专利名称：：一种单精注射激活方法
技术领域：
：本发明涉及胚胎工程领域，特别是涉及单精注射中激活以生产体外胚胎技术。技术背景单精注射即以人工的方法将单个精子注射入卵胞质使之受精，形成原核，最终在体外发育成为早期胚胎的过程。将单个精子直接注入牛卵母细胞胞质以完成受精过程的方法称为胞质内注射法。为了达到高效体外生产优良品种牛的胚胎，单精子胞质内注射方法成为目前国际上首选的有性生殖的方法，在发达国家该方法己经取代了传统的体外受精的方法，成为产业化生产体外胚胎的主要技术。我们国内该技术已经在人类治疗生殖性不孕方面的应用有了很大的进展，但是在家畜生产、品种改良方面的应用较少，所以将该项技术应用于优质奶牛胚胎生产，以期达到在体外高效生产优良品种的性控胚胎。该技术体系的优点有节约精子，大大地减少使用的精子数量；受精率高，显著高于体外受精(IVF);对精子的质量要求不高，一般活力的精子或者是接近死亡的精子都可以达到受精的目的；与精子体外XY染色体分离技术结合，可以高效率的体外生产性控胚胎；生产成本低。从目前分离精液情况来看，釆用单精注射(ICSI)，是降低性控胚胎生产成本有效途径之一。从理论上讲，采用单精注射方法生产性控胚胎，一个剂量的分离精子(有效精子数200万)，足以满足国内所有实验需要，这样采用单精注射生产的性控胚胎，所用的精子成本几乎为零。在应用单精注射生产性别控制胚胎方面也存在一些技术问题，如牛卵母细胞激活率低，胚胎发育效率低下等。目前，牛卵母细胞可用钙离子载体A23187、离子霉素、乙醇、DMAP、放线菌酮。采用A23187(50mmol/L，5min)、乙醇(7%，5min)处理牛卵母细胞，卵裂率分别为55%和52%，但乙醇处理胚胎没有发育到桑椹胚和囊胚(Chen，1997)。乙醇与放线菌酮联合处理能提高激活率，且效果明显好于乙醇或放线菌酮的单独处理(Presiece，1994)随着卵龄的增大、乙醇的激活率提高，但卵龄偏高(成熟培养44h)其胚胎发育能力下降(Minamihashi,1993)。Both在2001年发现用A23187分别与DMAP和放线菌酮联合处理卵母细胞，A23187/DMAP的激活率、囊胚率高，但A23187/放线菌酮在核移植中融合卵的囊胚率更高。
发明内容针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种单精注射激活方法，该方法激活卵1个原核的比例最高，适宜用于胞质内单精子注射卵的激活。一种单精注射激活方法，其特征在于用离子霉素和6-DMAP联合激活受精卵。所述离子霉素的浓度为5pM，6-DMAP的浓度为2pM。所述联合激活方法为在5pM离子霉素中处理6分钟，再移入到2pM6-DMAP中，用2pM6-DMAP清洗三遍后在培养箱中孵育3h。本发明用离子霉素和DMAP联合激活受精卵，提高了卵母细胞的激活率，卵裂率得到了提高，用终浓度5nM的离子霉素(io)与2pM的DMAP激活受精卵后，卵裂率为60~65%。具体实施方式下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1(联合处理)1试剂1.1Ml99(Medium199GIBCO11150-059)1.2葡萄糖(D-GlucoseSIGMAG-8270)1.3咖啡因(CaffeineSIGMAC-0750)1.4胎牛血清(FBSGIBCO26140-087)1.5透明酯酸酶(HSIGMAH4272)1.6细胞松弛素B(CBSIGMAC6762)1.7二甲基亚砜(DMSOSIGMAD4540)1.8io(离子霉素SIGMA10634)1.96-DMAP(6-二甲基氨基嘌呤SIGMAD2629)UODDT(GIBCOD1532)1.11PVP(SIGMAP5288)2实验器材及仪器2.1C02培养箱Mode131112.2实体显微镜M-4002.3生物显微镜XSZ-G2.4离心机JAISHILIXINJI80-2B2.5恒温箱DHP1202.6恒温水浴锅Q/lYS002-91BS3操作步骤3.1卵母细胞的准备将离体卵巢或活体采卵得到的卵母细胞进行成熟培养20h，培养条件38.5°C,4.5%C02。成熟后用含透明质酸酶的操作液(M2)脱颗粒细胞，用实心针在显微镜下挑出有极体质量好的卵备用。3.2精子的准备用添加5mM的DDT将精液洗漆两次，然后用不含咖啡因的受精液悬浮精液20分，然后将悬浮的精液放入PVP液中备用。3.3单精注射3.3.1用吸卵针从时钟9点钟的方向吸住一枚卵母细胞，使纺锤体保持在6点或12点位置，从3点的方向轻轻进针，注射针的斜面与纺锤体相反。3.3.2注射针吸l-2个精子，穿过透明带时将第一个精子头吹至针尖处，继续进针，直至针尖插入卵母细胞深处，将精子头吐出，注射到透明带内的胞质中，回吸注入卵内多余的操作液，轻轻退针，完成一次操作。3.3.3依次方法操作，将注射后的卵在预热加FBS的M199中洗两遍。3.4卵母细胞的激活成熟约24小时后，开始进行激活。3.4.1将受精卵移入终浓度为5pMio中，作用6min。3.4.26min后，移入终浓度2pM的6-DAMP中，用6-DAMP液洗3遍，再放入做好的液滴中，放入培养箱中作用3h。3.4.33h后，取出受精卵，用培养液充分清洗3-5遍后，放入培养滴中，放入培养箱中培养液(M199+10%FBS)中培养。3.5受精卵的培养隔天半换液。并观察每滴中每枚胚胎发育情况。实施例2(离子霉素处理)步骤如实施例l，但步骤3.4项不同3.4卵母细胞激活3.4.1将受精卵移入终浓度为5pMio中，作用6min。3.4.26min后，用培养液充分清洗3-5遍后，放入培养滴中，放入培养箱中培养液(M199+10%FBS)中培养。实施例3(DMAP处理)步骤如实施例l，但步骤3.4项下不同3.4卵母细胞激活3.4.1将受精卵移入终浓度为2pM的6-DAMP中，用6-DAMP液洗3遍，再放入做好的液滴中，放入培养箱中作用3h。3.4.23h后，取出受精卵，用培养液充分清洗3-5遍后，放入培养滴中，放入培养箱中培<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上表用t检验进行统计分析。从中可以看出，实施例1卵裂率和囊胚率均为三种方法最好的，且卵裂率与其他两种方法有显著性差异(P<0.05)。权利要求1、一种单精注射激活方法，其特征在于用离子霉素和6-DMAP联合激活受精卵。2、根据权利要求1所述的方法，所述联合激活方法为在离子霉素中处理6分钟，再移入到6-DMAP中，用6-DMAP清洗三遍后在培养箱中孵育3h。3、根据权利要求2所述的方法，所述离子霉素的浓度为5pM，6-DMAP的浓度为2pM。全文摘要本发明涉及一种单精注射激活方法，属于胚胎工程领域。本发明用离子霉素和DMAP联合激活受精卵，提高了卵母细胞的激活率，卵裂率得到了提高，用终浓度5μm的离子霉素(io)与2μm的DMAP激活受精卵后，卵裂率为60～65％。文档编号C12N5/06GK101260383SQ20081010428公开日2008年9月10日申请日期2008年4月17日优先权日2008年4月17日发明者晶安,张家新,张红霞,月王,海王,敏郭,郭丽丽申请人:北京锦绣大地农业股份有限公司