部位缝合，创口贴覆盖。
所述步骤B进一步包括B1.将取得的组织块和组织液放入培养箱中消化10分钟；B2.去除表皮及真皮下的脂肪；B3.将组织块剪成若干块，并将所剪成的若干块组织以互相为0.5厘米的间隔放入六孔培养板中；B4.将六孔培养板小心放入孵箱，4小时之后沿培养箱的箱壁轻轻补加0.5毫升培养液，24天后再补加1毫升培养液；B5.对组织块进行传代培养4-6周。
所述步骤B5进一步包括每隔2-3天换液一次，当细胞达到50％-70％汇集细胞后传代。
本发明的制备方法采用组织培养法，取得了较高的成功率。
图1示出了制备本发明注射液的流程图。
具体实施例方式
为了便于本领域一般技术人员理解和实现本发明，下面详细说明本发明。
一、自体细胞的提取用5％的碘块消毒液在耳后或胳膊内侧消毒，然后用2％的利多卡因进行局部表面麻醉。用取皮器将3-4平方毫米的全层皮肤取下，放入组织保存液(DMEM+10％胎牛血清+0.25％的胰酶，美国Hyclone公司)中，将创伤部位缝合，创口贴覆盖。
二、注射液的制备如图1所示，在步骤1中，将取得的组织块和组织液放入培养箱(SanyaCO2培养箱)中消化10分钟。然后在步骤2中，去除表皮及真皮下的脂肪。在步骤3中，将组织块剪成若干块(每块约为1-2平方毫米)，并将所剪成的若干块组织以互相为0.5厘米的间隔放入六孔培养板中。在步骤4中，将六孔培养板小心放入孵箱。在步骤5中，4小时之后沿培养箱的箱壁轻轻补加0.5毫升培养液，在步骤6中，24天后再补加1毫升培养液。
培养24小时可以看到有细胞从组织块边缘延伸出来，48小时有大量细胞从边缘生长出来并开始增殖。培养72小时后用0.25％胰酶在37℃孵箱中消化10-15分钟，然后常规传代培养。
在步骤7中，传代培养每隔2-3天换液一次，当细胞达到50％-70％汇集细胞后传代。在步骤8中，当体外培养4-6周后的真皮成纤维细胞按每毫升900万个-980万个的比例加入0.9％的生理水。制成细胞悬浊液。
注射液的作用机理当自体的成纤维细胞回注于本人的皱纹基底真皮层中，成活的成纤维细胞可分泌大量的胶原蛋白，起到除皱的作用。
三.产品检测1.病毒检测将皮肤组织进行培养四周后，取1ml含有细胞的培养液送北京传染病医院进行HIV和肝炎病毒的检验，确定此为无病毒细胞。
2.免疫反应测试第四周将0.1ml细胞悬浮液对受术者进行皮试(同青霉素皮试方法)，以确保无免疫反应。
3.成品检测
1)外观本品为淡白色混悬液。
2)无菌试验按《中国生物制品规程》(2000年版)通则《生物制品无菌试验规程》A/B项进行，结果符合无菌要求。
产品的储存和运输应在2℃-10℃、阴凉、干燥、清洁、避免阳光直射、无腐蚀性气体、无重压的环境中进行。
临床报告一、病例选择年龄在50岁以下(包括50岁)，皱纹为额头、眼周、口周皱纹，疤痕为粉刺、创伤疤痕(大小范围无要求)。
二、治疗过程1.患者术前检查血、尿、便常规、心电图、肝肾功能、HIV、HbsAg。
2.将注射部位用70％的酒精消毒，局部注射1％的利多卡因，或者表皮用2.5％利多卡因和2.5％丙氨卡因软膏麻醉。
3.将1.5ml细胞悬液吸入3ml的注射器备用。
4.取2.2cm长的4.5号针头，采用多点斜面(针头与皮肤的角度20-45°)将细胞悬液注入到真皮层的上层与中层，每个注射部位选取10-15点，每点注射细胞悬液0.05-0.1ml。注射时应将注射部位表皮拉紧，使其发白，注射时应使注射部位留有弥散空间。对皱纹或疤痕部全部注射，注射完后用冰袋外敷2小时。
