选择性硫酸化的蛋白质在真细菌中的遗传编程表达的制作方法

专利名称：选择性硫酸化的蛋白质在真细菌中的遗传编程表达的制作方法
选择性硫酸化的蛋白质在真细菌中的遗传编程表达 相关申请的交叉引用本申请要求以下申请的优先权2006年9月21日提交的美国临时申请序 列号60/846,519;和2006年10月28日提交的美国临时申请序列号60/855,210; 两篇申请的内容通过引用全文纳入本文。对联邦资助研发下所作发明的权利的声明本发明在国立卫生研究院资助号GM62159的政府支持下做出。政府对本 发明享有一定权利。发明领域本发明属于翻译生物化学领域。本发明涉及制备和利用正交(orthogonal) tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶和它们的配对将非天然氨基酸掺入蛋白质 的组合物和方法。本发明还涉及用这种配对在细胞中产生蛋白质的方法以 及用这种方法产生的蛋白质。发明背景酪氨酸硫酸化是分泌蛋白和膜结合蛋白的常见翻译后修饰(Kehoe和 Bertozzi，酪氨酸硫酸化胞外蛋白-蛋白相互作用的调节物(Tyrosine sulfation: a modulator of extracellular protein-protein interactions) ， CTzem 5/o/ 7:R57-61 (2000))。尽管对于磺基酪氨酸生物学功能的了解程度刚刚起步，但在数种蛋白-蛋白相互作用复合物中已发现它。例如，酪氨酸硫酸化在趋化因子与趋化因子 受体结合中扮有决定性作用，所述趋化因子受体包括CCR2(Preobrazhensky等， "单核细胞趋化蛋白-l受体CCR2B是一种在保守胞外区N末端区域酪氨酸硫 酸化的糖蛋白"(Monocyte chemotactic protein-1 receptor CCR2B is a glycoprotein that has tyrosine sulfation in a conserved extracellular N-terminal region) ■//mm柳o/ 165:5295-5303 (2000))、 CCR5 (Farzan等，"CCR5氨基末端的酪氨酸 硫酸化有助于HIV-1进入"(Tyrosine sulfation of the amino terminus of CCR5 facilitates HIV-1 entry) Ce〃 96:667-676 (1999))、 CXCR4 (Farzan等，"CXCR4 氨基末端翻译后修饰在基质衍生因子1 a结合和HIV进入中的作用"(The role of post-translational modifications of the CXCR4 amino terminus in stromal-derived factor 1 alpha association and HIV-1 entry) ^z'o/ CTzem 277:29484-29489 (2002); Veldkamp等，"趋化因子基质细胞起源因子 la(SDF-la/CXCL12)识别CXCR4磺基酪氨酸"(Recognition of a CXCR4 sulfotyrosine by the chemokine stromal cell-derived factor-1 alpha (SDF-lalpha/CXCLl2)) /Mo/ 359:1400-1409 (2006))和CX3CRl(Fong等， "CX3CR1酪氨酸硫酸化增强flk分形素(fractalkine)-诱导的细胞黏附" (CX3CR1 tyrosine sulfation enhances fractalkine-induced cell adhesion) / 5z'o/ Ozem 277:19418-19423 (2002))。同样，在水流剪切力下白细胞的翻滚也需要 PSGL-1的硫酸化以进行正确的结合和粘附(Somers等，"与SLe(X)和PSGL-1 结合的P-和E-选择素结构揭示的白细胞系链和翻滚的分子基础探密"(Insights into the molecular basis of leukocyte tethering and rolling revealed by structures of P-and E國selectin bound to SLe(X) and PSGL-1) Ce〃 103:467-479 (2000))。酪氨酸 硫酸化也参与了凝血级联系统，发现于数种凝集因子以及天然凝血酶抑制剂 中，如水蛭分泌的抗凝蛭素(Dong等，"糖蛋白Ib-IX复合物的酪氨酸硫酸化 识别硫酸化残基以及对配体结合的影响"(Tyrosine sulfation of the glycoprotein Ib-IX complex: identification of sulfated residues and effect on ligand binding) 33:13946-13953 (1994); Bagdy等，"蛭素"(Hirudin) M"/w& 五w矽mo/ 45:669-678 (1976))。此外，近来发现抗体可变环状区的酪氨酸硫酸化 在CD4诱导的HIV-1抗体中负责中和活性，因此证明磺基酪氨酸增加抗体-抗 原亲和力的能力(Choe等，"人抗体的酪氨酸硫酸化在识别HIV-1 gpl20的 CCR5结合区的作用"(Tyrosine sulfation of human antibodies contributes to recognition of the CCR5 binding region of HIV-1 gpl20) Ce// 114:161-170 (2003); Xiang等，"通过中和单克隆抗体模拟I型人体免疫缺陷病毒功能"(Functional mimicry of a human immunodeficiency virus type 1 coreceptor by a neutralizingmonoclonal antibody) / 79:6068-6077 (2005》。
测定硫酸化在超过60种已知的和超过2100种预测(基于小鼠蛋白序列的 研究)的含磺基酪氨酸蛋白中的功能的主要障碍是选择性合成硫酸化蛋白的能 力(Moore，"蛋白质酪氨酸O-硫酸化的生物学及酶学"(The biology and enzymology of protein tyrosine O-sulfation) / CTzem 278:24243-24246 (2003))。当前的方法依赖于肽合成或体外酶硫酸化(Veldkamp等，"通过趋化 因子基质细胞衍生因子la (SDF-la/CXCL12)识别CXCR4磺基酪氨酸" (Recognition of a CXCR4 sulfotyrosine by the chemokine stromal cell-derived factor-lalpha (SDF-lalpha/CXCL12)) J M / 359:1400-1409 (2006); Kirano 等，"牛胆囊收縮素-33 (CCK-33)的全合成"(Total synthesis of porcine cholecystokinin-:33 (GCK陽"))CTzew. Soc., Ozem. Gomww". 323-325 (1987); Muramatsu等，"用来自真细菌A -44的硫酸转移酶对酪氨酸残基进行酶的O-硫酸化"(Enzymic O-sulfation of tyrosine residues in hirudins by sulfotransferase from Eubacterium A-44)五"r /5/oc/^w 223:243-248 (1994); Young和Kiessling ，"硫酸化肽的合成策略"(A strategy for the synthesis of sulfated peptides) C/2ew/"/^/Eng/ 41:3449-3451 (2002));然而，两者都缺乏普遍性前者受限 于长度限制以及酸性条件下磺基酪氨酸有去硫酸化的趋势；后者受限于附加 硫酸转移酶的可用性以及其相关识别序列的限制。
