利用一种基于小珠的寡核苷酸检测法的信号扩增的制作方法

专利名称：利用一种基于小珠的寡核苷酸检测法的信号扩增的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、序列分析和基因表达分析领域。更具体地讲，本发明的领域涉及扩增来自基于小珠的寡核苷酸基因表达检测法的信号。
背景技术：
核酸序列检测的方法有多种应用，所述应用包括基因表达谱分析、多核苷酸的测序、基因突变的检测、基因型鉴定、物种鉴定和表型描述、特异化学药品(毒性的和/或治疗性的)暴露等。检测核酸序列的方法目前的缺点包括背景噪音、需要时间与劳动、缺乏特异性和缺乏灵敏度。一些检测方法利用聚合物阵列，例如利用核酸，它能被筛选用于特异性结合到诸如互补的核苷酸这样的靶上。基因表达研究近来通过微阵列的应用已经被加速了。通过一次检测几千个基因，微阵列已经导致了许多涉及特定生物化学过程的基因的发现。这些研究的下一步集中在利用阵列鉴定出的部分重要基因上。
McHugh等人(1988)的研究涉及包含能诱导人抗体的病毒抗原的微球体，所述人抗体通过使用生物素标记的抗人IgG，然后通过抗生物素蛋白链菌素-PE检测。
Lindmo等人(1990)的研究涉及一种利用两种类型颗粒的检测法，所述两种类型颗粒有相同的特异性，但对抗癌胚抗原抗原表位的生物素-抗生物素蛋白链菌素-藻红蛋白-共轭第二抗体的亲和力不同。
Spycher等人(1991)涉及微球体，所述微球体暴露于人血清，然后暴露于生物素标记的抗-C3d或抗-C4d单克隆抗体，和藻红蛋白-抗生物素蛋白链菌素，其中荧光通过流式细胞仪测量，并对应于沉淀的C3和C4的量。
Bhalgat等人(1998)的研究涉及带有两种不同的荧光团的其中一种的微球体，其中荧光团被结合到抗生物素蛋白链菌素上，用以选择用生物素标记的一抗标记好的细胞表面标记。
Dunbar等人(2003)描述了用以检测细菌病原体的LabMAP微球体，其中结合到特异性针对一种特定微生物的捕获抗体上的微球体，被用于处理包含微生物特异抗原的样品，然后用生物素标记的检测抗体和抗生物素蛋白链菌素-R-藻红蛋白处理所述微球体。
Yang等人(2001)和美国专利申请号2002/0034753涉及提供连接到捕获探针的微球体，所述捕获探针有与单链靶核酸序列的一个第一片段互补的序列；将底物与杂交到捕获探针的核酸样品接触，其中杂交上的靶核酸序列有至少一个第二片段保持单链状态；暴露此底物到用以补平靶核酸的至少一个第二片段的条件下，其中所述互补核酸包含能够增强互补核酸检测灵敏度的带有标记的核苷酸；并分析此标记以测定核酸样品中存在或不存在靶核酸。
美国专利6,203,989和美国专利申请号2001/0041335涉及在特异性结合检测法中用以扩增信号的方法和组合物，例如通过杂交一种靶核酸到一种核酸探针上，其中所述靶核酸包含一个结合配体，将此杂交后的靶核酸接触一个包含多个位点的受体，所述位点能结合此结合配体以将此受体与结合配体结合，将此受体与一种包含多个结合配体的试剂接触，以将此试剂与受体结合，并检测此结合态试剂的存在。在具体的实施方案中，

图1说明此核酸探针被固定在线性固体基质上。
发明概述本发明的一个目标是提供材料用于检测聚合物，尤其是核酸。本发明的一个特别的目标是提供方法和组合物，用以扩增在特异性结合检测法中检测核酸序列所使用的标记信号。本发明的一个进一步的目标是提供使核酸序列能被特异性地、迅速地、高灵敏度和高分辨率地检测的方法和组合物。
本发明涉及一种高通量的基因表达检测法，用以评估特定的基因表达情况。本发明提供了对现有基于小珠的检测法的几项改进，所述检测法在信号和基因调节方面与微阵列技术高度相关。这些改进除了最优化时间、温度和其它检测条件之外，至少还包括示例的利用生物素标记的抗抗生物素蛋白链菌素进行的抗生物素蛋白链菌素藻红蛋白扩增。使用这种方法，已经达到了下至1埃摩尔的检测水平，检测复杂cRNA样品中稀有的信使RNA分子，例如利用少至1.0μg的样品。与现有的微阵列技术相比，这种检测法具有增加的通量和减少的费用。在具体的实施方案中，这种扩增技术被应用到蛋白质和/或基因表达检测中，例如用总RNA进行的检测。
在具体的实施方案中，本发明利用基于例如市售的寡核苷酸杂交体系，如LuminexxMAP体系的检测法。这种体系是一种迅速的多元检测平台，它在96孔板中同时定量一个单独样品中的最多100个不同的分析物。此xMAP体系基于用不同比率的两种光谱不同的荧光染料进行内部染色的聚苯乙烯微球体，所述荧光染料提供100个不同成分的光谱阵列。使用此xMAP体系，本发明人使用小珠结合最优化选择的寡核苷酸，发展了一种对特定数目的不同目标基因特异性的表达谱检测法。这种检测法也将应用到如上所引的全套100个分析物。
在本发明的一个实施方案中，有一种扩增信号以检测寡核苷酸的方法，包括以下步骤(a)提供至少一个连接到至少一个预优化的寡核苷酸的微球体；(b)杂交标记的靶多核苷酸到所述寡核苷酸以形成一种寡核苷酸/靶多核苷酸复合物，其中所述复合物包含一种通过将受体结合到标记可检测的信号；和(c)提供一种针对所述受体的标记的配体，其中当所述配体结合所述受体时，信号被扩增。在具体的实施方案中，预优化的寡核苷酸用算法进行选择。
一种用以选择预优化的寡核苷酸的算法可以利用至少一种以下的选择标准(a)选择至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸，其中此被选择的至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸具有对标准基因表达值的可接受的相关性检验值；(b)选择至少一种完全匹配的和略错配的预优化的寡核苷酸对，其中在一对内，被选择的至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸减去错配的预优化的寡核苷酸具有对标准基因表达值的可接受的相关性检验值；(c)从不同的预优化的寡核苷酸对中选择至少一对预优化的寡核苷酸，其中在所述至少一对预优化的寡核苷酸中的预优化的寡核苷酸中的信号比率具有对标准信号比率的可接受的相关性；和(d)选择至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸，其中所述完全匹配的预优化寡核苷酸具有可接受的相对标准偏差。
在具体的实施方案中，预优化的寡核苷酸被进一步定义为通过以下步骤被选择提供一种包含至少一个靶多核苷酸的样品；使所述样品经受一种寡核苷酸阵列，其中所述靶多核苷酸与阵列中的至少一个寡核苷酸的杂交提供一种可检测的杂交指纹；并从所述指纹中鉴定至少一个最佳的寡核苷酸。预优化的寡核苷酸可以被进一步定义为通过以下步骤被选择提供一种包含多个靶多核苷酸的样品，所述靶多核苷酸定义为来自一个以上基因的RNA多核苷酸；使所述样品经受一种寡核苷酸阵列，其中一个以上不同的RNA多核苷酸与阵列中各自的寡核苷酸的杂交提供一种对一个以上基因来说可检测的杂交指纹；并从所述指纹中鉴定至少一个对所述一个以上基因来说最佳的寡核苷酸。在本发明的一个具体的实施方案中，鉴定步骤利用一种算法以鉴定寡核苷酸。
在本发明的其它具体实施方案中，所述算法鉴定与靶多核苷酸的至少一部分序列完全互补的寡核苷酸。靶多核苷酸可以被包含在多个RNA多核苷酸中，并且此多个多核苷酸的浓度可以是约1μg至约10μg。
在此外的具体实施方案中，所述配体包含一种抗体。并且，靶多核苷酸的标记和/或配体的标记可以包含荧光标记、酶标记和/或金标记。在一些实施方案中，靶多核苷酸的标记和配体的标记是基本上类似的或相同的。
在更多的具体实施方案中，微球体被包括在多个微球体中，而靶多核苷酸被包括在多个RNA多核苷酸中。所述多个RNA多核苷酸可以被包含在一份包含mRNA的样品中，并且此方法可以被进一步定义为用以提供mRNA表达谱信息的方法。在具体的实施方案中，所述多个微球体中的至少一个微球体包含与所述多个微球体中的另一个微球体所包含的寡核苷酸不同的寡核苷酸。所述多个微球体中的至少一个微球体可以包含一个以上不完全相同的预优化的寡核苷酸，所述寡核苷酸与相同RNA多核苷酸具有序列互补性。
