病毒诊断方法及其使用的池的制作方法

专利名称：病毒诊断方法及其使用的池的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种适于病毒诊断方法中使用的单个扁平底部型的池
(single flat-based well)。更具体地说，该池具有与弯曲的底部相对的平 面或扁平的底部。本发明还涉及采用这种单个池的病毒诊断方法。在该方 法的一个实施方案中，采用了添加有激素和酶的专门研制的组织培养基。
背景技术：
用于鉴别病毒的常规诊断过程包括下述步骤将所选的对某种病毒易 感的特定细胞系接种于容器，然后将假定含有病毒的生物样品接种于该细 胞培养物。此类生物样品除了包括其它物质外，还包括唾液、尿、排泄物、 脑脊液(CSF)、呼吸液和诸如来自嘴、鼻腔、咽喉、皮肤和生殖器的化 验样本。随后对接种的细胞培养物进行培养并考察所述细胞经由病毒^"发 的细胞病变效应。由于某些病毒仅生长于某些细胞，因此可以病毒i秀发细 胞病变效应(CPE)或未诱发细胞病变效应的细胞类型为基础对病毒进行 鉴别。
对于此过程具有大量备选的实验方案，其包括下述步骤使已接种有 病毒制品的细胞经受胰蛋白酶作用(trypsonisation)以便除去该细胞，随 后使用对源自病毒的多肽具有特异性的单克隆抗体来检测病毒，所述源自 病毒的多肽使用报道分子，比如荧光素(FITC)分子进行标记。另外的 备选方案包括在培养管内的盖玻片以便促进细胞的恢复。
常规的(或传统的鼓法)方法使用了接种有适当细胞系的螺旋盖管 (screw cap tubes)。在细胞达到约80%的融合率后，将该管接种适当的样本 并监控CPE长达三周。第一周须每天监控CPE。第二周和第三周必须减 少监控频率。通常，需要盲传来促进病毒的恢复。
由于需要每天对管进行监控，因此常规管法的一个不利之处在于费时 费力。通常，为了避免主观性，两名人员通过光学显微镜对相同管的CPE
进行检查。此外，并不是所有病毒均能引起可见的CPE,而且并不是所有 的病毒都能通过该方法来检测。而且，在常规的管法中监控到的CPE信 息高度依赖于细胞系的易感性以及病毒产生可见CPE的能力。样本的毒 性还可能不利地产生类似于病毒CPE的变化，从而得出错误的结杲。此 外，某些病毒只有在很长的时间周期后才产生CPE(例如细胞巨化病毒 (CMV))。由于通过常规管法获得的结果主要是基于CPE检测并且不 能按惯例通过任何其他的方法进行确证，因此可能出现不准确的诊断。常 规管法的另一个局限性在于每个样本很难使用2个或3个以上的管，这可 归因于其导致的管堆积。例如，仅在第一周，40个样本每天就会产生500 个管。
快速培养法(shell vial method )是目前本领域4支术人员用于病毒恢复 的最先进的方法。该方法使用具有半透明盖子的、直径为16 mm的5 ml 塑料瓶(快速培养瓶)。适当的处理之后，将圆形的(13mm)盖玻片插 入该瓶。将易感的细胞系接种于瓶中，所述细胞系在盖玻片上单层生长。 当细胞单层达到约80-90%的融合率时，弃去培养基并将所述单层和瓶^妄 种上患者的样本。随后，监控培养瓶的CPE，之后除去盖玻片。然后将盖 玻片固定于显微镜的载玻片并使用单克隆抗体染色。
快速培养法的优势在于接种后可以通过对瓶进行离心来促进病毒的 恢复，快速培养法可将获得结果所需的时间长度缩短至2-3天。此外，使 用快速培养法无需等待可见的CPE。可以在第二或第三天除去盖玻片并使 用适当的单克隆抗体进行染色且使用抗体抗原染色来确证结果。
但是，快速培养法也有一些局限性。由于盖玻片需要下述的特殊处理 因此快速培养法是耗时的比如使用清洁剂和丙酮多次洗涤后用蒸馏水洗 涤并灭菌。还必须人工将盖玻片插入瓶中。此外，需要进行荧光免疫染色 时，该过程甚至变得更复杂和耗时。而且必须弃去快速培养瓶中的培养基 并使用特殊的镊子人工除去盖玻片、空气干燥并固定于显微镜的载玻片 (使用真空油脂)。由于操作的疏忽，或者无意地翻转并将颠倒的单层固
定于显微镜的载玻片有可能使盖玻片破裂，因此盖玻片的去除是令人厌烦 的。如果接种的细胞也生长在盖玻片底部上，由此造成盖玻片固定于所述 瓶并使得盖玻片难以去除的话，那么可能会引起另 一个不利因素