在蛋白的已知位点直接掺入遗传编码的非天然氨基酸磺基酪氨酸可克 服上述限制。直接掺入磺基酪氨酸将极大地利于研究生物学调节过程中的 硫酸化事件，并可创造具有显著多样性的硫酸化抗体和肽库。而且，生产 蛋白蛭素的硫酸化形式的能力具有直接的临床应用，可作为改良的抗凝剂 (相对于非硫酸化形式的改良)。本领域需要能将非天然氨基酸磺基酪氨酸掺 入蛋白质的新方案。
现己开发了在原核和真核生物中将各种非天然氨基酸体内位点特异性地 掺入蛋白质的通用方法。这些方法依赖于正交蛋白质翻译组分，所述组分识别 合适的选择者密码子(selector codon)从而能在体内多肽翻译期间将所需的非天 然氨基酸插入限定位置。这些方法利用识别选择者密码子的正交 tRNA(O-tRNA)，而相应的特异性正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加载该O-tRNA。这些组分不与宿主生物体内的任何内源性tRNA、 RS、 氨基酸或密码子交叉反应(即，它必须是正交的)。利用这种正交tRNA-RS配对 可能遗传编码大量结构各异的非天然氨基酸。
本领域普遍知道利用适合于制备含一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的 正交翻译系统，例如产生正交翻译系统的通用方法。例如，参见国际公布号 WO 2002/086075，其名为"METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL 簡A-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS(产生正交tRNA-氨酰基-tRNA合成酶配对的方法和 组合物)"；WO 2002/085923，其名为"IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS(非天然氨基酸的体内掺入)"；WO 2004/094593 ， 其名为"EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE(扩展真核遗传密码)"；2004年7月7日提交的WO 2005/019415; 2004年7月7日提交的WO 2005/007870; 2004年7月7日提交的WO 2005/007624;和2005年10月27日提交的WO 2006/110182，其名为 "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS(体内掺入非天然氨基 酸的正交翻译组分)"。这些申请各自通过引用全文纳入本文。掺入非天然 氨基酸的正交翻译系统及它们的产生和使用方法的其它讨论还可参见 Wang和Schultz, "Expanding the Genetic Code(扩展遗传密码)"，CTzem. Co画肌fC謹6.) 1:1-11 (2002); Wang禾口 Schultz "Expanding the Genetic Code(扩展遗传密码)"，J"genw^/e CAew/e/"A ， 44(l):34-66 (2005); Xie和Schultz， "An Expanding Genetic Code(扩展遗传密码)"，M"/zo出 36(3):227-238 (2005); Xie禾口 Schultz， "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire(将氨基酸力Q入遗传库)"Ct^r. CAem/ca/ 9(6):548-554 (2005); Wang等，"Expanding the Genetic Code(扩展遗传密 码)"，j國.5—B,omo/. 35:225-249 (2006; 2006年1月
13日电子公开)；Xie禾卩Schultz， "A chemical toolkit for proteins - an expanded genetic code(蛋白质的化学工具箱-扩展的遗传密码)"，A^. i ev. Mo/. CW/5/o/.， 7(10):775-782 (2006; 2006年8月23日电子公开)。本领域需要开发能将非天然氨基酸磺基酪氨酸惨入蛋白质的正交翻译组 分，其中所述非天然氨基酸掺入在任何指定位置。纵览下文后可明白本文描述 的本发明满足了这些和其它需求。
发明概述
尽管酪氨酸硫酸化是多细胞真核生物中普遍的翻译后修饰(Moore，"蛋 白酪氨酸O-硫酸化的生物学和酶学"(The biology and enzymology of protein 的翻译后修饰，酪氨酸硫酸化进行进一步研究和应 用。
本发明提供在体内(例如在宿主细胞内)对选择者密码子，如琥珀终止密 码子起反应而将非天然氨基酸磺基酪氨酸掺入延伸中的多肽链的组合物和 方法。这些组合物包含不与宿主细胞翻译机制相互作用的正交-tRNA (O-tRNA)和正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)配对。即，内源性宿主细胞氨 酰基-tRNA合成酶不会用氨基酸(天然或非天然)加载O-tRNA(或加载水平 不明显)。类似地，本发明提供的0-RS不以显著或可检测的水平用氨甚酸(天 然或非天然)加载内源性tRNA。这些新组合物能够产生含有翻译掺入的磺 基酪氨酸的大量蛋白质。
在一些方面，本发明提供翻译系统。这些系统包含第一正交氨酰基 -tRNA合成酶(O-RS)、第一正交tRNA (O-tRNA)和第一非天然氨基酸，即 磺基酪氨酸，其中所述第一 O-RS用所述第一非天然氨基酸磺基酪氨酸优先 氨酰化所述第一 O-tRNA。在一些方面，所述O-RS用磺基酪氨酸优先氨酰
10化所述O-tRNA，其效率至少为包含所述O-tRNA、磺基酪氨酸以及含有SEQ ID NO: 4、 6、 8或lO所示氨基酸序列的氨酰基-tRNA合成酶的翻译系统 效率的50%。
该翻译系统可使用衍生自各种来源的组分。在一个实施方式中，所述 第一 O-RS衍生自詹氏甲垸球菌(Me^7"ococc^ y'朋"wc/n7)氨酰基-tRNA合 成酶，例如野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶。用于该系统的O-RS 可包含SEQ ID NO: 4、 6、 8或10所示氨基酸序列及该序列的保守变体。 在一些实施方式中，所述O-tRNA是琥珀抑制子tRNA。在一些实施方式中， 所述O-tRNA包含SEQ ID NO:l或由其编码。
在一些方面，翻译系统还包含编码感兴趣蛋白质的核酸，其中所述核 酸具有O-tRNA识别的至少一个选择者密码子。
在一些方面，翻译系统包括利用第二非天然氨基酸的第二正交配对(即 第二O-RS和第二O-tRNA)，现在该系统能在多肽的不同所选位置掺入至少 两个不同的非天然氨基酸。在这种双重系统中，第二O-RS用不同于第一非 天然氨基酸的第二非天然氨基酸优先氨酰化第二 O-tRNA，而第二 O-tRNA 识别不同于第一 O-tRNA所识别的选择者密码子的选择者密码子。