在本发明的另一个实施方案中，涉及一种组合物，所述组合物包括多个微球体，每个微球体连接到至少一个预优化的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被杂交到一种标记的RNA多核苷酸上从而形成一种寡核苷酸/标记的RNA多核苷酸杂交复合物，并且其中所述复合物包含一种通过受体到标记的结合而可检测的信号，此信号通过结合标记的配体到受体而被扩增。所述多个微球体中的至少一个微球体可以包含与所述多个微球体中的另一个微球体所包含的寡核苷酸不同的寡核苷酸。并且，所述多个微球体中的至少一个微球体可以包含一个以上不完全相同的预优化的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自与相同RNA多核苷酸具有序列互补性。
在本发明的另一种实施方案中，涉及一种优化一种基于寡核苷酸杂交的检测法的方法，所述方法包括以下步骤提供一种包含至少一个靶多核苷酸的样品；使所述样品经受寡核苷酸阵列，其中所述靶多核苷酸与阵列中的至少一个寡核苷酸的杂交提供一种可检测的杂交指纹；从所述指纹中鉴定至少一个最佳的寡核苷酸，其中鉴定步骤利用一种被以下选择标准中至少一种所定义的算法(a)选择至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸，其中所述被选择的至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸具有对标准基因表达值的可接受的相关性检验值；(b)选择至少一种完全匹配的和略错配的预优化的寡核苷酸对，其中在一对内，所述被选择的至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸减去错配的预优化的寡核苷酸具有对标准基因表达值的可接受的相关性检验值；(c)从不同的预优化的寡核苷酸对中选择至少一对预优化的寡核苷酸，其中在所述至少一对预优化的寡核苷酸中的所述预优化的寡核苷酸中的信号比率具有对标准信号比率的可接受的相关性；和(d)选择至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸，其中所述完全匹配的预优化的寡核苷酸具有可接受的相对标准偏差；并使此最佳的寡核苷酸经受一种基于寡核苷酸杂交的检测法。
为了本发明接下来的发明详述能被更好地理解，前述内容已经相当广泛地概述了本发明的特征和技术优点。本发明另外的特征和优点将在下文中描述，它们构成了本发明的权利要求的主题。本领域的技术人员将能够意识到，本发明所公开的概念和具体的实施方案可以被容易地利用来作为修改或设计其它的构造以实现与本发明相同的目标的基础。本领域的技术人员也应当认识到，正如附加的权利要求中所阐明那样，这些等效的构造并没有超出本发明的精神和范围。据信为本发明所特有的新特征，包括关于它的组织和实施方法，以及进一步的目标和优点，将由下列说明得到更好的理解。
发明详述定义本文说明书中使用的“一个”可以指一个或多个。当与“包含”一词一起使用时，本文权利要求中使用的词“一个”可以指一个或多个。本文使用的“另一个”一词可以指另外的至少一个或多个。
本文所用术语“指纹”是指具体样品中的至少一个靶多核苷酸与一种或多种寡核苷酸探针的杂交的标记模式，所述探针例如固定的寡核苷酸探针。在一个具体的实施方案中，指纹提供多个不同的靶多核苷酸的至少一个杂交模式的信息，所述靶多核苷酸中的至少一些包含来自不同基因(或者它们的代表性的mRNA或cRNA)的序列。
本文所用术语“杂交”是指两种核酸之间的结合，例如通过碱基对氢键和碱基堆积形成的非共价相互作用。
本文所用术语“微球体”是指一种球形构造，例如一种一般的球形构造，它包含一种在该构造上和/或在该结构中的可检测的标记信号，例如通过至少一个可识别的标记。在具体的实施方案中，微球体包含至少一个寡核苷酸，例如连接到其上的寡核苷酸。在一个具体的实施方案中，微球体可以指一种小珠。在多个微球体中一个特定的微球体可以通过至少一个特征与另一个微球体分辨开来。例如，微球体可以基于至少一个标记被分辨，如在微球体上和/或在微球体中的比色的或荧光的标记；或者基于尺寸、电荷等等。
多核苷酸(包括寡核苷酸)在本发明中可以被利用。技术人员能认识到，本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的一种聚合形式，所述核苷酸或者是核糖核苷酸或者是脱氧核糖核苷酸，它们包含嘌呤和嘧啶碱基，或者其它天然的、经化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。多核苷酸的主链可以包含糖和磷酸基团(这些基团典型地存在于RNA或DNA)，或经修饰的或取代的糖或磷酸基团。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，并且在具体的实施方案中，所述多核苷酸被标记，例如通过在存在标记的核苷酸的条件下进行聚合反应而产生标记的多核苷酸。
本文中，“严谨性”涉及一种具体的杂交反应的条件，它影响核酸杂交的程度。杂交条件的严谨性能被选择以使核酸双链可以基于它们的互补程度而被选择。例如，高严谨性与形成包含错配碱基的双链的较低可能性相联系，因此，严谨性越高，具有相应的错配双链的两条单链核酸保持不杂交状态的可能性越高。通常，能增加严谨性并因此在杂交的分子间选择形成更高的互补程度的条件包括较高的温度、较低的离子强度和/或存在或缺乏溶剂。可供选择地，在严谨性较低时形成错配双链的可能性增加。较低的严谨性可通过较低的温度、较高的离子强度、和/或较低的或较高的溶剂浓度(例如降低的甲酰胺或二甲基亚砜的浓度)实现。杂交反应的持续时间和反应物(即单链核酸)的浓度也能影响严谨性，短的反应时间和低的反应物浓度能获得更高的严谨性。技术人员能认识到，合适的严谨性通常可由经验决定，所述合适的严谨性将允许选择产生完全匹配的双链，而不是包含一个或多个错配的双链。调节杂交反应严谨性的方法为本领域的技术人员所熟知。本领域发展的核酸杂交检测程序和条件可以被用于本发明，如在以下例子中所描述的程序和条件Maniatis等人，“Molecular CloningA Laboratory Manual”第二版，Cold SpringHarbor，N.Y.，1989；Berger和Kimmel，“MethodsinEnzymology，”第152卷，“Guide to Molecular CloningTechniques”，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.，1987；Young和Davis，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，801194(1983)。
本文所用术语“靶多核苷酸”是指被测试其杂交到本发明所述微球体上的一个或多个固定的寡核苷酸的能力的至少一个多核苷酸。在一个具体的实施方案中，靶多核苷酸被标记，例如用生物素。靶多核苷酸可以在5’末端和/或3’末端被标记，和/或在一个或多个内部核苷酸上被标记。在其它具体的实施方案中，靶多核苷酸被包含在多个多核苷酸中，这些多核苷酸可以是其它的具有不同序列的靶多核苷酸。靶多核苷酸可以是任何种类的核酸，但是在具体的实施方案中它是RNA多核苷酸。在进一步具体的实施方案中，它是mRNA或cRNA多核苷酸。在其它的实施方案中，所述靶多核苷酸被包含在一份样品中。
本发明本文公开的方法和组合物可以被用于涉及检测靶多核苷酸与寡核苷酸探针的杂交以及因此产生的信号的扩增的多种应用。在一个实施方案中，一个或多个包含不同靶序列的靶多核苷酸被筛选用于与固定的寡核苷酸探针的高密度阵列杂交，所述寡核苷酸探针包含不同的序列，并且扩增了的信号被检测到。
提供了方法和化合物，所述方法和化合物在利用特异性结合检测法对至少一个靶分子的检测中用于信号扩增。虽然本文详细的提供了示例性的寡核苷酸和RNA多核苷酸，本文公开的方法和化合物也可以被用于检测其它分子的结合，例如多肽。