(complication)。事实上，与常规管法一样，使用快速培养法不可能每 个样本使用2个或3个以上的管，这可归因于管堆积(即，每周40个样 本每天会产生500个快速培养瓶)。此外，为了覆盖13 mm的圆形盖玻 片，荧光免疫染色需要大量的单克隆抗体。
96孔板法是仅在受限制的情况下用于恢复生长于相同细胞系的病毒 的另 一种方法。例如，该池接种LLC-MK2细胞系时，副流感病毒还有流 感病毒的恢复是可能的。96孔板法具有多种优势，因为用特定的样本进 行被接种细胞系的接种时操作相对容易。此外，可以在同一板上接种大量 的样本并且经由离心的促进作用也是可能的。而且，96孔板法仅需要少 量的培养基(为0.3 ml,而不是快速培养法中使用的1-1.5 ml);可以使 用抗原抗体技术确证结果并且该方法还能够容易地"读出"所监控的CPE。
然而，96孔板法也有其不利之处。其必须将整个板用于抗原抗体才全 测，这通常很难实现以及必须在同一天使用整个板，甚至当样本的数目小 于整块板所需的样本数目时也必须使用整个板。这就意味着每天必须使用 一套新的不同的板。这就不利地导致了下述情况即检测一经完成，在结 果错误或者延长接种期后就无剩余的细胞可以用于重复所述过程。而且， 每块板通常只可使用 一种或两种不同的细胞系并且需将相同类型的样本 接种于板上。
如澳大利亚创新专利第2001100242号中所描述的单孔法(Single well methodology)緩解了与以上描述的常规方法相关的问题，并且提供了一 种用于进行病毒诊断的备选的、有效和经济的方法。该专利的全部公开内 容在此完整引入作为参考。
当扁平底部型池用于诊断测定的场合时，已知其具有某种优势。特别 地，所述扁平底部型池与所述圆形或弯曲型池相比提供了更为精确的分 析。但是，简单的扁平底部型池也具有不利之处，其中在该池的底部趋向 于形成弯液面(meniscus)，从而使接触该池底部的溶液呈不均匀地分布。
鉴于此，发明人研究了一种解决这种问题的如下所述的扁平底部型池。

发明内容
因此，本发明的第一个方面提供了在测定中使用的扁平底部型池
(flat-based well)，所述池包括:
主室，所述主室具有容纳液体样品的开口 ，侧壁从所述开口和室底部 延伸；和
副室，所述副室由所述主室的所述室底部延伸，并适于容纳预定量的 液体样品，其中所述副室具有扁平(flat)的底部。
这种布置方式有利地确保了放置在所述副室中的液体样品不会从所 述主室的侧壁形成向上的弯液面。相反，放置在所述副室中的液体样品可 以保持由所述副室朝着所述主室延伸的凸起表面和/或保持由所述副室延
伸入所述主室的凸起表面。这种布置方式还确保存留任何液体样品的底面 均为扁平型，从而提供如先前在上文中描述的更为精确的分析。
在本发明的另 一个实施方案中提供了池单元，其包括一个或多个依据 本发明的单个扁平底部型池。
在本发明的又一实施方案中，提供了一种进行测定的方法，所述方法 包括使用依据本发明的单个扁平底部型池或使用依据本发明的池单元。本发明的又一方面提供一种检测病毒的方法，所述方法包括下述步
骤
提供接种有预先选择的细胞系的如此处所描述的一个或多个依据本 发明的单个扁平底部型的池；
将待分析的样本接种于一个或多个池；以及
在所述一个或多个池中对一种或多种预先选^^的病毒进行检验。
在本发明另外的实施方案中，提供了一种检测病毒的方法，所述方法 包括下述步骤
提供接种有适用于接种病毒的细胞系的如此处所描述的依据本发明
的单个扁平底部型的池；
对样本进行特异性预处理以便获得可能含有待;险测病毒的样品；
用所述样品接种所述细胞系； 培养接种的细胞系；
将所述接种的细胞系的样品培养基替换为病毒恢复培养基，所述病毒 恢复培养基包括添加有至少一种激素和至少一种酶的细胞培养基；
培养所述接种的细胞系；以及 分析所述接种的细胞系中存在的病毒。
在本发明的又一实施方案中，提供了依据本发明的单个扁平底部型池 或池单元在一全测中的用途。
测方法中的用途，所述方法包括下述步骤
提供接种有预先选择的细胞系的如此处所描述的一个或多个依据本 发明的单个扁平底部型的池；
