来源于小金海棠的启动子及其应用的制作方法

专利名称：：来源于小金海棠的启动子及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物启动子及其应用，特别是涉及一种来源于小金海棠的启动子及其应用。
背景技术：
：启动子是基因表达调控因子中最重要的因子，它基本决定一个基因是否表达、何时表达和何处表达。按作用方式和功能，启动子大体可以分为组成型启动子、特异性启动子和诱导型启动子三大类[王关林，方宏筠，2002，植物基因工程原理与技术(第二版)，北京，科学技术出版社]。这种分类方式基本上反映了不同类型启动子各自的功能特点，但在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其它类型启动子的特性。诱导型启动子(induciblepromoter)是指其控制的基因在某些特定的物理、化学和生物信号(统称为"诱导子"或"诱导因子")的刺激下，可以大幅度地增加转录水平。其特征为，该类型启动子控制的基因在没有诱导因子存在的条件下不表达或者只有非常低的表达(也称为"本底表达")，但一旦受到诱导因子的诱导，基因的表达量迅速并且大幅度增加。诱导型启动子常常根据其诱导信号来分类和命名，例如激素诱导启动子[XuD等，1993，PlantMolBiol，22(4):573-588;TaylorJE等，1995,PlantJ,7(1):129-134]、化学诱导启动子(WilliamsS等，1992，Biol/Technol,10:540—543;综述见PadidamM，2003，CurrOpinioninPlantBiol,6169-177)、光诱导启动子[SheenJY等，1987，PlantMolBiol,8(3):227-238;MatsuokaM等，1994，PlantJ，6(3):311-319]、热诱导启动子[Schoff1F等，1989，MolGenGenet，217(2-3):246-53]、创伤诱导启动子[FarmerEE等，1992,PlantCell,4:129-134;CarreraE等，1998，PlantJ，15(6):765-771]、真菌诱导启动子(FukudaY等，1994，PlantMolBiol,24(3):485-493)和共生细菌诱导启动子(MiaoGH等，1993，PlantCell,5:781-786)等。诱导型启动子往往也多少具有器官和/或组织特异性，例如烟草水杨酸诱导启动子PR-la主要驱动基因在叶片中表达(UknesS等，1993，PlantCell,5:159-169)。三价铁还原酶(FerricReductase,FRO)是双子叶植物和非禾本科单子叶植物应答铁胁迫的关键酶之一，其主要作用是将根表皮细胞质膜上的Fe、螯合物还原成Fe2+，并通过二价铁转运蛋白跨膜转运到细胞质中(Bienfait，1985，JournalofBioenergeticsandBiomembranes,17:73-83)。目前已从玉米(PaoloBandPaoloP,1995，JournalofExperimentalBotany,46:1497-1503)、豌豆(Watersetal.,2002，PlantPhysiol.，129:85-94)、番茄(Lietal"2004，PlantMolecularBiology,54(l):125-36)、拟南芥(Wuetal.,2005，PlantCellPhysiology,46(9):1505-14)、水稻(Ishimaruetal.，2006，PlantJournal,45(3):335-346)、黄瓜(Watersetal"2007,PlantphysiolBiochem.,45(5):293-301)等物种中克隆得到了基因。在拟南芥基因组中，三价铁还原酶FRO是一个多基因家族，由八个基因编码。尽管各FRO基因在序列上具有很高的同源性，但由于上游调控序列的差异使得各成员具有特异的时空表达模式(Wuetal"2005，PlantCellPhysiol"46(9):1505-14;Mukherjeeetal"2006，Planta,223(6):1178-90)。在对FRO同源基因的时空表达研究中发现，在不同植物中其表达模式有所不同。番茄Zei^(97在根、叶、花、子叶和幼果中均有表达；但丄eFi(9/在根部随缺铁处理时间的增加表达加强，而在叶片中稳定表达、不受缺铁胁迫的诱导(Lietal.,2004，PlantMolecularBiology,54(l):125-36)。豌豆i^F70/基因在根和叶片中均受缺铁胁迫诱导表达(Waterseta1.,2004)。拟南芥中j^702和」^T05在根中表达，AFi05主要在新梢表达，v4^7(96和^Wi07则主要在绿色组织里表达(Mukherjeeetal.，2006,Planta,223(6):1178-卯)。这些差异不仅反映了植物各组织器官在铁的吸收、分配和利用过程中的分工与合作关系，也反映了植物在长期的进化过程中为了适应不同的环境而产生的启动子序列的差异。