在一个实施方案中，提供了检测靶核酸的方法，其中所述方法包括将优选标记的靶核酸(例如RNA多核苷酸)杂交到包含在微球体上的固定的寡核苷酸上，其中所述靶多核苷酸包含能被识别和/或否则被受体结合的标记。将杂交的靶核酸与受体接触，所述受体可包含多个能够结合靶多核苷酸上的标记的位点，并且将所述受体与配体接触，所述配体可包含对多个受体的结合能力。然后配体与其受体的结合物和需要的杂交的靶核酸的存在可以被检测到，例如，通过检测在至少其中一个受体和配体上的可检测的标记。在优选的实施方案中，在将配体与结合了杂交的靶核酸的受体相结合之后，配体与标记的受体分子接触，并且此与配体结合的标记的受体分子被检测到。这令可检测的信号可被增强并更容易被检测到。
此外，提供了本发明涉及的组合物，其中所述组合物包括一种包含至少一个标记的靶多核苷酸、一种受体和一种可包含至少一个标记的配体。在一个实施方案中，配体是所述受体的一种抗体，并且此受体是抗生物素蛋白链菌素或抗生物素蛋白。
在另一个实施方案中，提供了一种微球体，它包含至少一个固定在其上的、杂交到一种标记的靶多核苷酸的寡核苷酸探针，其中靶多核苷酸上的标记与至少一个受体相结合，在一些实施方案中所述受体包含多个能够结合所述标记的位点，并且其中受体与至少一个配体相结合，所述配体被标记并产生一种扩增了的信号。
在一个实施方案中，靶多核苷酸与一种寡核苷酸探针的杂交在包含一种缓冲液的杂交溶液中进行。
在具体的实施方案中，本发明提供杂交的小珠荧光信号的扩增，所述扩增通过一种受体，例如抗生物素蛋白链菌素，优选的具有一种标记如藻红蛋白，与生物素标记的山羊IgG/抗抗生物素蛋白链菌素抗体的共同使用而实现。在具体的实施方案中，此扩增利用特定的试剂和孵育条件。这些条件可以包括一种摇动检测板，在约45℃以52rad/s(500rpm)孵育过夜；检测的杂交/洗涤步骤使用0.5X TMAC缓冲液；和/或在每孔使用的混合物(在这里也指多个小珠)中有总计约1000个小珠。在具体的实施方案中，本发明可利用约500个微球体(一个分析物，其中术语“分析物”指被分析的基因转录产物)至最多约100,000个微球体(100个分析物)。通过结合使用抗生物素蛋白链菌素藻红蛋白和生物素标记的山羊IgG/抗抗生物素蛋白链菌素抗体进行的杂交小珠荧光信号的扩增，可以在0.5X TMAC缓冲体系或1X MES缓冲体系中进行。
通过本发明的出现提供了特别的优点。例如，本发明从基因组表达微阵列检测结果中复制数据，通过对数量经过选择的转录产物进行分析，所述检测结果有利于检测法在预言方面的能力。即，本发明包括提供了一种与基因组表达微阵列数据最一致的检测法的实施方案。在具体的实施方案中，一种检测多种基因的微阵列检测法可提供关于目标基因的信息。在所述的鉴定之外，本发明的检测法还提供一种更加集中的检测法以检测这些目标基因中特定的一部分。
本发明提高了对基因，甚至是那些低丰度基因的检测的灵敏度。例如，在具体的实施方案中仅需提供小量的cRNA，例如甚至低至约1.0μg的量。此外，利用公开的缓冲体系，本发明提供低百分比的小珠集合物和每孔中小珠持续的高数量。另一个优点涉及用于寡核苷酸的选择和用于检测数据的分析所用改进方法的统计学方法。
在其它的具体实施方案中涉及一种用于选择最佳的一种或多种寡核苷酸的算法，所述算法基于一种现有的寡核苷酸选择检测法。在具体的实施方案中，所述寡核苷酸选择检测法是市售的，例如Affymetrix GeneChip检测法。在具体的实施方案中，每次检测中分析物的数量为约1至约100个。
技术人员认识到本发明的参数的变化完全处于本发明的范围之内。此外，技术人员知道怎样调节这些参数以最优化结果。例如，检测法中杂交步骤的持续时间可以是最小约3小时，但是可以持续至少约18小时。同样地，检测法中杂交步骤的温度可以是约45℃至48℃，但是视所需的结果而定的其它的温度也可以是合适的。需提供的多核苷酸的量可以少至以多核苷酸复杂混合物形式提供的1μg至10μg，所述多核苷酸复杂混合物例如总RNA、mRNA或cRNA。
在本发明的一个具体的实施方案中，使用流式细胞仪检测扩增的信号，但是其它检测扩增信号的方法也是合适的并属于本发明的范围。BioPlex和Luminex 100分析仪将小珠从板孔中转移到并通过流式细胞仪，所述小珠在流式细胞仪中被一种双激光体系鉴定并读取。第一激光通过激发小珠内的荧光团鉴定被分析物，而第二激光测量结合到小珠上所连结的多核苷酸上的检测对象的量。这通过激发杂交到小珠上的检测对象上的藻红蛋白标记实现。检测的动态范围得到扩展，允许多元平台中的低丰度和高丰度转录产物的定量。应用此检测法的推荐体积的范围为约65μL至125μL，此范围是制造商提供的指导范围。
以下描述提供关于本发明的实施方案的示例性的细节，尽管技术人员会认识到，本发明的新特点可以被改变并在改变后依然在本发明的范围内。
寡核苷酸的选择在一个具体的实施方案中，固定的寡核苷酸探针可以用非随机的方法进行选择，这种方法也被称为非任意的方法。寡核苷酸可以是预优化的，这是指在本发明的检测步骤之前使寡核苷酸先经受一个检测步骤，以测定它对本发明的检测法的适用性和/或缩窄本发明的检测法所利用的寡核苷酸的范围，以达到效率和/或经济的目的。例如，一个或多个寡核苷酸可以经受一种基于杂交的检测，其中包含多个多核苷酸的样品被提供给所述一个或多个寡核苷酸，并根据对杂交情况的检测，测定在给定参数下(例如一种具体的一个或多个基因序列)哪种或哪些寡核苷酸提供了最好的信号。在具体的实施方案中，所述参数下的杂交信号被称为杂交指纹。从这种杂交指纹中可以测定哪种或哪些寡核苷酸最适用于本文所述的本发明的检测法。在具体的实施方案中，这种测定包括算法的使用。
在一个具体的实施方案中，算法包括三个主要的部分。这些部分用于选择基因的探针，所述基因包括经过试验条件发生改变的基因、经过试验条件保持不变的基因(例如“管家基因”)或用于评估试验质量的基因如GAPDH(3’末端)或GAPDH(中间)。
在一个具体的实施方案中，本发明利用来自以前的微阵列研究的算法结果，包括基因表达值(信号值)以及试验中来自所有微阵列的单个寡核苷酸探针水平强度。典型的研究将有一个或多个变化的条件，例如剂量水平、化学活性试剂、暴露时间等等。一个或多个这种研究提供数据，基于这些数据进行探针选择。
对于经过变化的条件发生改变的基因，选择基于在基因表达值和探针水平强度之间的相关性的检验值。对每个探针来说，在减去错配强度和不减去错配强度情况下的检验值都被计算。同样对每对探针、每三个探针、和每四个探针进行计算，因为将一个以上的探针(与或不与它的相应的错配探针一起)包括在内，可能导致更好的相关性。在对一对、三个、和四个探针进行计算时，检测探针序列以测定重叠的量。例如，最好的三个探针可能比最好的一对探针稍好，并且所述三个探针由所述一对探针外加一个重叠探针组成。在这种情况下，所述重叠探针的加入可能不带来显著的额外好处。
对于利用经过试验条件不发生改变的基因的实施方案，一个目标是最小化获得信噪比的可变性的测量值。具体地讲，相对标准偏差(RSD)被使用，它被表示为标准偏差对平均值的比率。对每个完全匹配(PM)探针，相对标准偏差使用每个探针的探针水平强度进行计算，对每对“完全匹配-错配”(PM-MM)探针对，相对标准偏差使用完全匹配和错配(MM)探针水平强度的差异进行计算。选择有最低RSD的探针。
对于利用用于评估试验质量的基因的实施方案，一个质量的检测标准是3′/5′比率，所述比率从针对GAPDH(3’末端)的探针组和针对GAPDH(5’末端)的探针组算出。这个比率在一个微阵列与下一个微阵列之间可能不同。计算每对探针p1和p2的所述比率，其中p1选自针对GAPDH(3’末端)的探针组而p2选自针对GAPDH(5’末端)的探针组。
因此，在一个具体的实施方案中，本发明中利用的算法具有以下选择标准中的至少一个(a)选择具有信号值的最高相关性检验值的PM探针(这涉及检查相关性图以确保相关性检验值不受异常值的影响；(b)选择PM和MM探针对，其缩放的(或未缩放的)PM-MM探针水平值具有信号值的最高的相关性测量值；(c)选择探针对(从两个不同的探针组)，其比率与信号比率最相关；和/或(d)选择具有最小可变性测量值(具体地讲，相对标准偏差)的PM探针。