将待分析的样本接种于一个或多个池；以及 在所述一个或多个池中对一种或多种预先选_^的病毒进行检验。
在本发明的又一实施方案中，提供了依据本发明的单个扁平底部型池 在病毒检测方法中的用途，所述方法包括下述步骤
提供接种有适用于接种病毒的细胞系的如此处所描述的依据本发明 的单个扁平底部型的池；
对样本进行特异性预处理以便获得可能含有待;险测病毒的样品；
用所述样品接种所述细胞系；
培养接种的细胞系；
将样品培养基替换为病毒恢复培养基，所述病毒恢复培养基包括添加 有至少一种激素和至少一种酶的细胞培养基；
培养所述接种的细胞系；并
分析所述接种的细胞系中存在的病毒。 附图简述在非限制性附图中示出本发明的实施方案，其中

图1是阐释了池的透视图的图示；图2是阐释了池的部分侧视图的图示；图3是阐释了池的仰视图的图示；以及图4是典型的12x8排列的池构型的图示。发明详述主室和副室可以采用任何适宜的形式，只要所述副室由所述主室的室 底部延伸。单个扁平底部型的池可以采用任何适宜的形式，只要容纳样本 的池的底部为扁平型(flat)。例如，该池可以具有圆形、方形、三角形或六 角形的横截面。此外，该池沿着其高度的横截面可以是一致的。可选地， 该池可以是朝向其顶端或其底端的锥形。应理解的是该池是使用标准的材 料(如用于常规的微量滴定托盘装置(micro titre tray assemblies )的材料) 和通过标准的技术形成的。优选地，所述主室具有正方形的横截面并且所述副室具有圆形的横截 面。在此实施方案中，所述副室的圆形侧面(circular side )的弧优选地延 伸至所述主室每一个侧面(side)的边缘。这可根据更好地示出此特征的 附图进行理解。通常，所述副室可以容纳总量约为30 pi的预定体积，以使所述副室 中的液体样品形成液滴(droplet),所述液滴有利地具有,人所述副室的开口 延伸的凸起表面；并且进一步使贯穿副室的液体的深度基本上不变，从而 消除所述液体样品放置在池中并沿该池的侧壁形成向上的弯液面的不利 之处。优选地，所述主室与所述副室的高度比为10:1，而所述主室与所述副
室的宽度比在2:1和1:1之间。在优选的实施方案中，所述池的高度为11 mm，其中包括10 mm高的主室和1 mm深的副室。所述池的宽度通常为 8mm，并且具有约为lmm的壁厚度，而所述副室的内部宽度约为6 mm。 因此，所述主室通常允许容纳约360 pl的体积而所述副室通常允许容纳约 28.3 (il的体积。假设将该池用于池单元，则这种特定的实施方案可以同等地^是供多种 优势，其中将许多池连接在一起并且不单独使用。因此，根据本发明的备 选实施方案提供了包括一个以上的依据本发明的池的池单元。例如，池单 元可以是96或48孔板构型或者是澳大利亚创新专利第2001100242号中 所描述的单元。应为本领域技术人员理解的是，在需要将池插入板中的 一些测定方法 的场合中，该池可以设置有促进该池与其有待插入的孔板接合的装置。例 如，该池可以为如上所述的锥形，以便在孔板的贮槽(receptacle)中提供 摩擦配合。可选地，该池可以设置有与其待插入的板的!i!i槽配套使用的肋 (rib)或凹痕(indentation)或凹才曹(groove)。在某些例子中，所述池在分析期间或搬运板的过程中可能从孔板脱 落。同样地，在优选的实施方案中，该池包括某种形式的标识，比如彩色 的编码或标记。例如，该池可以具有指明其在斧反上位置(栏和排)的标记。为了有助于分析，该池还可以包括设置有标记刻度的扁平底部。例如，(crosshair)。因此，对四个部分之一的分析可以^是供对于整个扁平底部 分析有用的数据。应理解的是将扁平底部分成任何数目可适用于此目的。本发明的池具有相当广泛的用途。泛泛地说，本发明的池可用于测定。 本领域技术人员应理解此类纟全测包括，但不限于酶联免疫吸附测定 (ELISA)、细菌细胞培养、PCR扩增技术、蛋白结晶技术、抗病毒易感 性测试和化学物质及药物筛选技术。例如在一个实施方案中，本发明的池 可用于病毒诊断测定。如此处所用，对测定的参考应理解为对任何使用微量滴定池的常规实 验技术的参考。
