专利名称：从莲(荷)植株中提取抗微生物和消炎活性成份的方法
技术领域：
本发明涉及天然物质的生物活性成分，具体而言涉及从莲(荷)植株 (包括荷叶、荷茎、荷根和莲蓬壳)中提取具有抗微生物和消炎的活性物质 的方法。
背景技术：
莲(荷)0Ve〗〃历Zw/ "ci/er、 yVe2i/巡力o〗〃tea)，禾斗属睡莲禾斗、莲属。多 年生水生植物，草本植物。叶圆形，高出水面，有长荷茎，具剌，成盾状着 生。根茎(藕)肥大多节，横生于水底泥中。叶盾状圆形，表面深绿色，被 蜡质白粉背面灰绿色，全缘并呈波状。花单生于花梗顶端、高托水面之上。 果实部分为坚果，椭圆形或卵形，俗称莲子，长1.5 2.5厘米。莲(荷)全 身是宝，藕、叶、荷茎、莲蕊、莲房(花托)入药，能清热止血。莲(荷) 主要栽培在中国的广西北部，在湖南、湖北、江西、福建以及其它许多地区 都有分布，己有300多年的种植、应用历史。
通常在夏末采摘莲子，其根茎(藕)可以食用，也可入药。与此同时，荷 叶、荷茎、荷根和莲蓬壳被丢弃。目前人们对莲子植株的非果实部分几乎没 有多少研究，其荷叶、荷茎、荷根和莲蓬壳也从未加以利用，对于其莲子植 株非果实部分的生物活性及利用人们知之甚少，几乎没有从其中得到的任何 有活性的提取物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从莲(荷)植株(包括荷叶、荷茎、荷根和莲 蓬壳，下略)中提取具有抗微生物和消炎活性物质的方法。
本发明通过研究用以下技术路线首次从莲(荷)植株中分离得到了具有很 强的抗微生物和消炎活性的有效组分。这是第一个对莲(荷)植株的具有很 强的抗微生物和消炎作用活性的研究与开发。本发明覆盖了莲子非果实部分 的具有抗微生物和消炎作用活性成份。
发明人在莲(荷)植株中发现了具有抗微生物和消炎活性有效成分，最强 的具有抗微生物和消炎作用活性部位依次为莲(荷)的荷叶、荷茎、荷根和 莲蓬壳。这些生物活性主要表现在抗微生物和消炎上，发明人预测到莲子的抗微生物和消炎活性可利用来制备食物添加物、保健品和药物，这将会有很 大的实用价值和经济价值。
为了将这一发现造福于人类，发明人对从莲(荷)植株中提取的抗微生物 和消炎活性有效成分的工艺进行了探索。经过反复研究、试验，发明了从莲 (荷)的荷叶、荷茎、荷根和莲蓬壳中提取、分离、纯化抗微生物和消炎活 性物质的方法。所发明的方法是从莲(荷)植株中用实验室和工业化生产的 技术方法，该方法通过柱层析的步骤提取具有抗微生物、消炎活性物质。其 具体方法包括
① 将晒干的莲(荷)植株或者其中的部分如荷叶、荷茎、荷根、莲蓬壳 进行机械粉碎得到粗粉，或将新鲜的莲(荷)植株或者其中的部分如荷叶、 荷茎、荷根和莲蓬壳压碎得到湿的碎块，用清水、或乙醇水溶液浸泡所述粗 粉或碎块，并加热到至少35'C，进行20分钟以上的提取，或者将以上粗粉或 碎块在水中煮沸进行提取，得到粗提取物；
② 将提取混合物过滤，滤液在室温下通过大孔吸附树脂以层析方法进行 分离，大孔吸附树脂柱在预先经水洗去未吸附的物质后用乙醇水溶液梯度洗
脱，收集乙醇水溶液的洗脱液，即得到所需的活性部分；
③ 以中等极性溶剂进行萃取除去杂质，或用TLC和HPLC分离活性部分中 的更纯的组分;干燥得到活性物质。
上述用来进行分离的大孔吸附树脂和硅胶包括市售的各种孔径和型号的 树脂和硅胶，如Amberlite XAD系列及山东鲁抗医药股份有限公司的DM系列 的大孔吸附树脂等。