在一些实施方式中，翻译系统位于宿主细胞中(包括该宿主细胞)。所用 的宿主细胞不作具体限定，只要O-RS和O-tRNA在它们的宿主细胞环境中 能保留其正交性。所述宿主细胞可以是真细菌细胞，如大肠杆菌。所述宿 主细胞可含有一种或多种编码包括O-RS或O-tRNA在内的翻译系统组分的 多核苷酸。在一些实施方式中，编码0-RS的多核苷酸包含SEQIDNO:5、 7、 9或11所示核苷酸序列。
本发明还提供产生在所选位置含有一个或多个非天然氨基酸的蛋白质 的方法。这些方法利用上述翻译系统。这些方法通常始于提供含有以下组 分的翻译系统的步骤(i)第一非天然氨基酸，即非天然氨基酸磺基酪氨酸； (ii)第一正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS); (iii)第一正交tRNA (O-tRNA)， 其中所述O-RS用所述非天然氨基酸优先氨酰化所述O-tRNA;和(iv)编码 蛋白质的核酸，其中所述核酸含有O-tRNA识别的至少一个选择者密码子。 然后在所述蛋白质的翻译过程中该方法对选择者密码子起反应而将所述非天然氨基酸惨入所述蛋白质的所选位置，从而产生在所选位置含有所述非 天然氨基酸的蛋白质。在这些方法的一些方面，所述O-RS用磺基酪氨酸优
先氨酰化所述O-tRNA，其效率至少为包含所述O-tRNA、磺基酪氨酸以及含 有SEQIDNO: 4、 6、 8或10所示氨基酸序列的氨酰基-tRNA合成酶的翻 译系统效率的50%。在一些方面，使用这些方法产生硫酸化形式的蛭素。
可利用各种试剂和步骤广泛实施这些方法。在一些实施方式中，提供 编码O-RS的多核苷酸。在一些实施方式中，提供衍生自詹氏甲烷球菌氨酰 基-tRNA合成酶的O-RS，例如可以提供野生型詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA 合成酶。在一些实施方式中，该提供步骤包括提供含有SEQIDNO:4、 6、 8或10所示氨基酸序列及其保守变体的O-RS。
在这些方法的一些实施方式中，提供翻译系统的步骤包括通过定点诱 变使野生型氨酰基-tRNA合成酶的氨基酸结合袋(bindingpocket)发生突变， 选择用所述非天然氨基酸优先氨酰化所述O-tRNA的所得O-RS。所述选择 步骤可包括定点诱变后从得到的氨酰基-tRNA合成酶分子库正选择和负选 择所述O-RS。在一些实施方式中，提供步骤提供编码O-tRNA的多核苷酸， 例如，O-tRNA是琥珀抑制子tRNA，或者O-tRNA包含SEQ ID NO:l所示 多核苷酸或由其编码。在这些方法中，提供步骤还包括提供含有翻译系统 所用的琥珀选择者密码子的核酸。
还可改进这些方法以在蛋白质中掺入一个以上非天然氨基酸。在那些 方法中，联用第二正交翻译系统与第一翻译系统，其中第二系统具有不同 的氨基酸和选择者密码子特异性。例如，提供步骤可包括提供第二 O-RS 和第二 O-tRNA，其中第二 O-RS用不同于第一非天然氨基酸的第二非天然 氨基酸优先氨酰化第二 O-tRNA，且第二 O-tRNA识别核酸中不同于第一 O-tRNA所识别的选择者密码子的选择者密码子。
还可在宿主细胞环境中实施产生含非天然氨基酸的蛋白质的方法。在 这些情况中，提供的宿主细胞含有非天然氨基酸、O-RS、 O-tRNA和编码 蛋白质的含至少一个选择者密码子的核酸，而培养该宿主细胞可导致非天 然氨基酸的掺入。在一些实施方式中，提供步骤包括提供真细菌宿主细胞 (例如，大肠杆菌)。在一些实施方式中，提供步骤包括提供含有编码O-RS的多核苷酸的宿主细胞。例如，编码O-RS的多核苷酸可包含SEQ ID NO:5、 7、 9或11所示核苷酸序列。在一些实施方式中，通过提供细胞提取物实现 提供翻译系统的步骤。
本发明还提供包含核酸和蛋白质的各种组合物。除了组合物含有所述 核酸或蛋白质外，对该组合物的性质不作具体限制。本发明组合物可含有 任何数量、任何性质的其它组分。
例如，本发明提供含有O-RS多肽的组合物，其中所述多肽含有SEQ ID NO: 4、 6、 8或IO所示氨基酸序列或其保守变体。在一些方面，所述保守 变体多肽用非天然氨基酸氨酰化关联(cognate)正交tRNA (O-tRNA)的效率 至少为含有该O-tRNA、该非天然氨基酸和含有SEQIDNO: 4、 6、 8或10 所示氨基酸序列的氨酰基-tRNA合成酶的翻译系统所观察到的效率的50M。 本发明还提供编码上述任何多肽的多核苷酸。在一些实施方式中，这些多 核苷酸可含有SEQIDNO:5、 7、 9或11所示核苷酸序列。在一些实施方式 中，多肽在细胞中。
本发明还提供含有SEQ IDNO:5、 7、 9或11所示核苷酸序列的多核苷 酸组合物。在一些实施方式中，本发明提供含有所述多核苷酸的载体，如 表达载体。在一些实施方式中，本发明提供含有上述载体的细胞。
定义
在详细描述本发明前，应该知道本发明不局限于具体的生物系统，本
发明当然可以有各种变化。还应知道本文所用的术语只是为了描述具体的
实施方式，而非限制性的。除非另有明确指出，本说明书和随附的权利要
求书中使用的单数形式"一个"、"一种"和"该"也包括复数对象。因
此，例如述及"一个细胞"包括两个或多个细胞的组合；"一个多核苷酸"
实际上包括该多核苷酸的多份拷贝。
除了此处和说明书以下其余部分所定义的，本文所用的所有技术和科 学术语都与本发明所属领域普通技术人员常规理解的意义相同。
正交:本文所用的术语"正交"指与某细胞或翻译系统的内源性相应分 子相比，某分子(例如，正交tRNA(0-tRNA)和/或正交氨酰tRNA合成酶(O-RS))
13与该细胞内源性组分起作用的效率降低，或不能与该细胞的内源性组分起作
用。就tRNA和氨酰基-tRNA合成酶而言，正交指与和内源性tRNA合成酶起 作用的内源性tRNA相比，正交tRNA不能与内源性tRNA合成酶起作用或起 作用的效率降低；或者与和内源性tRNA起作用的内源性tRNA合成酶相比， 正交氨酰tRNA合成酶与内源性tRNA不起作用或起作用的效率降低，所述效 率降低例如，小于20%的效率，小于10%的效率，小于5%的效率，或小于1% 的效率。正交分子缺乏细胞中功能正常的内源性互补分子。例如，与内源性 RS氨酰化内源性tRNA相比，细胞的任何内源性RS氨酰化细胞中正交tRNA 的效率降低或者甚至为0。在另一例子中，与内源性RS氨酰化内源性tRNA 相比，正交RS氨酰化感兴趣细胞中任何内源性tRNA的效率降低或者甚至为 0。可将能与第一正交分子起作用的第二正交分子引入细胞。例如，正交 tRNA/RS配对包括引入的互补组份，与对照，例如相应的tRNA/RS内源性配 对或活性正交配对(如酪氨酰正交tRNA/RS配对)相比，它们在细胞中共同起作 用的效率是，例如45%效率、50%效率、60%效率、70%效率、75%效率、80% 效率、卯％效率、95%效率或99%效率，或更高。
IH交酪氨酰-tRNA:本文所用的正交酪氨酰-tRNA(酪氨酰-O-tRNA)是 与感兴趣翻译系统正交的tRNA，其中所述tRNA是(1)与天然酪氨酰 -tRNA相同或基本类似；(2)通过天然或人工诱变衍生自天然酪氨酰tRNA;
(3) 由考虑了(l)或(2)的野生型或突变型酪氨酰tRNA序列的任何方法产生；
(4) 与野生型或突变型酪氨酰tRNA同源；(5)与图7中称为酪氨酰tRNA 合成酶底物的任何示例性tRNA同源；或(6)图7中称为酪氨酰tRNA合成 酶底物的任何示例性tRNA的保守变体。酪氨酰tRNA可加载有氨基酸，或 处于非负载状态。还应知道"酪氨酰-O-tRNA"任选被关联(cognate)合成酶 分别加载(氨酰化)除酪氨酸以外的氨基酸，例如非天然氨基酸。应该知道， 实际上优选利用本发明酪氨酰-O-tRNA在翻译期间对选择者密码子起反应 而基本上可将任何氨基酸(无论天然或非天然的)掺入延伸的多肽内。