因此，本发明的第二个方面提供了一种检测病毒的方法，所述方法包括下述步骤4是供接种有预先选择的细胞系的如此处所描述的一个或多个依据本 发明的单个扁平底部型的池；将4寺分析的样本接种于一个或多个池；并在所述一个或多个池中对一种或多种预先选择的病毒进行检- 验。在本发明的一个实施方案中，提供了一种施行测定的方法，所述方法 使用如此处所描述的一个或多个依据本发明的单个扁平底部型池。该测定 优选地为病毒诊断测定。在本发明的又一实施方案中，提供了一种检测病毒的方法，所述方法 包括下述步骤提供接种有适用于接种病毒的细胞系的如此处所描述的依据本发明的单个扁平底部型池；对样本进行特异性预处理以便获得可能含有待检测病毒的样品；将所述样品接种于所述细胞系；培养接种的细胞系；将所述接种的细胞系的样品培养基替换为病毒恢复培养基，所述病毒 恢复培养基包括添加有至少 一种激素和至少 一种酶的细胞培养基；培养所述接种的细胞系；并分析所述接种的细胞系中存在的病毒。应理解的是，样品培养基在此方法中通常为已接种有样品的维持培养 基(maintenance media)。如此处所用，术语"单个扁平底部型的池"包括在其范围内的、具有 任何4黄截面形状的单个池，只要容纳样本的池的底部是扁平的。在本发明上下文的病毒诊断方面，单个扁平底部型池的使用经由采用 标准技术(比如倒置荧光显微镜法或光学显微镜法)确保了病毒的检验， 并提供了与检验如位于具有圆形或稍;微弯曲底部的池底部中的样品相比
更为精确的结果。可以提供已经接种有预先选择的细胞系的单个扁平底部型池，所述预 先选择的细胞系将根据特定病毒或待分析病毒对于生长和分离的适应性而进行测定。例如，LLC-MK2细胞系适用于副流感病毒的检测，MDCK 可用于流感病毒，HEP-2适用于呼吸道合胞病毒(RSV)以及MRC-5适 用于细胞巨化病毒(CMV)、单纯疱渗病毒(HSV)、肠道病毒和鼻病 毒的检测。本领域技术人员可以选择适合给定病毒生长和分离的细胞系。应承认的是此处描述的接种的单个扁平底部型池可以适合在所选才奪 的测定中以即刻使用的形式提供(即，随时使用的形式)。本领域冲支术人 员应理解的是，在随时使用的形式中，预先选择的细胞系通常具有约 80-卯％的融合率。还应理解的是，这样预先选择的细胞系的保存稳定性 将取决于所提供的特定细胞系。胞。例如，-f旦不限于以任何方式进4于的细胞冷冻过程，所述细胞可以在单贮存培养基。在此步骤之后，细胞可以经受冷却过程并最终于-70-80°C 贮存。贮存培养基可以含有或者可以不含冷冻保护剂。可加入贮存培养基 的冷冻保护剂不受特殊限制且可以包括DMSO和/或血清。本领域4支术人 员应该熟悉适宜的冷冻保护剂及其用途。并不是所有的细胞系都可以经过 冷冻过程存活下来而且本领域4支术人员应了解哪种细胞系适用于和不适 用于此目的。应认识到以冷冻形式提供的细胞系随后应经受适当的解冻过程并且 将贮存培养基替换为病毒恢复培养基。本领域技术人员应理解的是细胞一 经解冻，随后在如此处所述的本发明的方法中使用之前，通常生长至 80-卯％的融合率。对接受试验的"接种"有细胞系的扁平底部型池的参考应理解为对于在供病毒诊断测定使用之前预先接种有预先选^r的细胞系的池的参考。可选地，接种的池实际上可以在供病毒诊断测定使用后再进行接种。池的接 种步骤可以包括下述子步骤将稀释的预先选择的细胞系沉积在池中的生 长培养基上，在C02培养箱中培养细胞直至细胞达到约80-90%的融合率 并将生长培养基替换为维持培养基。应理解的是，将直接用于特定病毒生长和分离的多个池进行比较时， 每个池中的培养基的体积应该是相同的。在某些实施方案中，将多个池接种有预先选择的细胞系以便提供多孔 排列，例如用于96孔板的常规12x8排列，或者用于48孔板的6x8排列。 可选地，如果期望更大的排列，可以提供诸如14x8的排列。所提供的池 的数目不受特殊限制。应理解的是如果提供了这样的排列，则通常再次才艮 据待检测的病毒而将不同的细胞接种于该排列的不同的栏。密封件以使其能够进行运输并防止污染和蒸发。例如，在多个池的情况下， 该密封件可以呈盖子的形式，其安装在多个池的全部排列的上方，如标准 的48或96孔板盖子。