本发明首次发现并提供了从莲(荷)植株中提取、分离、纯化具有抗微生 物、消炎活性物质的方法，由于莲子的非果实部分过去是废弃的从未加以利 用，因此利用来制备抗微生物、消炎的提取物，并使之应用于药物及功能性 食品和饮料、保健品、日用品及食品添加剂等将会有很大的实用价值和经济 价值。
具体实施例方式
实施例1将晒干的100克莲(荷)植株研磨粉碎后得到粗粉，用1000 毫升清水或50%的乙醇水溶液浸泡所述粗粉，并加热到至少35°C，进行20 分钟以上的提取，得到粗提取物；干燥得到约7克的活性提取物。实施例2将晒干的100克莲(荷)植株研磨粉碎后得到粗粉，在500毫 升水中煮沸15分钟以上进行提取，此过程重复2次。将提取液过滤得到滤液 约1000毫升。滤液通过100毫升已进行过水平衡的非极性的大孔吸附树脂 Amberlite XAD柱；用1000ml水洗以移去未吸附的物质。再用乙醇进行梯度 洗脱；收集20%以上的洗脱液，干燥得到约2.5克的活性提取物。
实施例3 将晒干的100克莲(荷)植株研磨粉碎后得到粗粉，在500 毫升水中煮沸15分钟以上进行提取，此过程重复2次;将提取液过滤得到滤 液约1000毫升；浓縮滤液，用中等极性溶剂进行20分钟以上的萃取，重复2 次，得到有机层和水层；将水层萃取重复2次，分离有机层和水层；合并水 层，将其干燥得到约5克活性物质。
实施例4将晒干的100克荷叶研磨粉碎后在500毫升水中煮沸15分钟以 上进行提取，提取重复2次;将提取液过滤得到滤液约1000毫升；浓縮滤液， 用中等极性溶剂进行20分钟以上的萃取，重复2次，得到有机层和水层；将水 层萃取重复2次，分离有机层和水层；合并水层，将其通过100毫升已进行过水 平衡的非极性的Amberlite XAD离子交换柱；用1000毫升水洗以移去未吸附的 物质；再用乙醇进行梯度洗脱，收集20%以上的洗脱液，干燥得到约2.5克的 活性提取物。
实施例5将晒干的100克荷茎研磨粉碎后在500毫升水中煮沸15分钟 以上进行提取，此过程重复2次；将提取液过滤得到滤液约IOOO毫升；滤液 通过100毫升已进行过水平衡的非极性的Amberlite XAD柱。用1000毫升水 洗以移去未吸附的物质；再用乙醇进行梯度洗脱；收集20%以上的洗脱液， 干燥得到约2. 5克的活性提取物。
实施例6将晒干的100克莲蓬壳研磨粉碎后在500毫升水中煮沸15分钟 以上进行提取，此过程重复2次;将提取液过滤得到滤液约1000毫升；浓縮 滤液，用中等极性溶剂进行20分钟以上的萃取，重复2次，得到有机层和水 层；将水层萃取重复2次，分离有机层和水层；合并水层，将其干燥得到约 L5克活性物质。
实施例7将新鲜的300克莲(荷)植株(非果实部分)压碎得到湿的碎 块，用2000毫升清水或50%的乙醇水溶液浸泡碎块，并加热到至少35。C， 进行20分钟以上的提取，得到粗提取物；干燥得到约7克的活性提取物。实施例8将新鲜的300克莲(荷)植株(非果实部分)压碎得到湿的碎 块，在1000毫升水中煮沸15分钟以上进行提取，此过程重复2次;将提取液过 滤得到滤液约2000毫升；浓縮滤液，用中等极性溶剂进行20分钟以上的萃取， 重复2次，得到有机层和水层；将水层萃取重复2次，分离有机层和水层；合 并水层，将其通过100毫升已进行过水平衡的非极性的Amberlite XAD离子交 换柱；用1000毫升水洗以移去未吸附的物质；再用乙醇进行梯度洗脱，收集 20%以上的洗脱液，干燥得到约2. 5克的活性提取物。