TH交酪氨酰氨基酸合成酶:本文所用的正交酪氨酰氨基酸合成酶(酪氨 酰-O-RS)是在感兴趣翻译系统内用氨基酸优先氨酰化酪氨酰-O-tRNA的 酶。酪氨酰-O-RS加载到酪氨酰-04RNA上的氨基酸可以是任何氨基酸，无论是天然的、非天然的还是人工的，并且不限于本文所述的。该合成酶 任选与天然酪氨酰氨基酸合成酶相同或同源，或者与图7中称为O-RS的合
成酶相同或同源。例如，所述O-RS可以是图7的酪氨酰-O-RS的保守变体， 和/或与图7中O-RS的序列至少有50%、 60%、 70%、 80%、卯％、 95%、 98%、 99%或以上相同。
关联(cognate):术语"关联"指共同起作用或彼此具有一定特异性的组分， 例如正交tRNA和正交氨酰基-tRNA合成酶。这些组分也可互称为"互补的"。
优先氨酰化:对于本文所用正交翻译系统而言，当某表达系统中O-RS使 O-tRNA带上氨基酸的效率高于其使任何内源性tRNA带上氨基酸的效率时， 该O-RS"优先氨酰化"关联O-tRNA。即，当翻译系统中存在摩尔比大致相等 的O-tRNA与任何给定的内源性tRNA时，O-RS加载O-tRNA的频率高于它 加载内源性tRNA的频率。当翻译系统中存在等摩尔浓度的O-tRNA与内源性 tRNA时，由O-RS加载的O-tRNA与由O-RS加载的内源性tRNA的相对比例 优选较高，最好导致O-RS仅加载或几乎仅加载O-tRNA。当存在等摩尔浓度 的O-tRNA与O-RS时，O-RS加载的O-tRNA与内源性tRNA的相对比例大于 1:1，优选至少约2:1，更优选5:1，更优选10:1，更优选20:1，更优选50:1， 更优选75: 1，更优选95: 1、 98: 1、 99: 1、 100: 1、 500: 1、 1,000: 1、 5,000: 1 或更高。
当(a)与内源性tRNA相比，O-RS优先氨酰化O-tRNA，和(b)与O-RS 用任何天然氨基酸氨酰化O-tRNA相比，氨酰化对非天然氨基酸特异时，称 O-RS "优先用非天然氨基酸氨酰化O-tRNA"。艮卩，当包含O-RS和O-tRNA 的翻译系统中存在等摩尔量的非天然和天然氨基酸时，O-RS用非天然氨基酸 加载O-tRNA的频率高于用天然氨基酸加载的频率。加载有非天然氨基酸的 O-tRNA与加载有天然氨基酸的O-tRNA的相对比例优选较高。O-RS最好使 O-tRNA仅加载，或者几乎仅加载有非天然氨基酸。当翻译系统中存在等摩尔 浓度的天然和非天然氨基酸时，使O-tRNA带上非天然氨基酸与使O-tRNA带 上天然氨基酸的相对比例大于1: 1，优选至少约2:1，更优选5:1，更优选10: 1，更优选20:1，更优选50:1，更优选75:1，更优选95: 1、 98: 1、 99: 1、 100: 1、 500:1、 1,000:1、 5,000: 1或更高。
15选择者密码子:术语"选择者密码子"指翻译过程中为O-tRNA所识别而
不为内源性tRNA所识别的密码子。O-tRNA反密码子环识别mRNA上的选择 者密码子并在多肽的此位置掺入其氨基酸，例如非天然氨基酸。选择者密码子 可包括，例如无义密码子，如终止密码子(如，琥珀、赭石和乳白密码子)；四 碱基或四碱基以上密码子；罕用密码子；衍生自天然或非天然碱基对的密码子， 等等。
抑制子tRNA:抑制^JRNA是在多肽翻译期间通常对终止密码子起反应 而掺入氨基酸(即，"连读")来改变给定的翻译系统中信使RNA(mRNA)阅读 的tRNA。在一些方面，本发明的选择者密码子是抑制子密码子，例如，终止 密码子(如，琥珀、赭石和乳白密码子)、四碱基密码子、罕用密码子等。
抑制活性:本文所用的术语"抑制活性"总体上指tRNA(例如，抑制^JRNA) 能翻译连读在其它情况中可导致翻译终止或错译(例如，移码)的密码子(例如， 作为选择者密码子的琥珀密码子或四个或以上个碱基的密码子)的能力。抑制 itRNA的抑制活性可表示为与第二抑制itRNA，或与对照系统，例如缺乏 O-RS的对照系统相比，观察到的翻译连读活性的百分比。
本发明提供定量测定抑制活性的各种方法。特定O-tRNA和O-RS对感兴 趣选择者密码子(例如，琥珀密码子)的抑制百分比指，在感兴趣的翻译系统中， 在编码表达测试标记的核酸中含有选择者密码子的该给定表达测试标记(例 如，LacZ)的活性与阳性对照构建物相比的百分比，所述感兴趣的翻译系统包 含O-RS禾B O-tRNA，所述阳性对照没有O-tRNA、 O-RS和选择者密码子。因 此，例如，如果在给定翻译系统中观察到不含选择者密码子的活性阳性对照标 记构建物的活性为X(其单位与所述标记试验相关)，则含有选择者密码子的测 试构建物的抑制百分比是在与阳性对照标记的表达基本相同的环境条件下(除 了该测试标记构建物在也含有O-tRNA和O-RS的翻译系统中表达外)，该测试 标记构建物显示的X百分比。表达该测试标记的翻译系统一般也包含O-RS和 O-tRNA识别的氨基酸。可任选通过将测试标记与"背景"或"阴性"对照标 记构建物比较来校正抑制百分比的测量值，所述"背景"或"阴性"对照标记 构建物含有与测试标记相同的选择者密码子，但其所在的系统不含O-tRNA、 O-RS和/或O-tRNA和/或O-RS识别的相关氨基酸。该阴性对照可用于标准化抑制百分比测定值以补偿感兴趣的翻译系统中标记的背景信号的影响。
可通过本领域已知的许多试验测定抑制效率。例如，可采用y5-半乳糖苷酶
报道试验，如可将衍生的lacZ质粒(该构建物在lacZ核酸序列中含有选择者密 码子)连同含有本发明的O-tRNA的质粒引入合适生物(例如，可利用正交组分 的生物)的细胞。还可引入关联合成酶(可以是多肽或表达时能编码该关联合成 酶的多核苷酸)。细胞在培养基中生长至所需密度，例如至OD6oo约为0.5，进 行(3-半乳糖苷酶试验，例如用诺瓦金公司(Novagen)的BetaFluorTM p-半乳糖苷 酶试验试剂盒。可将抑制百分比计算为样品相对于可比较对照，例如，衍生的 lacZ构建物的观察值的活性百分比，该构建物在所需位置具有相应的有义密码 子而非选择者密码子。
翻译系统:术语"翻译系统"指将氨基酸掺入延伸中的多肽链(蛋白质)的 各组分。翻译系统的组分可包括，例如核糖体、tRNA、合成酶、mRNA等。 本发明的O-tRNA和/或O-RS可加入体外或体内翻译系统或是其一部分，例如 存在于非真核细胞，如细菌(如大肠杆菌)中，或存在于真核细胞中，如酵母菌、 哺乳动物细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞、昆虫细胞等。
非天然氨基酸:本文所用的术语"非天然氨基酸"指不在20种常见天然 氨基酸或硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸(pyrrolysine)之列的任何氨基酸，修饰的 氨基酸和/或氨基酸类似物。例如，本发明可使用非天然氨基酸磺基酪氨酸(参 见

图1)。
衍生自:本文所用的术语"衍生自"指分离自特定分子或生物，或是用特 定分子或生物的信息制得的某组份。例如，衍生自第二多肽的多肽含有与该第 二多肽的氨基酸序列相同或基本上类似的氨基酸序列。以多肽为例，可通过， 例如天然产生的诱变、人工定向诱变或人工随机诱变获得衍生的种类。用于衍 生多肽的诱变可以是有意定向或有意随机的，或混用两种方法。诱变多肽以产 生衍生自第一(多肽)的不同多肽可以是随机的(例如，聚合酶失真所致)，可通 过合适的筛选方法，例如本文所述的方法鉴定衍生的多肽。诱变多肽通常需要 对编码该多肽的多核苷酸进行操作。
正选择或筛选标记:本文所用的术语"正选择或筛选标记"指当存在该标
记时(例如被表达或激活等)可从不具有特征的细胞中鉴定出具有特征的细胞，
17例如具有正选择标记的细胞。