可选地，在单个扁平底部型池的情况下，该密封件 可以采用适合密封单个池的盖子的形式。在另外的备选情况下，该密封件 可以为适宜的密封膜。还应理解的是，如此处所描述的不管是用于多个池的盖子或者是用于 依据本发明的单个扁平底部型池的盖子均可包括有助于使用的标记。例 如，所述盖子可以包括表示其中含有的细胞系的符号或字母。将待分析的样本接种于 一种或多种细胞的步骤依据已知的过程而进 行。例如，该步骤通常包括从有待接种的每个池中除去适当量的维持培养 基，并使通常约为200-300 pl量的样本上清液沉积入每个池中。然后将该 池进行离心/培养，例如根据所使用的离心机类型在35。C下以4000 rpm离 心50-60分钟。由离心机取下后，可以通过例如真空吸引术从池中除去接种物并替换 为适宜的维持培养基或病毒恢复培养基。所述病毒恢复培养基优选包括添 加有激素和酶的细胞培养基。如此处所用，术语"待分析的样本，，包括从受试者获得的样品样本，
所述样品样本可能受到病毒感染或未受到病毒感染。因此，样品可以含有可检测的病毒或者无病毒。适宜的样品可以由下述物质获得唾液、血清、 尿、排泄物、脑脊液(CSF)、呼吸液，如支气管肺泡灌洗液与鼻咽吸出 物、和诸如来自嘴、鼻腔、咽喉、皮肤和生殖器的化验样本。可以通过使 用与细胞系和病毒相容的适宜介质进行稀释来制备使用的样品样本。受试者可以是任何可受病毒感染的动物物种。例如，受试者可以是禽 类、鱼或哺乳动物。在某些实施方案中，受试者为哺乳动物。适宜的哺乳 动物包括养殖动物，如绵羊、牛、猪、鹿等等；伴侣动物，如狗、猫、兔、 豚鼠等等；实验动物，如小鼠、大鼠、猴等等；圈养动物，如动物园和人 类圈养的动物。优选的哺乳动物为人类。在其他的实施方案中，受试者可 以是禽类，特别是养殖的禽类，如鸡和火鸡。获得适用于病毒检测的样品于声波降解法和离心法。如此处所用，术语"病毒恢复培养基(virus recovery medium)，，或 "病毒恢复培养基(vims recovery media)，，指用于病毒生长和分离的培 养基(medium)或培养基(media)。发明人已发现配有激素和酶的细胞 培养基可通过下述情况有利地优化(optimises)病毒恢复将细胞系保持 在最大的敏感性以及帮助病毒连接于细胞壁且在某种情况下，缩短获得结 果所需的时间。酶。在某些实施方案中，术语"酶"指蛋白水解酶。在这些实施方案中， 酶优选丝氨酸或天冬氨酸蛋白酶。示例性的酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶或 胃蛋白酶。在优选的实施方案中，酶为胰蛋白酶。加至细胞培养基的激素并无限制并且本领域:技术人员可以确定合适 的激素。在某些实施方案中，术语"激素"指皮质类固醇，优选糖皮质激 素。更优选地，激素选自地塞米松、氢化可的+>、醋酸可的松、泼尼*>、 氲化泼尼松、甲基氢化泼尼松、倍他米松、氟羟泼尼松龙、倍氯米+>、醋 酸氟氢可的+>、醋酸脱氧皮质酮(DOCA)和醛固酮。在优选的实施方案 中，激素为地塞米松。激素可以是合成的或者是天然形成的。 虽然激素和酶的组合是最优选的实施方案，但是可选地，发现DMSO (二曱基亚砜)和DEAE (右旋糖普)也是有用的。加至培养基的酶的量优选在1-5 !ig/ml范围内，并且优选约2.5 fig/ml。 培养基中激素的浓度优选在10"M-1(^M范围内并且优选约10-SM。但是， 在优选地塞米松和胰蛋白酶的情况下，发现添加有约2.5 lig/ml胰蛋白酶 和浓度约为1(T5M的地塞米松的细胞培养基得到了最佳结果。因此，本发明特定实施方案的方法采用了包括细胞培养基的病毒恢复 培养基，所述细胞培养基添加有2.5吗/ml的胰蛋白酶和浓度为10-5]\4的 地塞米松。可以依据本发明使用的细胞培养基无特殊的限制。例如，这些细胞培 养基可以包括培养基199、 DMEM、 RPMI-1640或MEM-EAGLE。然而， 如同易于公认的，存在大量可以有助于细胞生长和本领域技术人员可以容 易获得的不同的培养基。但是，根据优选的实施方案，细胞培养基为 MEM-EAGLE。