术后24小时内注射局部可有轻度肿胀、麻木等感觉，一般无其它的局部和全身反应。
疗程一般皱纹注射2次，大的皱纹或瘢痕注射三次，每次注射间隔2-4周。
四、术后观察、调护
1.手术后，用冰袋敷注射处2小时。
2.观察局部及全身的情况。
3.每天二口服维生素C(每次200mg，每天共400mg)，或者局部搽含有维生素C的面霜，约6个月。
4.术后3天内防曝晒及慎用刺激性化妆品。
五、疗效分析经过65例的病例分析，其中一次注射的病例有42例，两次注射的有15例，其中第一次与第二次注射之间的观察时间为6个月，结果病人感觉满意的58例(满意率为89.2％)，其皱纹、疤痕明显消失，皮肤基质状况得到改善。
其中有5例治疗者至今已观察三年，其皱纹、疤痕已完全消失。效果良好。
虽然通过实施例描绘了本发明，但本领域普通技术人员知道，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，就可使本发明有许多变形和变化，本发明的范围由所附的权利要求来限定。
权利要求
1.一种用于除皱祛疤的注射液的制备方法，其特征在于，包括A.从患者身上取下皮肤组织；B.将所取下的皮肤组织放入培养箱进行扩增培养；C.将扩增培养的成纤维细胞按每毫升900万个-980万个的比例加入标准注射液中，制成细胞悬浊液。
2.根据权利要求1所述的用于除皱祛疤的注射液的制备方法，其特征在于，所述步骤A进一步包括用5％的碘块消毒液在耳后或胳膊内侧消毒，然后用2％的利多卡因进行局部表面麻醉。用取皮器将3-4平方毫米的全层皮肤取下，放入组织保存液中，将创伤部位缝合，创口贴覆盖。
3.根据权利要求1所述的用于除皱祛疤的注射液的制备方法，其特征在于，所述步骤B进一步包括B1.将取得的组织块和组织液放入培养箱中消化10分钟；B2.去除表皮及真皮下的脂肪；B3.将组织块剪成若干块，并将所剪成的若干块组织以互相为0.5厘米的间隔放入六孔培养板中；B4.将六孔培养板小心放入孵箱，4小时之后沿培养箱的箱壁轻轻补加0.5毫升培养液，24天后再补加1毫升培养液；B5.对组织块进行传代培养4-6周。
4.根据权利要求1所述的用于除皱祛疤的注射液的制备方法，其特征在于，所述步骤B5进一步包括每隔2-3天换液一次，当细胞达到50％-70％汇集细胞后传代。
5.根据权利要求1所述的用于除皱祛疤的注射液的制备方法，其特征在于，所述步骤B3中所述若干小块的大小约为1-2平方毫米。
6.根据权利要求1所述的用于除皱祛疤的注射液的制备方法，所述步骤C中的所述标准注射液为浓度0.9％的生理盐水注射液。
7.根据权利要求1所述的用于除皱祛疤的注射液的制备方法，所述步骤C中所述标准注射液为浓度5％的葡萄糖注射液。
全文摘要
本发明公开了一种用于除皱祛疤的注射液的制备方法，包括从患者身上取下皮肤组织；将所取下的皮肤组织放入培养箱进行扩增培养；将扩增培养的成纤维细胞按每毫升900万个－980万个的比例加入标准注射液中，制成细胞悬浊液。所述步骤A进一步包括用5％的碘块消毒液在耳后或胳膊内侧消毒，然后用2％的利多卡因进行局部表面麻醉。用取皮器将3－4平方毫米的全层皮肤取下，放入组织保存液中，将创伤部位缝合，创口贴覆盖。本发明的制备方法采用组织培养法，取得了较高的成功率。
文档编号C12N5/08GK1768856SQ20041008880
公开日2006年5月10日 申请日期2004年11月4日 优先权日2004年11月4日
发明者邱立东 申请人:北京东南医疗美容医院