所述算法可以利用以下选择标准中的至少一种(a)选择至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸，其中此被选择的至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸具有对标准基因表达值的可接受的相关性检验值；(b)选择至少一种完全匹配的和略错配的预优化的寡核苷酸对，其中在一对内，被选择的至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸减去错配的预优化的寡核苷酸具有对标准基因表达值的可接受的相关性检验值；(c)从不同的预优化的寡核苷酸对中选择至少一对预优化的寡核苷酸，其中在所述至少一对预优化的寡核苷酸中的所述预优化的寡核苷酸中的信号比率，具有对标准信号比率的可接受的相关性；和(d)选择至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸，其中此完全匹配的预优化的寡核苷酸具有可接受的相对标准偏差。
关于术语“可接受的相关性水平”，本领域的技术人员会认识到优选地使用最高水平的相关性，但是其它基本上类似的相关性值在本发明中也适用。技术人员会认识到检验相关性有不同的方法，包括Pearson’s r、Spearman秩相关与多种参数的、非参数的和粗程序的可选方法。技术人员知道，术语“参数的”是指基于估计一个模型中的一种具体的相关性参数；术语“非参数的”是指基于秩或排列的方法；术语“粗程序的”是指对异常数据灵敏度较低的方法。
本文所用术语“标准基因表达值”是指获取自至少一个以前的微阵列输出结果的值。此术语应用到所有种类的平台和检测法，但是在具体的实施方案中，它是一种AffymetrixGeneChip微阵列检测法的标准信号值(也称为平均差值)。
本文所用术语“标准信号比率”是指来自各个寡核苷酸对的信号比率的加权和。
配体配体可以是任何包含识别和/或结合受体能力的化学物质。优选地，扩增活性包括多个能够结合受体的配体。在靶多核苷酸中和/或在靶多核苷酸末端的标记，所述靶多核苷酸例如示例性的RNA多核苷酸，也能够结合受体，例如经由非共价的特异性结合相互作用。
在一个实施方案中，配体可以包括一种抗体。本文使用的术语“抗体”是指一种免疫球蛋白分子或其具有特异性结合特定抗原的能力的片段。抗体可以是一种对所述检测法中使用的受体具有特异性的抗受体抗体。因此，此抗体能够特异性地结合作为抗原的受体。抗体和它们的制造方法为免疫学领域所熟知。抗体可以被生产，例如，通过杂交瘤细胞系、通过免疫引起多克隆抗体反应、和/或通过已经被编码抗体的重组DNA表达载体转化的重组宿主细胞。抗体包括但不限于任何同种型的免疫球蛋白分子(IgA、IgG、IgE、IgD、IgM)，和/或包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Facb、Fv、ScFv、Fd、VH和VL的活性片段。抗体包括但不限于单链抗体、嵌合抗体、突变型、融合蛋白、人源化抗体和/或任何其它经修饰的免疫球蛋白分子的构型，该免疫球蛋白分子包含一个具有所需特异性的抗原识别位点。
配体优选地包含至少一个标记和在一些实施方案中包含多个标记。优选地，所述标记被共价地连接到配体。例如，在一个实施方案中，标记包含生物素，受体是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素，而配体是一种抗抗生物素蛋白链菌素抗体。在一个具体的实施方案中，例如，多个生物素分子，例如约3至10个生物素分子，被共价结合到抗体上。
抗体，包括抗体片段和其它经修饰的形式，其制备被描述于，例如“Immunochemistry in Practice，”Johnstone和Thorpe，Eds.，Blackwell Science，Cambridge，Mass.，1996；“AntibodyEngineering，”第2版，C.Borrebaeck，Ed.，Oxford UniversityPress，New York，1995；“Immunoassay”，E.P.Diamandis和T.K.Christopoulos，Eds.，Academic Press，Inc.，San Diego，1996；“Handbook of Experimental Immunology，”Herzenberg等人，Eds，Blackwell Science，Cambridge，Mass.，1996；和“Current Protocolsin Molecular Biology”F.M.Ausubel等人，Eds.，Greene Pub.Associates和Wiley Interscience，1987，它们的公开内容均引入此文，以供参考。同样，多种抗体可商购获得。
利用抗体进行的扩增在一个实施方案中，提供了一种用于检测靶多核苷酸与一种寡核苷酸探针之间的杂交的方法，所述靶多核苷酸例如一种RNA多核苷酸，所述寡核苷酸探针例如一种连接到微球体的寡核苷酸。所述寡核苷酸优选固定在微球体的表面。在一个实施方案中，标记优选地通过共价连接被结合到靶多核苷酸上。
在一种检测法中，固定的寡核苷酸依次接触，例如，包含至少一个标记的靶多核苷酸、包含一个或多个能够结合所述标记的位点的受体和一个抗受体抗体，所述抗受体抗体包含一个或多个优选地共价连接到此抗体的标记。如果寡核苷酸探针已经杂交到靶多核苷酸，那么就形成了一个包含靶多核苷酸、受体和抗体的至少一个标记的复合物。所得的复合物被检测，例如通过提供和检测抗体上的一个可检测的标记，或通过使复合态的抗体接触并检测带标记的可检测受体分子，此受体分子能够结合到抗体上的至少一个标记分子。对标记的检测由此提供了一种靶核酸与探针杂交的阳性指示剂，并且通过这些方法得到扩增。
在一个实施方案中，标记和受体分别是生物素和抗生物素蛋白链菌素。在这个实施方案中，提供了一种测定靶多核苷酸与固定的寡核苷酸探针杂交的方法。提供了标记的靶多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括使固定的寡核苷酸探针接连接触，例如以下物质一种示例性的生物素标记的靶多核苷酸；示例性的抗生物素蛋白链菌素；一种示例性的包含多个生物素的生物素标记的抗抗生物素蛋白链菌素抗体；和标记的抗生物素蛋白链菌素分子。抗生物素蛋白链菌素被可检测的标记物标记，所述标记物例如荧光标记物。在这个实施方案中，靶多核苷酸与探针通过杂交的结合可以被高灵敏度地检测到。在寡核苷酸探针和靶多核苷酸杂交时，靶仅包括一个或一些抗生物素蛋白链菌素能结合的生物素部分。在一些实施方案中，在抗生物素蛋白链菌素与生物素标记的靶多核苷酸结合时，生物素分子的数量被极大的扩增。在同一实施方案中，在标记的抗生物素蛋白链菌素结合到抗体上的生物素时，可检测的标记的数量被极大地扩增，从而极大地增强了检测法的灵敏度。
标记及其检测在一个具体的实施方案中，提供的标记存在于本文所述发明的一个组分上，或和该组分一起被提供。技术人员会认识到，标记可以是可检测的，或者可供选择地作为另一个组分的结合对象，所述另一个组分例如受体，所述标记也可以不被检测，例如不被直接地检测。在一个实施方案中，靶多核苷酸如RNA多核苷酸的标记是生物素，受体是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素。例如在其中的配体是一种抗体的实施方案中，生物素可以被共价结合到抗体上。例如，抗体可以是一种包含多个共价结合到所述抗体的生物素分子的抗抗生物素蛋白链菌素抗体。在一个检测中，在抗体结合到与生物素标记的靶多核苷酸结合的抗生物素蛋白链菌素受体上之后，抗体可以接触标记的抗生物素蛋白链菌素，从而将多个标记的抗生物素蛋白链菌素分子结合到抗体上，并且与抗体结合的标记的抗生物素蛋白链菌素分子因此能被检测到，这样即在此检测中实现了信号扩增。
标记可以在配体、受体和/或靶多核苷酸上被提供。标记的实施例包括荧光标记、化学发光标记和无机标记如金标记，以及酶标记。
标记可以被称为可检测的，例如通过显色检测、化学发光检测和荧光检测。示例性的标记包括标记酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳醣苷酶或辣根过氧化物酶，它们用显色底物检测。例如，碱性磷酸酶可以使用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐或硝基氮蓝四唑盐进行检测。