细胞培养基可以添加支持细胞和病毒生长的添加剂，并且此类添加剂 为本领域技术人员已知。已知特定的细胞系和/或病毒可能需要用于最佳 生长和发育的特异性添加剂。示例性的添加剂包括L-谷氨酸、氨基酸、 抗生素、血清、Hanks平衡盐、如D-葡萄糖的糖类、无机盐、维生素、苯 基红、如HEPES的緩沖液以及如Tween 80的表面活性剂。以上描述的病毒恢复培养基可以在用于鉴别病毒的常规诊断过程中 使用，所述常规诊断的例子如常规的管法和快速培养法。可选地，病毒恢 复培养基可以在此处描述的本发明的方法中使用。在本发明的方法中使用的病毒恢复培养基可以用于多种不同病毒的 恢复，所述病毒适用于细胞培养。本领域技术人员应意识到此类病毒包括， 但不限于呼吸道病毒、副流感病毒1,2,3,4 (PI 1,2,3,4)、流感病毒A,B(Inf A,B)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(AD)、鼻病毒(RH)、细 胞巨化病毒(CMV)以及来自肠道病毒(ENT)的病毒，所述肠道病毒 由埃可病毒、科沙奇病毒、肠道病毒与脊髓灰质炎病毒组成；还有非呼吸 道病毒，所述非呼吸道病毒的例子有，但不限于单纯疱渗病毒(HSV)1,2、
水痘带状疱渗病毒(vzv)、风渗、腮腺炎、麻瘆、轮状病毒和多瘤病毒。在本发明的方法中，可以使用已知的条件将接种的细胞与有待分析的样本进行培养。例如，可以将接种的细胞在37。C培养一段时间以使细胞 感染病毒，所述时间如45-90分钟，特别是60分钟。可以在培养箱中施 行培养或者可以使用离心法施行培养。可以使用本领域已知的常规;险测方法来检测病毒，所述常规检测方法 诸如免疫检测技术、常用的分子技术；所述免疫检测技术的例子有免疫荧 光法、染色、CPE的显像，所述常用的分子技术的例子有多聚酶链式反应 (PCR)、逆转录酶PCR (RT-PCR)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。为了制备用于考察的池，依据常规的方法学通常采用多次洗涤步骤。例如，通常除去维持培养基并将细胞在池中进行空气干燥。然后可以将该池充满例如冷的曱醇-丙酮混合物(l:2的比例)并在-25。C固定15分钟。在除去混合物后，该池可以再次进行空气千燥。随后可以根据有待检测的病毒将特异性的单克隆抗体加入每个池中，并根据需要将该池进行培养。然后可以弃去所述单克隆抗体并再次洗涤该池。该过程可以使用二抗重 智久o在最终的空气干燥后，将1-2滴荧光封固剂加入池中并检查荧光的强 度(contents )。现在参考示出本发明实施方案的附图。参考图1,有待依据本发明使用的特定优选实施方案的扁平底部型池 10包括横截面为方形的主室11和一黄截面为圆形的副室12。所述副室12 乂人所述主室11的室底部13延伸。这样，所述副室的开口 14由所述主室 的室底部13界定。所述副室12的外壁15的弧形延伸至所述主室11的每 个壁16的外侧(图3最佳地示出)。主室11的一个壁16包括凹槽17,所述凹槽17用于容纳有待将池10 放入的孔板(未显示)的协同操作部分。这就使得池10牢固地锁入板中 并解决了与池10由所述一反脱离相关的问题。副室12具有预先确定的体积，从而使其能够容纳液体样品并使该液
体样品有利地形成具有凸起表面的液滴，所述凸起表面自副室的开口 14延伸。这与置于池中并由该池的侧壁形成向上的弯液面的液体样品相比， 确保了穿过副室的液体的深度基本上不变。而在所对比的那样情况下，形 成弯液面的池各面上的液体深度基本上大于弯液面最低点处的池中部的 液体深度。优选地，池的高度X为llmm,其中包括主室的10mm高度Y和副 室的lmm深度Z。该池的整个宽度W通常为8 mm,并且具有约为1 mm 的壁厚T。因此，内部宽度Wi约为6mm。主室通常界定约360 pl的体积 而副室通常界定约28.3 ^的体积。图4示例性地展示典型的12x8孔板构型(即2x6x8)的一个例子， 包括待检测病毒的列表、相关的细胞系和每种细胞系的除去天数。该板由 96个依据本发明的单个扁平底部型池组成。