实施例9将新鲜的300克莲(荷)叶压碎得到湿的碎块，在1000毫升 水中煮沸15分钟以上进行提取，此过程重复2次。将提取液过滤得到滤液约 2000毫升。滤液通过100毫升已进行过水平衡的非极性的大孔吸附树脂 Amberlite XAD柱；用1000ml水洗以移去未吸附的物质。再用乙醇进行梯度 洗脱；收集20%以上的洗脱液，干燥得到约2.5克的活性提取物。
实施例10将新鲜的300克莲(荷)叶压碎得到湿的碎块，在1000毫升 水中煮沸15分钟以上进行提取，此过程重复2次;将提取液过滤得到滤液约 2000毫升；浓縮滤液，用中等极性溶剂例如乙酸乙酯进行20分钟以上的萃取， 重复2次，得到有机层和水层；将水层萃取重复2次，分离有机层和水层；合 并水层，将其干燥得到约2.5克活性提取物。
实施例ll将新鲜的300克荷茎压碎得到湿的碎块，在1000毫升水中煮 沸15分钟进行提取，此过程重复2次。将提取液过滤得到滤液约2000毫升； 浓縮滤液，用中等极性溶剂进行20分钟以上的萃取，重复2次，得到有机层 和水层；将水层萃取重复2次，分离有机层和水层；合并水层，将其干燥得 到约2.5克活性提取物。
实施例12将新鲜的300克荷根压碎得到湿的碎块，在1000毫升水中煮 沸15分钟以上进行提取，此过程重复2次。将提取液过滤得到滤液约2000 毫升；滤液通过100毫升已进行过水平衡的非极性的Amberlite XAD离子交 换柱；用IOOO毫升水洗以移去未吸附的物质；再用乙醇进行梯度洗脱，收集 20%以上的洗脱液，干燥得到约1克的活性提取物。
实施例13取莲(荷)植株(非果实部分)中提取物1微升(终浓度为1 毫克/毫升)和5微升(终浓度为5毫克/毫升)的溶液加入100微升的牙龈卟 啉单胞菌Porphyromonas gingivalis的培养液中于37。C培养过夜。将此培养液稀释l: 10， 000。取5微升稀释过的培养液涂于血液琼脂盘上培养过夜。计 算盘上的克隆数，对照对比计算莲(荷)植株的抑菌活性(如图4)，结果表明 莲(荷)植株的提取物具有很好的抗菌活性。终浓度5毫克/毫升的提取物能够 抑制牙龈卟啉单胞菌Porphyromonas gingivalis的生长，终浓度1毫克/毫升 的提取物能够抑制牙龈卟啉单胞菌Porphyromonas gingivalis的生长。更多的
稀释研究表明莲(荷)植株提取物的IC5。约为10毫克/毫升。
实施例14将各种莲(荷)植株(非果实部分)的提取物，通过ELISA化验， 测试其在人口腔牙龈的纤维细胞，上皮细胞，和THP-1单细胞以及BF24巨噬细 胞中抑制细胞原浆的炎症(对于导致炎症性的细胞因子IL-6， IL-8， TNF-ct，和 MCP-l产品的抑制)的作用。ELISA设备是从R&D系统购买，按照R&D系统的要 求进行化验。所有的提取物的毒理是通过检测的，认为对于ELISA化验前的细 胞是无毒性的。简而言之，BF-24和THP-1细胞是生长在RPMT介质中。48孔 的托盘中每孔的100， 000个牙龈细胞使用每孔500 A的介质。每孔用4叱的 口腔细菌/^7pArr，o朋s gii^7'rah's培养，提取物的浓縮范围从0. 