在一个优选的实施方案中，抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素可以与荧光标记结合，例如在具体的实施方案中的藻红蛋白。在一个实施方案中，可用的可检测的抗生物素蛋白链菌素是抗生物素蛋白链菌素藻红蛋白，它是市售的，例如可购自Molecular Probes(Eugene，Oreg.)。生物素标记的抗抗生物素蛋白链菌素抗体可购自，例如VectorLaboratories(Burlingame，Calif.)。
抗生物素蛋白-生物素体系已经被发展用于多种检测分析法。生物素体系中的核酸检测和标记的方法被描述在，例如，“NonradioactiveLabeling and Detection Systems”，C.Kessler，Ed.，Springer-Verlag，New York，1992，第70至99页；和在“Methods inNonradioactive Detection，”，G.Howard，Ed.，Appleton和Lange，Norwalk，Conn.1993，第11至27页和137至150页。
荧光标记如藻红蛋白、荧光黄、罗丹明、试卤灵和它们的衍生物，以及香豆素如羟基香豆素，可以被用在本发明中。此外，荧光共振能量转移可以被测量，这描述在Cardullo，Nonradiative FluorescenceResonance Energy Transfer在“Nonradioactive Labeling andDetection of Biomolecules”，C.Kessler，Ed.，Springer-Verlag，New York，1992，第414至423页，其公开内容均引入此文，以供参考。可供选择地，无机标记可以被用于本发明，例如胶体金颗粒或铁蛋白。胶体金颗粒用作标记被描述在，例如Van de Plas和Leunissen，Colloidal Gold as a Marker in Molecular BiologyThe Use ofUltra-Small Gold Particles，在“Nonradioactive Labeling andDetection of Biomolecules”，C.Kessler，Ed.，Springer-Verlag，New York，1992，第116至126页，其公开内容均引入此文，以供参考。
用荧光标记标记抗生物素蛋白链菌素或抗生物素蛋白的试剂是市售的。例如，示例性的试剂5(6)-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺酯(FLUOS)、7-氨基-4-甲基-香豆素-3-乙酸-N′-羟基琥珀酰亚胺酯(AMCA，活化的)和异硫氰酸荧光素(FITC)是市售的，可购自BoehringerMannheim，Indianapolis，Ind。用荧光标记物对蛋白进行荧光标记的方法和检测荧光标记的方法被描述在Howard，G.，Labeling Proteinswith Fluorochromes，在“Methods in NonradioactiveDetection，”，G.Howard，Ed.，Appleton和Lange，Norwalk，Conn.1993，第39至68页，其公开内容均引入此文，以供参考。此外，有多种市售的标记的抗生物素蛋白链菌素和抗生物素蛋白分子。非限制性实施例包括抗生物素蛋白链菌素-金、抗生物素蛋白链菌素-荧光染料、抗生物素蛋白链菌素-AMCA、抗生物素蛋白链菌素-荧光黄、抗生物素蛋白链菌素-藻红蛋白(SAPE)、抗生物素蛋白链菌素-磺酰罗丹明101、抗生物素蛋白-FITC和抗生物素蛋白-Texas red，它们可购自BoehringerMannheim，Indianapolis，Ind.。
本领域将标记连接到多核苷酸的可用的方法是已知的。在一个实施方案中，具有共价连接的标记的核酸可以使用DNA合成仪和标准的亚磷酰胺试剂进行合成。例如，可以使用用于直接标记合成的寡核苷酸的生物素亚磷酰胺。生物素亚磷酰胺可购自Glen Research Corporation，Sterling，Va。
在一个实施方案中，在标记是生物素的情况下，生物素标记的靶DNA可以使用切口平移和随机引物延伸进行制备，而生物素标记的靶RNA可以通过利用RNA聚合酶进行的体外转录进行合成。生物素标记的脱氧核苷三磷酸和核苷三磷酸已经被用于生物素标记的DNA和生物素标记的RNA的酶促制备。示例性的方法被详细公开在Rashtchian和Mackey，Labeling and Detection of Nucleic Acids，在“NonradioactiveLabeling and Detection of Biomolecules”，C.Kessler，Ed.，Springer-Verlag，New York，1992，第70至84页。生物素分子的浓度可以通过使用补骨脂素生物素试剂来提高，如在Levenson等人，Methods Enzymol.，184577-583(1990)；和Cimono等人，Ann.Rev.Biochem.541151-1193(1985)中所述，上述每份文献的公开内容均引入此文，以供参考。背景杂交可以通过对生物素标记的靶核酸进行HPLC纯化得到减少。
标记例如生物素，可以使用本领域可用的方法被连接到配体，例如聚合物，包括抗体上。示例性的方法被详细公开在Bayer和Wilchek，Labeling and Detection of proteins and Glycoproteins，在“Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules”，C.Kessler，Ed.，Springer-Verlag，New York，1992，第91至100页及其所引用的参考文献，所述文献及其参考文献的公开内容均引入此文，以供参考。此外，生物素化抗体如生物素化抗抗生物素蛋白链菌素分子是市售的，例如可购自Vector Laboratories(Burlingame，Calif.)。
标记受体对本文所用短语“标记-受体对”是指一种标记和受体，它们是能互相够识别并互相结合的化学成分。所述标记和受体可以是能够互相识别并互相结合形成复合物的任何成分。在一些实施方案中，标记和受体可以经由第三种中间物质的结合而互相作用。典型地，构成标记-受体对的标记和受体是彼此经受特异性非共价结合相互作用的结合分子。标记和受体可以是天然存在的或人工生产的，并且任选地可以与其它种类集合。
优选地，标记-受体对包括一个受体，它能够结合多个，例如，2、3、4或更多个此种标记分子。在一个优选的实施方案中，标记-受体对分别是生物素-抗生物素蛋白，或者分别是生物素-抗生物素蛋白链菌素。维生素生物素通过结合从蛋清中分离的指示蛋白抗生物素蛋白或从链霉菌(Streptomyces avidinii)中分离的抗生物素蛋白链菌素而得到检测。抗生物素蛋白和抗生物素蛋白链菌素有四个生物素高亲和力结合位点，结合常数为约K＝1015mol-1。Kessler，Overview of NonradioactiveLabeling Systems在“Nonradioactive Labeling and Detection ofBiomolecules”，C.Kessler，Ed.，Springer-Verlag，New York，1992，第27至34页，其公开内容均引入此文以供参考。
本文公开的检测方法使用的配体能被连接到本领域中可用的多个标记-受体结合对中任何一个。在一个优选的实施方案中，在核酸杂交检测中使用一种能够杂交到靶多核苷酸的固定的寡核苷酸，靶多核苷酸包含一种构成一个标记-受体结合对中的一个部分的标记。此外，配体可以包含多个标记。优选地，标记-受体对的受体能够结合一个以上的标记分子。例如，标记可以是生物素，受体可以是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素，它们中的每个能够结合四个生物素分子。靶多核苷酸与寡核苷酸探针的杂交可以通过检测靶多核苷酸的标记与受体的结合、进一步通过检测受体与配体的结合和进一步通过检测结合到配体的标记的受体的结合，而得到检测。配体通过，例如提供所述配体上的一种标记，或将多个标记的受体分子与此配体结合而得到检测。