如图4所示，该板可以按照以下顺序接种不同的细胞系1-3栏 LLC-MK24、 5栏 MDCK6栏 Hep27栏 A5498栏 RK139-12栏 MRC-5以此模式设置的板将允许选择诸如下述的病毒，但不限于呼吸道病 毒副流感病毒1,2,3,4 (PI 1,2,3,4)、流感病毒A,B (InfA,B) 、 RSV、腺 病毒(AD)、鼻病毒(RH)、细胞巨化病毒(CMV)和来自肠道病毒(ENT) 的病毒，所述肠道病毒由埃可病毒(Eco)、科沙奇病毒(cox)、肠道病 毒(Ent)与脊髓灰质炎病毒(Polio )组成；以及但不限于非呼吸道病毒—— 单纯疱瘆病毒(HSV) 1,2与水痘带状疱渗病毒(VZV)。在另外的实施例中，6x8孔板的构形可以由按下述顺序接种的细胞系 组成1-3栏 A 5494-6栏 MRC-5这可允许例如以下病毒的检测，例子有CMV、 HSV1，2、 VZV、 AD以及来自肠道病毒属的那些病毒。最后，14x8孔的构形允许最终用于病原体的;f企测，所述病原体如PI 1,2,3,4、 InfA,B、 RSV、 AD、 RH、 ENT(Echo、 cox、 Ent、 Polio) 、 HSV 1,2、 VZV、风渗、腮腺炎、麻渗、轮状病毒、多瘤病毒以及其他使用合 适的细胞系的病原体病毒。由于池的独立的性质，可以根据适用于正在讨论的特定病毒4企测的时 间表来选4奪除去的细胞系。特别地，取A排进行举例，如果期望检测PI 1 -4， 则在第二天除去池A1至A3。同样地，如果期望检测Inf A,B,则在第二 天除去池A4和A5。然而，如果需要检测肠病毒，则随后在合适的天数 (1-3)除去池All。单个池的独特性质使得这种选择除去和病毒^r测更 加容易进行。现在参考使用本发明一个方面的试剂盒所可能采取的特定的过程，，使用真空灭菌的玻璃巴斯德吸管从有待接种的所有池中吸出培养基。 在大的细长容器中处置巴斯德吸管是方便有利的。使用 一次性吸管使孔板的合适数目的池接种有约每池150-200 )il的样 本。剩余的样本在-7(TC保存。然后将盖重新放置在板上并于板中接种的 池上方记录日期。然后将板在数字天平上称重并使用平衡板和平衡卡进行平衡直到所 有的板等重(+/- 0.5g)并且能够在离心机中平衡。离心机在约37。C下 并以3500 rpm运行60 min。然后^f吏用真空灭菌的巴斯德吸管分别/人每个 池中吸出样本，并且将每个池填满病毒恢复培养基BAC,其中每个样本 均使用干净的一次性吸管。随后在最后的样本接种后通过将板小心地;故入C02培养箱并在37°C 培养长达七天来使样品在37。C的C02培养箱(5% )中的潮湿环境下培养。通过使用特异性的单克隆抗体，可以有利地将荧光免疫染色用于单个
池中特定病毒的4企测。通常，随后的过程如下使用真空吸引器从合适的池中除去培养基并使用专用的镊子从该板除去所述池并转移入不同的支架。然后将这些物体空气干燥3分钟。之后 将300 ^的冷丙酮和甲醇的混合物(2:1 )加至每个池并允许在-20。C固定 15分钟。随后弃去固定液并将样品再次空气干燥2-3分钟。接着往每个池 中加入特异性的单克隆抗体( 一抗)并将盖有盖子的板置入适当的位置中， 且将样品在37。C培养30分钟。然后从培养箱中移出样品并且分别往池中 添加磷酸盐緩冲液(PBS)。随后弃去PBS。此过程重复四次以上。再次 将样品空气干燥3分钟，之后往每个池中加入对所述单抗具有特异性的二 抗。该步骤后，再次进行样品的培养，继之使用如上所述的PBS重复处 理且最后使用双蒸水洗涤。然后加入少量(l滴)专门制备的封固剂并在 荧光显微镜下观察结果。也可以采用一步荧光免疫染色法。除非上下文另有要求，否则遍及本说明书和随后的权利要求的词汇 "包括(comprise )"及其变体如"包括(comprises )，，和"包括(comprising )，， 应理解为包含所规定的整体或整体组合或步骤而不排除任何其他的整体 或整体组合或步骤。本领域技术人员应理解，除了专门描述的之外，可以对本文描述的本 发明进行变化和改进。应该理解的是本发明包括所有这样的变化和改进。 本发明还包括在说明书中分别涉及或标明的或者共同涉及或标明的所有 步骤、特征、组合物和化合物，以及任意两种或多种所述步骤或特征的任 意组合和全部组合。