负选择或筛选标记:本文所用的术语"负选择或筛选标记"指当存在该标 记时(例如被表达或激活等)可鉴定不含有所选特性或特征的细胞(例如，与确实 具有该特性或特征的细胞相比)。
报道分子:本文所用的术语"报道分子"是指可用于鉴定和/或选择感 兴趣系统的靶组分的组分。例如，报道分子可以包括蛋白质，如能赋予抗 生素抗性或敏感性的酶(如P-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)等)、荧光 筛选标记(如绿色荧光蛋白(如GFP)、 YFP、 EGFP、 RFP等)、冷光标记(如 萤火虫萤光素酶蛋白)、亲和力筛选标记，或者可选择的正或负标记基因如 lacZ、 p-gal/lacZ(P-半乳糖苷酶)、ADH(乙醇脱氢酶)、his3、 ura3、 leu2、 lys2 等。
真核生物:本文所用的术语"真核生物"指属于真核生物界(Kingdom Eucarya)的生物。真核生物通常因其以下特征而区别于原核生物典型的多细 胞组织(但不都是多细胞，例如酵母)，存在膜限制的核与其它膜限制的细胞器， 线形遗传物质(S卩，线形染色体)，不存在操纵子，存在内含子、信使(RNA)加 帽和聚-AmRNA，以及其它生物化学特征，如不同的核糖体结构。真核生物包 括，例如动物(如哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟等)，纤毛虫，植物(如单子叶 植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母菌、鞭毛虫类、微孢子虫、原生动 物等。
原核生物:本文所用的术语"原核生物"指属于原核生物界(也称为原核 生物(Procarya))的生物。原核生物通常因其以下特征而区别于真核生物单细 胞组织，通过出芽或分裂的无性生殖，缺乏膜限制的核与其它膜限制的细胞器， 环状染色体，存在操纵子，不存在内含子、信使(RNA)加帽和聚-AmRNA，以 及其它生物化学特征，如不同的核糖体结构。原核生物包括真细菌和古细菌 (Archaea)(有时称为"古细菌(Archaebacteria)")亚界。在原核生物界有时将 蓝细菌(蓝绿藻)与支原体分为不同类别。
细菌:本文所用的术语"细菌"和"真细菌"指不同于Mm的原核生物。 类似地，古细菌指不同于真细菌的原核生物。可根据许多形态和生物化学标准 区分真细菌和古细菌。例如，可采用核糖体RNA序列、RNA聚合酶结构的差异，内含子的存在与否，抗生素敏感性，细胞壁肽聚糖和其它细胞壁组分的存 在与否，膜脂质的分枝与不分枝结构，存在/不存在组蛋白和组蛋白样蛋白而将 某生物指定为真细菌或古细菌。
真细菌的例子包括大肠杆菌C&c/ en'c/ /a co//)、嗜热栖热菌(77zenm^ Aermc^/w7w力、枯草芽孢杆菌(5a"7/M w6"7&)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Sac/〃w
Aerwo; /2//^)等)。古细菌的例子包括詹氏甲烷球菌(M"/7a"ococc^ ya""(xyc/n7)(A^)、梅氏甲烷乂V叠球菌(Af"/wf"oyorc/"a maze/)(A/w)、嗜热石咸甲烷 t干菌(A/e^za"o6a"en'wrw Ae/-moaw/c^ro; /2/cMm)(AfiO 、 海 S 甲院球菌 (A/e^a/70cocc船manj^/Mofe)、 甲烷嗜热菌(A/^/wfwopyrwj1 A:fl"cZ/en')、 盐细菌 C/7a/oZ^"en'wm)(例如沃氏富盐菌(i/a/o/erax vo/cam7)和盐细菌种A^ C-7)、闪烁 古生球菌C^c/wfeog/o6z^/w/g/i^s)(4/)、激烈火球菌CP"ococcws/wnVww力CP力、极 端嗜热古菌(尸3^"ococcw5 /zor汰oy/z/,)(尸/z)、好氧火球菌(尸少ro6acw/wm aera; /n7"m)、 深海火球菌(尸戸coccus fl—w')、硫磺矿硫化叶菌(5W/o/oZms soZ/flton'cus)(&)、 超嗜热泉古菌0 "//0/。6^ totoc/a//)、嗜热泉生古细菌/ em/x)(JP)、 嗜酸热原体(T7^r附o/j/a5w" ac/c/o/ /n7ww)禾口火山热原体(77^rwop/<xsmaf
保守性变体:就翻译组分而言，本文所用的术语"保守性变体"指某翻译
组份，例如保守性变体O-tRNA或保守性变体O-RS，其所执行的功能与与其 相似的基本组分(例如O-tRNA或O-RS)相类似，但与参比O-tRNA或O-RS 相比序列中有变异的。例如，O-RS或该O-RS的保守性变体可用非天然氨 基酸，例如磺基酪氨酸氨酰化关联O-tRNA。在该例子中，所述O-RS及保 守性变体O-RS的氨基酸序列不相同。所述保守性变体在序列中可具有例如 一处变异、两处变异、三处变异、四处变异或五处或更多处变异，只要该保守 性变体仍与关联的相应O-tRNA或O-RS互补(例如，与之起作用)。
在一些实施方式中，保守性变体O-RS与衍生其的O-RS相比，含有一 个或多个保守性氨基酸取代。在一些实施方式中，保守性变体O-RS与衍生 其的O-RS相比，含有一个或多个保守性氨基酸取代，此外还保留了O-RS 的生物学活性；例如，保守性变体O-RS保留了衍生其的亲本O-RS分子至 少10%，或者至少20%，至少30%，或至少40。/。的生物学活性。在一些优选实施方式中，所述保守性变体O-RS保留了衍生其的亲本O-RS分子至少 50n/。的生物学活性。保守性变体O-RS的保守性氨基酸取代可出现在该O-RS 的任何结构域内，包括氨基酸结合袋。
选择或筛选试剂:本文所用的术语"选择或筛选试剂"指当存在时可从某
群体中选择/筛选某些组分的试剂。例如，选择或筛选试剂可以是但不限于，如 营养物、抗生素、某波长的光、抗体、表达的多核苷酸等。选择试剂可因例如 浓度、强度等而有所不同。
起反应:本文所用的术语"起反应"指本发明的O-tRNA识别选择者密码 子并介导与该tRNA偶联的非天然氨基酸掺入延伸中的多肽链的过程。
编码:本文所用的术语"编码"指用多聚大分子或序列链中的信息来指导
不同于该第一分子或序列链的第二种分子或序列链产生的任何过程。本文所用 的该术语应用广泛，可用于各领域。在一些方面，术语"编码"描述了半保留
DNA复制的过程，其中双链DNA分子的一条链用作模板，借助依赖DNA的 DNA合成酶来编码新合成的互补姊妹链。
在另一方面，术语指用一种分子的信息来指导产生化学性质不同 于该第一分子的第二种分子的任何过程。例如，DNA分子可编码RNA分子(例 如，包含依赖DNA的RNA聚合酶的转录过程)。RNA分子也可编码多肽，例 如翻译过程。当术语"编码"用于描述翻译过程时，其含义也延伸至编码氨基 酸的三联密码子。在一些方面，RNA分子可编码DNA分子，例如通过包含依 赖RNA的DNA合成酶的逆转录过程。在另一方面，DNA分子可编码多肽， 应该知道该情况用"编码"同时包括转录和翻译过程。
附图简述
图1提供了非天然氨基酸磺基酪氨酸的化学结构。
图2显示了考马斯亮蓝染色的变性PAGE凝胶，展示了磺基-蛭素和磺基-蛭素的迁移。由于蛭素的非典型带电因此无法通过分子量标准品判断其分子 里。
图3A和3B提供了凝血酶抑制的代表性图示，分别在原始数据点上拟合 了过程曲线。在含聚乙二醇6000和HAS的Tris-HCl盐水缓冲液中用50 荧光底物、40 pM人a-凝血酶和100 pM表达蛭素进行酶实验。图3A显示了无 抑制(对照)、脱磺基-蛭素抑制及磺基-蛭素抑制的荧光强度随时间变化图。图 3B显示对脱磺基-蛭素和磺基-蛭素的放大图以便比较。