杂交技术人员认识到两种每个都有至少一个单链区域的核酸互相杂交的能力取决于多个方面，包括两个分子的单链区域间的互补程度和杂交反应条件的严谨性。在一个具体的实施方案中，杂交是在一种固定的寡核苷酸探针和一种输入的靶多核苷酸之间，所述靶多核苷酸例如一种RNA多核苷酸如mRNA。在具体的实施方案中，杂交条件是在固定的寡核苷酸的整个序列和靶多核苷酸的至少一部分之间完全互补这种情况下的杂交条件。
本领域中进行核酸杂交检测的方法已经得到很好的发展。杂交检测程序和条件将随应用发生变化，并依照本领域已知的常规结合方法进行选择。
在一些实施方案中，本发明利用特定的缓冲液和缓冲浓度。在一个具体的实施方案中，由1X TMAC制得的0.5X TMAC，被用于悬浮样品多核苷酸和/或用作杂交缓冲液。技术人员认识到1X TMAC包含3M TMAC、0.1％十二烷基肌氨酸钠、50mM Tris-HCl pH8.0和4mM EDTApH 8.0。
对一些要求高选择性的应用来说，典型地希望使用相对高严谨性的条件来形成杂交产物。例如，相对低的盐和/或相对高的温度条件，例如约0.02M至约0.10M的NaCl，在约50℃至约70℃的温度下提供的条件。这种高严谨性条件即使允许寡核苷酸探针和靶多核苷酸之间的错配，也只能允许极少数的错配出现。通常认为通过增加甲酰胺的量能提供更加严谨的条件。
对一些应用来说，低严谨性条件是优选的。在这些条件下，即使杂交链的序列不完全匹配，杂交也可以发生，但是在一个或多个位点存在错配。通过增加盐浓度和/或降低温度可导致条件的严谨性较低。例如，中等严谨性条件可以通过约0.1至0.25M NaCl，在约37℃至约55℃温度下获得，而低严谨性条件可以通过约0.15M至约0.9M盐，在约20℃至约55℃温度下获得。杂交条件可根据所需的结果容易地进行操纵，并且技术人员知道怎样进行这种操纵。
在其它的实施方案中，杂交在以下条件下完成，例如50mM Tris-HCl(pH 8.3)，75mM KCl，3mM MgCl2，1.0mM二硫苏糖醇，温度约20℃至约37℃。其它利用的杂交条件包括约10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mMKCl，1.5mM MgCl2，温度为约40℃至约72℃。
其它本领域常用的核酸杂交缓冲液包括磷酸和TRIS缓冲液，例如约pH6至约pH8的所述缓冲液。在一个实施方案中，使用了一种标准乙二胺四乙酸磷酸盐(“SSPE”)缓冲液。一种示例性的磷酸缓冲液包括0.06M H2PO4/HPO4、1M Na+、0.006M EDTA(乙二胺四乙酸)、0.005％Triton，pH约为6.8，本文称之为“6XSSPE-T”。
在本发明的一些实施方案中，提供了一种用于进行核酸杂交检测的方法，其中杂交液包含一种磺酸缓冲液。磺酸杂交缓冲液包括2-[N-吗啉]乙磺酸(“MES”)和3-[N-吗啉]丙磺酸)(“MOPS”)。在一个实施方案中，使用磺酸缓冲液的杂交检测可以使用固定在固体表面如微球体上的核酸探针来进行。在核酸探针固定之前，固体表面可以被，例如，硅烷涂层涂敷。在包含磺酸缓冲液的溶液中进行的杂交检测可以在以下条件下进行，例如温度约25℃至70℃，例如至少约35℃，或45℃或更高，并且经过一段时间，例如约10分钟至约5小时或更长时间，例如约16小时或更长。磺酸缓冲液可以被用于例如基因表达杂交检测和其它的杂交检测。
例如，杂交缓冲液可以包括约0.01M至约2M的MES或更高，例如，约0.25M的MES，在例如约6至7的pH值下。在一个实施方案中，MES缓冲液包括0.25M MES、1M Na+和0.005％TritonX-100，在约5.5至6.7的pH值下，例如6.7。杂交可以在约25℃至70℃、例如约45℃下进行。任选地，缓冲液可以在使用前被过滤，例如通过2μm的过滤器。核酸杂交缓冲液可以进一步包括表面活性剂，例如Tween-20和Triton-X100，以及添加剂如消泡剂。
试剂盒在本发明的一个实施方案中，提供了用于扩增来自基于小珠的寡核苷酸杂交检测的信号的试剂盒，所述试剂盒可包括在合适的包装中的至少一种以下物质微球体、分开的和/或在微球体上的固定的寡核苷酸探针、受体、标记和配体，其中配体可以以包含着标记的形式提供。检测标记或检测标记的扩增的试剂也可以被包括在试剂盒中。试剂可以是，例如，在试剂盒中的分开的容器中。试剂盒还可以包括杂交缓冲液、洗涤液、阴性和阳性对照物以及实施检测的书面说明。
实施例以下的实施例用以说明本发明优选的实施方案。本领域的技术人员应该意识到下列实施例中公开的技术代表了本发明者发明的技术，在本发明的实际应用中功用良好，因此可考虑用以建立其实际应用的优选模式。然而，本领域的技术人员应该意识到，按照本公开内容，在不背离本发明的精神和范围的条件下，在公开的具体实施方案中可以进行很多改变，并仍能获得相同或相似的结果。
实施例1示例性的检测规程本实施例提供一种示例性的检测规程，其中包含多核苷酸的微球体被用于一种包含cRNA多核苷酸的样品，在一种寡核苷酸和一种靶多核苷酸之间进行杂交孵育，并且用受体处理此复合物，然后用配体处理受体，然后用标记处理配体。
技术人员能认识到，在本文所述的方法的特定步骤中使用了缓冲液。例如，缓冲液可以被用于悬浮多个靶多核苷酸如RNA多核苷酸。尽管技术人员知道，用于孵育、杂交等的条件可以根据操作过程的需求而加以改变，下文将描述示例性的可用的检测条件。
1.小珠装置的稀释(一种小珠质量控制规程可以被用于测定连接后小珠的浓度。例如，一个小珠被连接到至少一个寡核苷酸上，并以系列稀释度进行本检测以测定连接到小珠上的寡核苷酸的优选的量。进行多重的第二次检测以测定与代表其它待分析物的小珠进行交叉杂交的可能性。)a)使用0.5X TMAC，缓冲液体积取决于所处理的样品的量和小珠的数量；b)标准小珠浓度是107小珠每ml；c)每孔中加入40μl稀释的小珠混合物(约1000个小珠每孔)；
用以下方法在1C中得到800μL体积的小珠混合物每2μL小珠稀释5倍再加上790μL 0.5X TMAC杂交(Hyb)缓冲液；或每2μL小珠稀释20倍再加上760μL 0.5X TMAC杂交缓冲液。
2.靶cRNA计算(注意cRNA是浓度为0.5μg/μL的片段)a)用包含M13oligo的0.5X TMAC的杂交缓冲液进行稀释；b)测定允许多少样品，包括空白；c)每个孔中加入20μL cRNA(2μg)；M13 oligo在2×106稀释液(M13储备液＝1mM)中稀释2μL的1mM溶液加998μL TE＝2μM；2μL的2μM溶液加198μL TE＝20nM；2.5μL的20nM溶液加入397.5μL TE＝125pM的工作液。
对重复孔，靶cRNA计算如下对5μg cRNA每孔，使用25μL储备cRNA(0.5μg/μL)和25μL0.5X TMAC杂交缓冲液，它包含100阿托摩尔(amol)的M13(15μLM13工作液加235μL 0.5X TMAC杂交缓冲液)。对2.5μg cRNA每孔，使用12.5μL储备cRNA(0.5μg/μL)和37.5μL 0.5X TMAC杂交缓冲液，它包含100amol的M13(10μL M13工作液加入240μL 0.5X TMAC杂交缓冲液)。对2.0μg cRNA每孔，使用10μL储备cRNA(0.5μg/μL)和40μL 0.5X TMAC杂交缓冲液，它包含100amol的M13(8μL M13工作液加入242μL 0.5X TMAC杂交缓冲液)。
3.试剂a)1X TMAC＝3M TMAC，0.1％十二烷基肌氨酸钠，50mM Tris-HClpH8.0，4mM EDTA pH8.0，其中0.5X TMAC＝由1X TMAC配制；b)PBS-BSA洗涤缓冲液＝9.7mL PBS+330μL 30％BSA；和c)结合液体积的测定，以对StreptAv每个样品200μL，对抗体每个样品100μL为基础。