权利要求
1.一种适合在测定中使用的单个扁平底部型的池，所述池包括(i)主室，所述主室具有容纳液体样品的开口；侧壁从所述开口和室底部延伸；和(ii)副室，所述副室从所述主室的所述室底部延伸，并适于容纳预定量的所述液体样品，其中所述副室具有扁平的底部。
2. 根据权利要求1所述的单个扁平底部型的池，其中所述主室具有 方形的横截面而所述副室具有圆形的横截面。
3. 根据权利要求1或2所述的单个扁平底部型的池，其中所述池设 置有促进与其内插入所述池的孔;i^接合的装置。
4. 根据权利要求3所述的单个扁平底部型的池，其中所述池是锥形 以便在所述孔板的贮槽中提供摩擦配合。
5. 根据权利要求3所述的单个扁平底部型的池，其中所述池设置有 与所述孔板的所述贮槽配合使用的肋或凹痕或凹槽。
6. 根据权利要求1-5任一项所述的单个扁平底部型的池，其中所述池 包^fe标识形式。
7. 根据权利要求6所述的单个扁平底部型的池，其中所述扁平的底 部设置有适用于辅助分析的标记刻度。
8. 根据权利要求l-7任一项所述的单个扁平底部型的池，其接种有在 病毒恢复培养基中的预先选择的细胞系，所述接种的池提供用于冷冻或者 随时可使用。
9. 一种池单元，其包括一个以上的如权利要求l-8任一项所述的单个 扁平底部型的池。
10. —种施行测定的方法，所述方法包括使用如权利要求l-8任一项 所述的单个扁平底部型的池或者使用如权利要求9所述的池单元。
11. 一种检测病毒的方法，所述方法包括下述步骤 (i )提供接种有预先选"^的细胞系的一个或多个如权利要求1-8任一 项所述的单个扁平底部型的池；(ii) 将待分析的样本接种于一个或多个池；以及(iii) 在所述一个或多个池中对一种或多种预先选择的病毒进行检验。
12. —种检测病毒的方法，所述方法包括下述步骤(i )提供接种有适用于接种病毒的细胞系的如权利要求1-8任一项所 述的单个扁平底部型的池；(ii )对样本进行特异性预处理以便获得可能含有待检测病毒的样品；(iii) 将所述样品接种于所述细胞系；(iv) 培养所接种的细胞系；(v) 将所接种的细胞系的样品培养基替换为病毒恢复培养基，所述 病毒恢复培养基包括添加有至少一种激素和至少一种酶的细胞培养基；(vi) 培养第(v)步所得的所述接种的细胞系；以及(vii) 分析第(vi)步所得的所述细胞系中存在的病毒。
13. 根据权利要求l-8任一项所述的单个扁平底部型的池或者根据权 利要求9所述的池单元在测定中的用途。
14. 根据权利要求l-8任一项所述的单个扁平底部型的池在病毒检测 方法中的用途，所述方法包括下述步骤(i )提供接种有预先选择的细胞系的一个或多个如权利要求1-8任一 项所述的单个扁平底部型的池；(ii) 将待分析的样本接种于一个或多个池；以及(iii) 在所述一个或多个池中对一种或多种预先选择的病毒进行检验。
15. 根据权利要求l-9任一项所述的单个扁平底部型的池在病毒检测 方法中的用途，所述方法包括下述步骤(i )提供接种有适用于接种病毒的细胞系的如权利要求1-8任一项所 述的单个扁平底部型的池；(ii )对样本进行特异性预处理以便获得可能含有待检测病毒的样品；(iii) 将所述样品接种于所述细胞系；(iv) 培养所接种的细胞系；(v) 将所接种的细胞系的样品培养基替换为病毒恢复培养基，所述 病毒恢复培养基包括添加有至少一种激素和至少一种酶的细胞培养基；(vi) 培养第(v)步所得的所述接种的细胞系；以及(vii) 分析第(vi)步所得的所述细胞系中存在的病毒。
全文摘要
本发明涉及一种适于病毒诊断方法使用的单个扁平底部型的池。更具体地说，该池具有与弯曲的底部相对的平面或扁平的底部。本发明还涉及采用这种单个池的病毒诊断方法。在该方法的一个实施方案中，采用了添加有激素和酶的专门研制的组织培养基。
文档编号C12M1/18GK101163787SQ200680013020
公开日2008年4月16日 申请日期2006年3月10日 优先权日2005年3月10日
发明者罗伯特·亚历山大 申请人:罗伯特·亚历山大