5叱到2叱。 在这个化验过程中，将抗体稀释到PBS中的4 ng/mL，每个微盘上涂有100 "L 每孔的抗体。将托盘微热一晚。第二天，将托盘用400 uL的清洗液洗净将 清洗液在盘中滞留一分钟，然后冲洗干净。将此过程重复5遍。然后，用blocking buffer注入每孔中，并托盘在室温中放置1小时。随后，重复清洗工作。接下 来，将100 u L的七标准和100u tx L的样品装到每个孔中并在室温中放置2小 时。重复清洗的过程，并将抗体稀释到适当的40ng/mL浓度，并将100 u L的 抗休放入每个孔中并放置2小时。
重复清洗过程并二级抗体稀释到适当的浓度。100 yL浓度的二级抗体放入 每个孔中。盖上托盘以避免光线直射，放置在室温中39分钟。重复清洗过程， 将100uL的培养基溶液添加到每孔中。将托盘盖上在室温中放置20分钟。再 将50 uL的stop溶液加入每个孔中，每孔的optical浓度由使用的微盘读取机 设备取450 nm确定IL-8。莲(荷)植株提取物拥有很强的IL-8抑制功能。IL-6, IL-12， TNF-a的浓度TNF-a .测试使用相同的过程。
权利要求
1一种从莲(荷)植株(包括荷叶、荷茎、荷根和莲蓬壳)提取抗微生物、消炎的生物活性物质的方法，其特征包括①将晒干的莲(荷)植株或者其中的一部分如荷叶、荷茎、荷根、莲蓬壳进行机械粉碎得到粗粉，或将新鲜的莲(荷)植株或者其中的一部分如荷叶、荷茎、荷根、莲蓬壳压碎得到湿的碎块，用清水或50％的乙醇水溶液浸泡所述粗粉和碎块，并加热到至少35℃，进行20分钟以上的提取；或者将以上粗粉或碎块在水中煮沸进行提取，得到粗提取物；②将提取混合物过滤，滤液在室温下通过大孔吸附树脂以层析方法进行分离，大孔吸附树脂柱在经水洗去未吸附的物质后用乙醇水溶液洗脱，收集20％以上的洗脱液，即得到所需的活性部分；将其干燥得到具有生物活性的物质。③或将提取混合物过滤，用中等溶剂例如乙酸乙酯进行20分钟以上的萃取滤液，将水层萃取重复2次，分离有机层和水层；合并水层，将其干燥得到具有生物活性物质。
2.按照权利要求1所述从莲子植株提取抗微生物、消炎物质的提取方法， 其特征在于所述用来进行分离的大孔吸附树脂和硅胶包括市售的各种孔径和 型号的树脂和硅胶，如Amberlite XAD系列或山东鲁抗医药股份有限公司的 DM系列的大孔吸附树脂。
全文摘要
本发明公开了从莲(荷)植株(荷叶、荷茎、荷根和莲蓬壳，下略)提取抗微生物和消炎活性成份的提取方法。本发明在莲(荷)的荷叶、荷茎、荷根和莲蓬壳中发现具有很强的抗微生物、消炎活性的有效部位，发明了提取、分离并纯化具有抗微生物、消炎活性物质的方法，利用此方法来制备抗微生物和消炎的提取物，有很大的药用价值和经济价值。本发明首次发现并提供了从莲(荷)植株中提取、分离、纯化具有抗微生物和消炎的方法。由于莲(荷)植株是很便宜且目前未发现其应用价值，因此利用其非果实部分来制备抗微生物的提取物和药物及功能性食品、日用品及食品添加剂等将会有很大的价值(包括经济价值)。
文档编号A23L1/30GK101606981SQ200810110949
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月18日 优先权日2008年6月18日
发明者波 余, 平 王, 黄赤夫 申请人:湖北汇特生物医药技术有限公司