StreptAv-PE GoatIgGAnti-StAv储备浓度1mg/mL储备浓度10mg/mL储备浓度0.5mg/mL终浓度20μg/mL终浓度100μg/mL终浓度5μg/mL4.杂交1.依照上述步骤2加入20μL稀释的探针；
2.依照上述步骤1加入40μL小珠混合物到每孔；3.95℃下孵育2分钟；4.转移板到恒温搅拌器，上盖并在45℃，52rad/s(500rpm)下杂交过夜；5.用离心机在2250g下离心样品2分钟，轻弹并移去溶液；6.用100μL的0.5X TMAC洗涤小珠；25℃，52rad/s(500rpm)下摇动2分钟；7.在离心机2250g下离心样品2分钟，轻弹并移去溶液；8.用100μL的PBS-BSA洗涤小珠；25℃，52rad/s(500rpm)下摇动2分钟；9.用离心机在2250g下离心样品2分钟，轻弹并移去溶液；10.加100μL的抗生物素蛋白链菌素-PE(StAv-PE)结合混合物；25℃，52rad/s(500rpm)下摇动10分钟；11.用离心机在2250g下离心样品2分钟，轻弹并移去溶液；12.用100μL的PBS-BSA洗涤小珠；25℃，52rad/s(500rpm)下摇动2分钟；13.用离心机在2250g下离心样品2分钟，轻弹并移去溶液；14.加100μL的第二结合物(anti-StAv和nGtIgG)；25℃，52rad/s(500rpm)下摇动10分钟；15.用离心机在2250g下离心样品2分钟，轻弹并移去溶液；16.用100μL的PBS-BSA洗涤小珠；25℃，52rad/s(500rpm)下摇动2分钟；17.用离心机在2250g下离心样品2分钟，轻弹并移去溶液；18.加入100μL的第三结合物(StAv-PE)；25℃，52rad/s(500rpm)下摇动10分钟；19.用离心机在2250g下离心样品2分钟，轻弹并移去溶液；20.用100μL的PBS-BSA洗涤小珠；25℃，52rad/s(500rpm)下摇动10分钟；21.用离心机在2250g下离心样品2分钟，轻弹并移去溶液；22.用65μL PBS-BSA再悬浮，并在Bioplex上读数并且
23.在bioplex上运行之前充分摇动板。
实施例2寡核苷酸检测中的信号的扩增来自基于杂交的寡核苷酸检测的信号的扩增依照本文所述进行。表1图示说明了一种对在不同杂交时间下的特定的cRNA序列(和对照物M13)和对不同样品参数(其中低、中和高指来自一种生物样品的分别的雌二醇水平)的滴定检测。倍数变化的计算基于样品输出对载体输出的比率。与本领域已知的方法相比，本发明提供至少约100倍的信号扩增。
表1对特定寡核苷酸的滴定检测<p>利用T7和SP6引物对pGKETO2克隆的测序，确证了仅在73、114和119三个密码子中各有一个碱基与发表的X86782序列不同的序列。这些核苷酸置换可以在独立的扩增实验中重复，因此代表所用雨生红球藻192.80菌株中的核苷酸序列。
该克隆被用于雨生红球藻酮酶的表达。如实施例3所述进行大肠杆菌菌株的转化、培养和类胡萝卜素谱的分析。
表1比较了细菌产生的类胡萝卜素量表1比较使用两种不同酮酶---念珠藻属PCC7120NOST酮酶(实施例1)和雨生红球藻酮酶(实施例4)---的细菌酮类胡萝卜素合成。类胡萝卜素的量以ng/ml培养液表示。
实施例5扩增编码点形念珠藻ATCC 29133来源的NP196酮酶完整一级序列的DNA通过PCR方法，从点形念珠藻ATCC 29133(美国典型培养物保藏中心菌株)扩增编码点形念珠藻ATCC 29133 NP196酮酶的DNA。
为了从点形念珠藻ATCC 29133悬浮培养物中制备基因组DNA，离心收集细胞，在液氮中冷冻，并在研钵中碾磨成粉，所述悬浮培养物在25℃、连续光照及恒定振荡(150rpm)下于BG 11培养基(1.5g/l NaNO3、0.04g/lK2PO4×3H2O、0.075g/l MgSO4×H2O、0.036g/l CaCl2×2H2O、0.006g/l柠檬酸、0.006g/l柠檬酸铁铵、0.001g/l EDTA二钠镁、0.04g/l Na2CO3、1ml痕量金属混合物A5+Co(2.86g/l H3BO3、1.81g/l MnCl2×4H2O、0.222g/lZnSO4×7H2O、0.39g/l NaMoO4×2H2O、0.079g/l CuSO4×5H2O、0.0494g/1Co(NO3)2×6H2O))中生长1周。
表6I型糖尿病纵向分析各簇表示来自I型糖尿病的单一个体的纵向尿沉积物样品
参考文献本说明书中提及的所有专利和公布指示了本发明相关的本领域的技术人员的水平。所有专利和公布均以相同的程度引入本文以供参考，就如同每个公布均被特别地和个别地指出以引入本文以供参考一样。
因此，所有引用文献的相关部分均引入本文以供参考；任何文献的引用不可解释为是对其作为本发明的现有技术的认可。
专利美国专利6,203,989美国专利申请2001/0041335美国专利申请2002/0034753出版物Bhalgat，M.K.，Haugland，R.P.，Pollack，J.S.，Swan，S.，Haugland，R.P.“Green-and red-fluorescent nanospheres for thedetection of cell surface receptors by flow cytometry”，J.Immunolog.Methods 21957-68，1998Dunbar，S.A.，Zee，C.A.V.，Oliver，K.G.，Karem，K.L.，Jacobsen，J.W.“Quantitative，multiplexed detection ofbacterial pathogensDNA and protein applications of the LuminexLabMAPTMsystem”，J.Microbiolog.Meth.53245-252，2003Lindmo，T.，Bormer，O.，Ugelstad，J.，和Nustad，K.“Immunometric assay by flow cytometry using mixtures of twoparticle types of different affinity”，J.Immunolog.Methods126183-189，1990McHugh，T.M.，Miner，R.C.，Logan，L.H.，和Stites，D.P.“Simultaneous Detection of Antibodies to Cytomegalovirus andHerpes Simplex Virus by using flow cytometry and a microsphere-based fluorescence immunoassay”，J.Clin.Microbiol.26(1)1957-1961，1988Spycher，M.O.，Spycher-Burger，M.，Spath，P.J.，和Burckhardt，J.J.“Human serum induced opsonization ofimmunoglobin G-coated polystyrene microspheres with complementcomponents C3 and C4 as measured by flow cytometry”，J.Immunolog.Methods 14583-92，1991Yang，L.，Tran，D.K.，Wang，X.“BADGE，BeadsArray for theDetection ofGeneExpression，a High-Throughput DiagnosticBioassay”，Genome Research 111888-1898，2001虽然本发明和它的优点已得到详细的描述，但应当理解的是，如附加的权利要求书中所阐释的那样，在不背离本发明定义的精神和范围的情况下，可以进行各种更改、取代和修正。此外，本发明应用的范围并不规定受限于本说明书中描述的具体实施方案的过程、机器、制造、组合物、手段、方法和步骤。作为本领域的普通技术人员，从本发明的公开内容将容易地了解到，现有的或以后将被发展的、与本文所述的相应的实施方案实现现本质上相同的功能或达到本质上相同的结果的过程、机械、制造、组合物、手段、方法或步骤，可以依照本发明得到利用。因此，有意识地在附加的权利要求书中包括属于它们范围内的这些过程、机器、制造、组合物、手段、方法或步骤。