图4A和4B显示了 Z-结构域的磺基酪氨酸依赖性表达。图4A提供了表 达7位具有琥珀密码子的Z-结构域的细胞的Ni-NTA纯化细胞裂解物经考马斯 亮蓝染色的变性PAGE凝胶。只有使用磺基酪氨酸补充培养基表达时产生全长 Z-结构域。图4B提供了 Ni-NTA纯化细胞裂解物(浓縮并对水透析)正-离子线 性模式MALDI-TOF谱(用THAP基质产生)，显示了含单一磺基酪氨酸并缺少 甲硫氨酸的全长Z-结构域对应的峰。也观察到从质谱分析条件中导致硫酸基团 丢失所对应的峰。
图5A、 5B和5C显示了不同的MALDI-TOF谱。图5A所示纯磺基-蛭素 正离子线性模式MALDI-TOF谱(用THAP基质产生)，显示完整[M+H]磺基-蛭 素峰(7059 Da)和质谱分析中硫酸基团丢失所对应的峰(6979 Da)。注意主峰右侧 的小峰是钠加合物。它们以22Da的间隔出现。图5B所示MALDI-TOF谱(用 芥子基质产生)记录了样品的纯度。为了增强对可能杂质的检测，使用更严苛 的导致[M+H-80]峰突显的芥子基质。13964 Da的峰归因于磺基-蛭素二聚化。 未观察到其它杂质。图5C显示了相关区域的放大图，以显示[M+H-80]和完整 磺基-蛭素峰的存在。因为使用了更严苛的芥子基质，完整的磺基-蛭素是较小 的峰。主峰右侧的小峰是钠加合物。
图6A和6B显示了不同的MALDI-TOF谱。图6A显示了在磺基酪氨酸不 存在时表达对应的未纯化磺基-蛭素表达培养基的MALDI-TOF谱(使用芥子基 质产生)。仅发现截短蛭素的峰；未观察到全长蛋白。图6B显示了在磺基酪氨 酸存在时表达对应的未纯化磺基-蛭素表达培养基的MALDI-TOF谱(使用芥子 基质产生)，显示了截短与全长磺基-蛭素的峰比例。因为需要更严苛的条件更 好地检测粗样品混合物，所以仅清晰观察到磺基-蛭素的离子化形式。
图7提供核苷酸和氨基酸序列。
发明详述
尽管酪氨酸硫酸化是多细胞真核生物中普遍的翻译后修饰(Moore，"蛋
21白酪氨酸O-硫酸化的生物学和酶学"(The biology and enzymology of protein tyrosine O-sulfation)， J5/o/C/zem 2003))，但其生物学功能大部分未知。部 分因为合成选择性硫酸化蛋白的困难。本发明提供了在细菌中通过响应琥 珀无义密码子TAG而遗传编码修饰氨基酸，从而将磺基酪氨酸掺入蛋白质 中。而且显示了用此策略可使以前无法通过重组方法得到的磺基蛭素在大 肠杆菌中直接表达。如本文所述，动力学分析显示磺基-蛭素对人凝血酶的 亲和力比脱磺基-蛭素增强10倍以上，这个发现为磺基-蛭素作为抗凝剂提 供了临床优势(DiNisio等，"直接凝血酶抑制剂"(DirecUhrombin inhibitors) JV五"g/JMW353:1028-1040 (2005))。这个生物合成硫酸化蛋白的通用方法 有利于对出现的翻译后修饰，酪氨酸硫酸化进行进一步研究和应用。
作为蛋白位点特异性硫酸化的一般方法，本发明描述了正交tRNA/氨 酰基-tRNA合成酶(aaRS)对的演化，以便在真核生物如大肠杆菌中响应于琥 珀无义密码子而有效和选择性地将磺基酪氨酸掺入蛋白质中。使用独特的 抑制子tRNA/aaRS对，可直接表达蛭素的天然硫酸化形式，证明其对人凝 血酶的亲和力比脱磺基-蛭素强10倍以上，这与此前文献报道一致(Stone 和Hofsteenge，"蛭素对凝血酶抑制的动力学"(Kinetics of the inhibition of thrombin by hirudin) Aoc/z謹'脚25:4622-4628 (1986》。
本发明提供能在大肠杆菌中对选择者密码子(例如琥珀终止密码子TAG) 起反应而将磺基酪氨酸(参见图l)体内选择性引入蛋白质的正交tRNA7氨酰基 -tRNA合成酶配对。本发明提供用非天然氨基酸磺基酪氨酸特异性加载相关的 正交tRNA(O-tRNA)的新正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)多肽。
在某些方面，为证明(但不是限制)本发明，本文内容证明可将非天然氨基 酸部分掺入各种模型蛋白质。掺入非天然氨基酸不必局限于任何特定的蛋白 质。从本发明可以明白，将非天然氨基酸磺基酪氨酸掺入感兴趣的特定蛋白质 对于各种目的是有利的。
本文还描述了开发能在真细菌中起作用而对选择者密码子起反应，从 而位点特异性地掺入非天然氨基酸磺基酪氨酸(如图1所示)的新型正交 tRNA/氨酰基-tRNA合成酶配对的方法。简言之，本发明提供了在大肠杆菌 宿主细胞中用非天然氨基酸磺基酪氨酸选择性加载抑制iRNA的詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶的新型突变体。
可利用这些开发的tRNA-合成酶配对将非天然氨基酸磺基酪氨酸位点特 异性地惨入蛋白质。可通过工程改造编码感兴趣蛋白质的多核苷酸序列使之含 有能发出惨入非天然氨基酸信号的选择者密码子，从而能将非天然氨基酸编程 掺入任何所需位置。
本文所述发明提供在真细菌，例如大肠杆菌中将非天然氨基酸磺基酪氨酸 遗传编码并掺入蛋白质的正交配对，其中所述正交组分不与宿主细胞翻译机制 的内源性大肠杆菌组分交叉反应，但能识别所需的非天然氨基酸并对选择者密 码子(例如，琥珀无义密码子，TAG)起反应而将其掺入蛋白质。本发明提供的 正交组分包括衍生自詹氏甲垸球菌酪氨酰tRNA-合成酶的正交氨酰基-tRNA合 成酶，和突变型酪氨酰tRNAojA琥珀抑制子，二者在真细菌宿主细胞中用作正 交配对。
本发明提供鉴定和产生其它正交tRNA-氨酰基-tRNA合成酶配对，例如 O-tRNA/0-RS配对的组合物和方法，所述配对可用于将磺基酪氨酸掺入蛋白 质。本发明的O-tRNA/0-RS配对能介导磺基酪氨酸掺入多核苷酸编码的蛋白 质，其中所述多核苷酸包含所述O-tRNA识别的选择者密码子。所述O-tRNA 的反密码子环识别mRNA上的选择者密码子，进而将非天然氨基酸掺入多肽 中的该位点。本发明的正交氨酰基-tRNA合成酶通常只用一种特定的非天然氨 基酸优先氨酰化(或加载)其O-tRNA。
正交tRNA/氨酰基-tRNA合成酶技术
理解与正交tRNA和正交氨酰基-tRNA合成酶配对有关的活性有助于 理解本发明的新型组合物和方法。为在遗传密码中加入额外的非天然氨基 酸，需要含有氨酰基-tRNA合成酶和适当tRNA的新正交配对，它们可在 宿主翻译机制中有效起作用，但对于所述翻译系统是"正交"的，这意味 着它可不依赖于翻译系统的内源性合成酶和tRNA而起作用。正交配对的所 需特征包括能解码或识别不由任何内源性tRNA解码的仅一种特定密码子(例 如选择者密码子)的tRNA，和只能用一种特定非天然氨基酸优先氨酰化(或"加 载")其关联tRNA的氨酰基-tRNA合成酶。内源性合成酶通常不氨酰化 O-tRNA(或氨酰化，即加载不佳)。例如，在大肠杆菌宿主系统中，正交配对包括不与任何内源性tRNA(例如，大肠杆菌中有40种)交叉反应的氨酰基-tRNA 合成酶和不被任何内源性合成酶(例如，大肠杆菌中有21种)氨酰化的正交 濯A。
本领域已知适于制备含有一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的正交翻译 系统的通用原则，例如制备正交翻译系统的通用方法。例如，可参见国际公开 号WO 2002/086075，名为"METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL画tRNA SYNTHETASE PAIRS"(产生正交tRNA-氨酰基-tRNA合成酶配对的方法和 组合物)；WO 2002/085923 ，名为"IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS "(非天然氨基酸的体内掺入)；WO 2004/094593 ，名为"EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE" (扩展真核遗传密码)；2004年7月7日提交的WO 2005/019415; 2004年7 月7日提交的WO 2005/007870; 2004年7月7日提交的WO 2005/007624; 2005年10月27日提交的WO 2006/110182，名为"ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"(用于体内掺入非天然氨基酸的正交翻译组 分)和2007年3月7日提交的WO 2007/103490，名为"SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS(在真细菌宿主细胞中表达正交翻译组分的 系统)"。这些申请各自通过引用全文纳入本文。掺入非天然氨基酸的正交 翻译系统和它们的产生及使用方法的讨论还可参见Wang和Schultz， "Expanding the Genetic Code (扩展遗传密码)"，^wge冊m^e C7zem/e. 五d ， 44(l):34-66 (2005); Xie和Schultz， "An Expanding Genetic Code (扩 展的遗传密码)"，M"Ws 36(3):227-238 (2005); Xie和Schultz, "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire (将氨基酸加入遗传库)"，C釘. Op/m'o"〖"C/zem,ca/ 5,o/ogy 9(6):548-554 (2005);禾卩Wang等，"Expanding the Genetic Code (扩展遗4专密码)"，Jwww. i ev. 5fowo/, S&m".，
35:225-249 (2006);这些文献的内容通过引用全文纳入本文。正交翻译系统
正交翻译系统一般包括含有正交tRNA(O-tRNA)、正交氨酰tRNA合成酶 (O-RS)和非天然氨基酸的细胞(可以是原核细胞，例如大肠杆菌)，其中所述 O-RS用所述非天然氨基酸氨酰化所述O-tRNA。本发明的正交配对可以包括 O-tRNA，例如抑制itRNA、移码tRNA等和关联O-RS。本发明的正交系统 通常包含处于宿主细胞环境中或无宿主细胞的O-tRNA/O-RS配对。除多组分 系统外，本发明还提供新型单组分，例如，新型正交氨酰基-tRNA合成酶多肽 (例如，SEQIDNO:4、 6、 8或IO)和编码那些多肽的多核苷酸(例如，SEQ ID NO:5、 7、 9或11)。
当正交配对识别选择者密码子并对该选择者密码子起反应而加载氨基酸 时，通常称该正交配对"抑制"该选择者密码子。即，不被翻译系统的(例如， 细胞的)内源性机制识别的选择者密码子通常不被加载，从而阻断了多肽产生， 否则可自核酸翻译该多肽。在正交配对系统中，O-RS用特定的非天然氨基酸 氨酰化O-tRNA。加载的O-tRNA识别选择者密码子并抑制选择者密码子所致 的翻译阻断。
在一些方面，与包含本文序列表所示多核苷酸序列或由其编码的 O-tRNA的抑制效率相比，本发明的O-tRNA识别选择者密码子并在关联合 成酶存在下对选择者密码子起反应而具有至少约，例如，45%、 50%、 60%、 75%、 80%或90%或更高的抑制效率。'
在一些实施方式中，联用O-RS和O-tRNA的抑制效率是缺乏O-RS的 O-tRNA的抑制效率的约，例如5倍、10倍、15倍、20倍或25倍或更高。 在一些方面，联用O-RS和O-tRNA的抑制效率是本文序列表所示正交合成 酶配对的抑制效率的至少约，例如35%、 40°/。、 45%、 50%、 60%、 75%、 80%或90%或更高。
宿主细胞利用O-tRNA/0-RS配对将非天然氨基酸掺入延伸中的多肽链， 例如经由包含编码感兴趣多肽的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸包含所述 O-tRNA识别的选择者密码子。在某些优选方面，细胞可包含一种或多种其它 O-tRNA/0-RS配对，其中玩述其它O-RS用不同的非天然氨基酸加载所述其它 O-tRNA。例如，O-tRNA之一可识别四碱基密码子，其它O-tRNA可识别终止密码子。或者，多个不同的终止密码子或多个不同的四碱基密码子可用于同一 编码核酸。
应注意，在一些实施方式中，细胞或其它翻译系统中可存在多个
0-tRNA/0-RS配对，从而能将多个非天然氨基酸掺入多肽。例如，细胞还可包 含额外的不同O-tRNA/0-RS配对和第二非天然氨基酸，其中该额外的O-tRNA 识别第二选择者密码子，该额外的O-RS用该第二非天然氨基酸优先氨酰化该 额外的0- tRNA。例如，包含O-tRNA/0-RS配对的细胞(其中所述O-tRNA识 别，例如琥珀选择者密码子)还可包含第二正交配对，其中该第二O-tRNA识别 不同的选择者密码子，例如乳白密码子、四碱基密码子等。不同的正交配对优 选衍生自不同来源，从而有助于识别不同的选择者密码子。
在某些实施方式中，系统包含例如大肠杆菌细胞等细胞，这些细胞含有正 交tRNA(O-tRNA)、正交氨酰tRNA合成酶(O-RS)、非天然氨基酸和包含编码 感兴趣多肽的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸包含所述O-tRNA识别的选 择者密码子。翻译系统还可以是无细胞系统，例如与本文所述O-tRNA/0-RS 配对和非天然氨基酸组合的各种市售可得"体外"转录/翻译系统。
0-tRNA和/或0-RS可以是天然产生的，或者可以是，例如天然tRNA和 /或RS经突变衍生，例如，通过产生各种生物的tRNA文库和/或RS文库和/ 或采用各种可用的突变方案。例如，产生正交tRNA/氨酰基-tRNA合成酶配对 的一种方案包括将，例如得自除宿主细胞外的来源或多个来源的异源(对宿主 细胞而言)tRNA/合成酶配对输入宿主细胞。候选异源合成酶的特性包括，例如 不加载任何宿主细胞tRNA，候选异源tRNA的特性包括，例如不被任何宿主 细胞合成酶所氨酰化。此外，异源tRNA对于所有宿主细胞合成酶是正交的。 产生正交配对的第二种方案包括产生用于筛选和/或选择O-tRNA或O-RS的突 变体文库。也可联用这些方案。
正交tRNA(O-tRNA)
本发明的正交tRNA(O-tRNA)优选在例如体内或体外介导将非天然氨 基酸掺入蛋白质内，所述蛋白质由含选择者密码子的多核苷酸编码，而这 种选择者密码子可被该O-tRNA识别。在某些实施方式中，与包含本文序
26列表中O-tRNA序列所示多核苷酸序列或由其编码的O-tRNA相比，本发明的O-tRNA在关联合成酶存在下，对选择者密码子起反应而具有至少45%、 50%、 60%、 75%、 80%、卯％或更高的抑制效率。
可通过本领域己知的多种试验测定抑制效率。例如，可采用P半乳糖苷酶报道分子试验，例如，将衍生的lacZ质粒(该构建物在lacZ核酸序列中含有选择者密码子)和含有本发明O-tRNA的质粒一起导入合适生物(如可利用正交组分的生物)的细胞内。还可导入关联合成酶(多肽或表达时可编码关联合成酶的多核苷酸)。将细胞在培养基内培养到所需密度，如OD,约0.5时，采用例如诺瓦金公司(Novagen)的BetaFluorTM P-半乳糖苷酶检测试剂盒进行P半乳糖苷酶试验。抑制百分率可以计算为样品相对于可比较对照(如衍生的lacZ构建物的观察值，所述构建物在所需位置上含有相应的有义密码子而不是选择者密码子)的活性百分数。