尽管已用具体实施方案来说明和描述了本发明，但对于本领域的那些技术人员显而易见的是，在不背离本发明的精神和范围的情况下可作出许多其它的变化和修改。因此，有意识地在附加的权利要求书中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
权利要求
1.一种扩增用于检测多核苷酸的信号的方法，特征在于所述方法包括以下步骤(a)提供至少一种连接到至少一种预优化的寡核苷酸的微球体；(b)杂交标记的靶多核苷酸到所述寡核苷酸以形成寡核苷酸/靶多核苷酸复合物，其中所述复合物包含通过受体与所述标记的结合可检测的信号；和(c)为所述受体提供标记的配体，其中当所述配体结合所述受体时，所述信号被扩增。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述预优化的寡核苷酸用一种算法进行选择。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述算法利用以下选择标准中的至少一种(a)选择至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸，其中所述被选择的至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸具有对标准基因表达值的可接受的相关性检验值；(b)选择至少一种完全匹配的和略错配的预优化的寡核苷酸对，其中在一对内，所述被选择的至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸减去所述错配的预优化的寡核苷酸具有对标准基因表达值的可接受的相关性检验值；(c)从不同的预优化的寡核苷酸中选择至少一对预优化的寡核苷酸，其中在所述至少一对预优化的寡核苷酸中的预优化的寡核苷酸中的信号比率具有对标准信号比率的可接受的相关性；和(d)选择至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸，其中所述完全匹配的预优化的寡核苷酸具有可接受的相对标准偏差。
4.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述预优化的寡核苷酸被进一步定义为通过以下步骤被选择提供特征在于包含至少一种靶多核苷酸的样品；使所述样品经受寡核苷酸阵列，其中杂交所述靶多核苷酸到所述阵列中的至少一个寡核苷酸上提供可检测的杂交指纹；和从所述指纹中鉴定至少一种最佳的寡核苷酸。
5.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述预优化的寡核苷酸被进一步定义为通过以下步骤被选择提供特征在于包含多个靶多核苷酸的样品，所述靶多核苷酸定义为来自一个以上基因的RNA多核苷酸；使所述样品经受寡核苷酸阵列，其中杂交一个以上不同RNA多核苷酸到所述阵列中的各自的寡核苷酸上提供一个以上基因的可检测的杂交指纹；和从所述指纹中鉴定至少一种对于所述一个以上基因最佳的寡核苷酸。
6.如权利要求4或5中任一项所述的方法，其中所述鉴定步骤利用一种算法来鉴定所述寡核苷酸。
7.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述算法鉴定与所述靶多核苷酸的至少一部分具有完全互补性的寡核苷酸。
8.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述靶多核苷酸被包含在多个RNA多核苷酸中，并且所述多个多核苷酸的浓度为1μg至10μg。
9.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述配体包含抗体。
10.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述靶多核苷酸的标记和/或所述配体的标记选自荧光标记、酶标记、化学标记、金标记以及它们的混合物。
11.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述靶多核苷酸的标记和所述配体的标记完全相同。
12.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述微球体被包括在多个微球体中，并且所述靶多核苷酸被包括在多个RNA多核苷酸中。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述多个RNA多核苷酸被包含在包含mRNA的样品中，所述方法被进一步定义为一种用以提供mRNA表达谱信息的方法。
14.如权利要求12所述的方法，其中在所述多个微球体中的所述至少一个微球体包含与所述多个微球体中的另一个微球体包含的寡核苷酸不同的寡核苷酸。
15.如权利要求12所述的方法，其中在所述多个微球体中的至少一个微球体包含一个以上不完全相同的预优化的寡核苷酸，所述寡核苷酸与相同RNA多核苷酸具有序列互补性。
16.一种组合物，特征在于该组合物包含多个微球体，每个微球体连接到至少一个预优化的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被杂交到标记的RNA多核苷酸上，形成寡核苷酸/标记的RNA多核苷酸杂交复合物，并且其中所述复合物通过受体与所述标记的结合包含可检测的信号，所述信号通过所述受体的标记的配体的结合而被扩增。
17.如权利要求16所述的组合物，其中在所述多个微球体中的至少一个微球体包含与所述多个微球体中的另一个微球体包含的寡核苷酸不同的寡核苷酸。
18.如权利要求16或17中任一项所述的组合物，其中在所述多个微球体中的至少一个微球体包含一个以上不完全相同的预优化的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自与相同RNA多核苷酸具有序列互补性。
19.一种最优化基于寡核苷酸杂交的检测法的方法，特征在于所述方法包括以下步骤提供包含至少一种靶多核苷酸的样品；使所述样品经受寡核苷酸阵列，其中杂交所述靶多核苷酸到所述阵列中的至少一种寡核苷酸上提供可检测的杂交指纹；从所述指纹中鉴定至少一种最佳的寡核苷酸，其中所述鉴定步骤利用被以下选择标准中至少一种所定义的算法(a)选择至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸，其中所述被选择的至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸具有对标准基因表达值的可接受的相关性检验值；(b)选择至少一种完全匹配的和略错配的预优化的寡核苷酸对，其中在一对内，所述被选择的至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸减去所述错配的预优化的寡核苷酸具有对标准基因表达值的可接受的相关性检验值；(c)从不同的预优化的寡核苷酸中选择至少一对预优化的寡核苷酸，其中在所述至少一对预优化的寡核苷酸中的预优化的寡核苷酸中的信号比率具有对标准信号比率的可接受的相关性；和(d)选择至少一种完全匹配的预优化的寡核苷酸，其中所述完全匹配的预优化的寡核苷酸具有可接受的相对标准偏差；和使所述最佳的寡核苷酸经受基于寡核苷酸杂交的检测法。
全文摘要
本发明涉及来自基于杂交的寡核苷酸检测法的信号的扩增。在一些实施方案中，小珠包含一种来自样品的杂交到标记的多核苷酸上的寡核苷酸，并且由其复合物产生的信号通过作用于所述标记的受体的标记的抗体而被扩增。在具体的实施方案中，所述检测法提供基因表达的信息。
文档编号C12Q1/68GK1863926SQ200480028811
公开日2006年11月15日 申请日期2004年10月20日 优先权日2003年10月24日
发明者S·M·托罗塔里, M·L·杰普, K·D·尤林, B·D·里查德森, J·P·蒂耶曼, J·M·纳吉夫 申请人:宝洁公司