本发明O-tRNA的例子见本文序列表，例如参见图7和SEQIDNO:l。本文内容还提供了设计其它等价O-tRNA的指导。在RNA分子(例如O-RSmRNA或O-tRNA分子)中，与给定序列(或对编码DNA而言反之亦然)或其互补序列相比，胸腺嘧啶(T)被尿嘧啶(U)取代。还可存在碱基的其它修饰以大量产生功能等价分子。
本发明还包括对应于本文具体O-tRNA的O-tRNA保守性变体。例如，O-tRNA保守性变体包括功能与具体O-tRN A(例如本文序列表中的)相似的，和因合适的自身互补性而保留了 tRNA的L-形结构但不具有与例如序列表或图7所示那些(序列)相同的序列并且最好也不是野生型tRNA分子的那些分子。
含O-tRNA的组合物还可包含正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)，其中所述O-RS用非天然氨基酸优先氨酰化O-tRNA。在某些实施方式中，含有O-tRNA的组合物还可包含(例如体外或体内)翻译系统。细胞中也可存在含有编码感兴趣多肽的多核苷酸的核酸或这些物质中一个或多个的组合，其中所述多核苷酸含有O-tRNA能识别的选择者密码子。
产生正交tRNA(O-tRNA)的方法也是本发明的特征之一。通过该方法产生的正交tRNA(0-tRNA)也是本发明的特征之一。在本发明的某些实旅方式中，可通过构建突变体文库来产生O-tRNA。可采用本领域已知的各种诱变技术构建突变体tRNA文库。例如，可通过位点特异性突变、随机位点突变、同源重组、DNA改组或其它递归诱变(recursive mutagenesis)方法、嵌合体构建、或者这些技术的任何组合产生突变体tRNA，例如SEQ ID NO:1所示O-tRNA。
也可将其它突变引入特定位置，例如tRNA的所需环或区域(如反密码子环、接纳茎、D臂或环、可变环、TPC臂或环、tRNA分子的其它区域或其组合)中一个或多个非保守位置、保守位置、 一个或多个随机位置或者二者的组合位置。tRNA中的突变通常包括使突变型tRNA文库内各成员的反密码子环突变以使其能识别选择者密码子。该方法还可包括给O-tRNA加上额外序列。与起始材料(例如多种tRNA序歹i」)相比，O-tRNA通常提高了对所需生物的正交性，同时保留其对所需RS的亲和力。
这些方法任选包括分析tRNA和/或氨酰基-tRNA合成酶序列的相似性(和/或所推断的同源性)以确定显示与特定生物正交的潜在候选O-tRNA、0-RS和/或其配对。可利用本领域己知和本文所述的计算机程序进行这种分析，例如可用BLAST和堆积(pileup)程序。在一个实施例中，为筛选用于大肠杆菌的可能的正交翻译组分，可选择与真细菌生物不显示接近的序列相似性的合成酶和/或tRNA。
通常可通过，例如负选择第一物种的细胞群以获得O-tRNA，其中所述细胞含有多种潜在O-tRNA的某成员。负选择可去除含有被细胞内源性氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰化的潜在O-tRNA文库某成员的细胞。这样就可以得到第一物种细胞的正交tRNA库。
某些实施方式在负选择中将选择者密码子引入编码负选择标记(例如能赋予抗生素抗性的酶如P内酰胺酶；能得到可检测产物的酶如|3半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)，所述产物例如是毒性产物，如芽孢杆菌RNA酶)的多核苷酸的非必须位置(例如，仍能产生功能性芽孢杆菌RNA酶)等。还任选在选择性试剂(比如抗生素，如氨苄青霉素)存在下培养细胞群来进行筛选/选择。在一个实施方式中，选择性试剂的浓度不同。
例如，为检测抑制itRNA的活性，可利用基于选择者密码子的体内抑制的选择系统，例如将无义(如终止)或移码突变引入编码负选择标记的多
核苷酸(如编码P-内酰胺酶的基因(W"))中。例如，构建在某位置(如，A184)
含有选择者密码子的多核苷酸变体，如变体。用这些多核苷酸转化细胞，
如细菌。以不能被内源性大肠杆菌合成酶有效加载的正交tRNA为例，抗生素抗性(例如氨苄青霉素抗性)应约为或小于未用质粒转化的细菌的抗生素抗性。如果tRNA不是正交的，或者能加载该tRNA的异源合成酶在此系统内共同表达，应可观察到更高水平的抗生素(如氨苄青霉素)抗性。选出那些在抗生素浓度与未用质粒转化的细胞大致相等的LB琼脂平板上不能生长的细胞，如细菌。
以毒性产物(如核糖核酸酶或芽孢杆菌RNA酶)为例，当多种潜在的tRNA中的成员被内源性宿主(如大肠杆菌)合成酶(即与宿主如大肠杆菌合成酶不是正交的)氨酰化时，选择者密码子被抑制，所产生的毒性多核苷酸产物导致细胞死亡。而含有正交tRNA或非功能性tRNA的细胞可存活。
然后，在一个实施方式中，对与所需生物正交的tRNA库进行正选择，其中将选择者密码子置于正选择标记中(例如抗药性基因(如p内酰胺酶基因)编码的标记)。对以下细胞进行正选择含有编码与该细胞正交的tRNA库某成员的多核苷酸或包含该成员的多核苷酸、含有编码正选择标记的多核苷酸和含有编码关联RS的多核苷酸。在某些实施方式中，第二群细胞含有不能通过负选择除去的细胞。该多核苷酸在胞内表达，细胞在有选择试剂(如氨苄青霉素)存在下生长。然后选择能被共同表达的关联合成酶氨酰化以及对此选择者密码子起反应而插入氨基酸的tRNA。与一种或多种含有非功能性tRNA或不能被感兴趣合成酶有效识别的tRNA的细胞相比，这些细胞通常显示抑制效率升高。含有非功能性tRNA或不能被感兴趣合成酶有效识别的tRNA的细胞对该抗生素敏感。因此在两次选择中能保留下的tRNA是(i)不是内源性宿主(如大肠杆菌)合成酶的底物；(ii)能被感兴趣的合成酶氨酰化；以及(iii)能在翻译过程中起作用。
因此，取决于筛选所处的环境，同一标记可以是正或负标记。即，如果为了筛选该标记，则它是正标记，但如果为了抵御该标记则它是负标记。
上述方法中，筛选，如正选择、负选择或者正负选择的严格性任选包括改变选择的严格性。例如，由于芽孢杆菌RNA酶是毒性极高的蛋白质，可通过将不同数目的选择者密码子引入到芽孢杆菌RNA酶基因内和/或使
用可诱导启动子来控制负选择的严格性。在另一实施例中，选择或筛选试剂的浓度(如氨苄青霉素的浓度)可以不同。在本发明的一些方面，因为在前几轮中所需活性较低，严格性可以不同。因此，前几轮适用较低的严格性筛选标准，而后几轮选择适用更严谨的标准。在某些实施方式中，负选择、正选择或者正负选择可重复多次。也可使用多个不同的负选择标记、正选择标记或正负选择标记。在某些实施方式中，正选择标记和负选择标记可以相同。
其他类型的选择/筛选方法也可用于本发明以制备正交翻译组分，如
O-tRNA、 O-RS和能对选择者密码子起反应而加载非天然氨基酸的0-tRNA/0-RS配对。例如，负选择标记、正选择标记或正负选择标记可包括发荧光的或在合适反应物存在下能催化发光反应的标记。在另一实施方式中，可通过荧光激活细胞分选(FACS)或发光检测标记的产物。标记任选可包括亲和筛选标记。也参见Francisco, J. A.等(1993)， "iVo<ii/c"ow awt/y7womyce"ce-fl"/v她t/
exfema/ wr/ace (在外表面表达功能性抗体片段的大肠杆菌的制备与荧光激活细胞分选)"，Proc Natl Acad Sci USA.， 90: 10444-8。
制备重组正交tRNA的其它方法可见，例如名为"METHODS ANDCOMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNAAMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS (制备正交tRNA-氨酰基-tRNA合成酶配对的方法和组合物)"的国际申请
发明者C·C·刘, P·G·舒尔茨 申请人:斯克利普斯研究院