发明内容本发明的目的是提供一种来源于小金海棠的启动子。本发明所提供的启动子，是至少含有自序列表中序列1的5'端第1476—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和3'端延长，长度为259至1738bp的脱氧核苷酸片段。所述启动子为至少含有自序列表中序列1的5'端第1454—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延长，长度为281至1738bp的脱氧核苷酸片段。所述启动子为至少含有自序列表中序列1的5'端第1348—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延长，长度为387至1738bp的脱氧核苷酸片段。所述启动子为至少含有自序列表中序列1的5'端第1293—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延长，长度为442至1174bp的脱氧核苷酸片段。所述启动子为至少含有自序列表中序列1的5'端第1094—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延长，长度为641至1738bp的脱氧核苷酸片段。所述启动子为至少含有自序列表中序列1的5'端第967—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延长，长度为768至1738bp的脱氧核苷酸片段。所述启动子为至少含有自序列表中序列1的5'端第736—1734位核苷酸序列的按照序列1的核苷酸排列方式向5'端和/或3'端延长，长度为999至1738bp的脱氧核苷酸片段。所述启动子，它的核苷酸序列优选为下述序列之一1)序列表中序列1的核苷酸序列；2)自序列表中序列1的5'端第1476—1734位核苷酸序列；3)自序列表中序列1的5'端第1454—1734位核苷酸序列；4)自序列表中序列1的5'端第1348—1734位核苷酸序列；5)自序列表中序列1的5'端第1293—1734位核苷酸序列；6)自序列表中序列1的5'端第1094—1734位核苷酸序列；7)自序列表中序列1的5'端第967—1734位核苷酸序列；8)自序列表中序列1的5'端第736—1734位核苷酸序列；9)与1)-8)中任意所述的核苷酸序列具有90%或90%以上同源性并且具有启动子功能的核苷酸序列；7)与具有l)-8)中任意所述的序列的核苷酸在严格杂交条件下能够杂交的核苷酸序列。序列表中序列l，由1738个核苷酸组成；自序列表中序列1的5'端第1467—1472位核苷酸为光响应元件G-Box，自序列表中序列1的5'端第339—344位核苷酸为生长素应答元件，自序列表中序列1的5'端第270—273、1216—1219和1428一1431位核苷酸为铜元素响应元件，自序列表中序列1的5'端第1533—1540位核苷酸为TATA-Box，自序列表中序列1的5'端第1482—1487位核苷酸为CAAT-Box。含有上述启动子的表达盒、重组表达载体、工程菌和转基因细胞系均属于本发明的保护范围。本发明的启动子可以利用现有分子生物学的方法构建控制功能基因表达的表达载体，如瞬时表达载体pFul(图谱如图2所示)。本发明的启动子可以在缺铁诱导下表达，通过构建的表达，载体转入植物中可在植物中控制目的基因，如三价铁还原酶基因的表达，从而提高植物应答铁胁迫的能力等。图1为启动子全长的PCR扩增结果图2为瞬时表达载体pFul的物理图谱图3为pFul构建示意图图4为pFul及Ful的5'端缺失突变启动子表达载体(pDl-7)的瞬时表达结果图5为植物表达载体pFul-zh的物理图谱图6从pFul上游缺失序列的植物表达载体构建示意图图7为Ful启动子的在正常供铁和缺铁条件下的表达检测结果具体实施例方式实施例l、小金海棠月W基因启动子的获得苹果属小金海棠是一种铁高效基因型(Hanetal.，1995,ActaHorticulturaeSinica,22(4):313-317)，本发明的发明人已经从小金海棠上克隆到1个三价铁还原酶基因即小金海棠月W基因。该小金海棠月W基因在根及叶片中均受缺铁胁迫诱导而加强表达。根据其序列克隆其上游的启动子序列。具体方法如下一、基因组DNA酶切产物与接头序列的连接采用CTAB法，以lg小金海棠叶片为材料，提取小金海棠的总DNA，用BamHI酶切基因组DNA(100-200ul体系)，参照TaKaRa公司LAPCRTMinvitroCloningKit回收酶切产物并与相应Saw3AI接头连接16-20h。用lOul蒸馏水溶解连接产物，置-2(TC冰箱保存备用。二、染色体步移法扩增小金海棠FiW基因启动子(Ful)1、第一次巢式PCR根据小金海棠/^W基因组序列设计第一对巢式引物SI-1和S2-l。引物Sl-1:5'-AGCAGAGCAACTTCTCCTGCCACATTCG-3';引物S2-1:5，-TGATTAGTGCTCCCCCAATAGACTACG-3'。(1)第一轮扩增以步骤一获得的连接产物为模板，引物SI-1和TaKaRa公司LAPCRTMinvitroCloningKit里的接头引物CI为引物，进行第一轮扩增。引物Cl:GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA。扩增体系为以步骤一获得的连接产物8.75ul(lug)，10XLABufferII(Mg2+Plus)1.25ul，M腦L47^0.5ul，dNTPMixture(10mM)0.5ul，引物CI0.25ul(10-15ng),引物S1-10.25ul(10-15ng)，加水至12.5ul。PCR程序为94。C热启动3min;94。C预变性3min;94。C变性30s，66。C退火2min;72。C延伸4rain，5个循环；94。C变性30s，55。C退火2min;72。C延伸4min，30个循环；72。C延伸10min。(2)第二轮扩增将步骤(1)的PCR产物稀释100倍，以此作为模板。以S2-1和C2为引物，进行第二轮扩增。引物C2:CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA。扩增体系为步骤(1)的PCR产物稀释液，肌，10XLABufferII(Mg2+Plus)2.5叱，7^*araWA《1PL，dNTPMixture(lOmM)1HL，引物C20.5化(25-30ng)，引物S2-10.5叱(25-30ng)，加水至12.5ul。PCR程序为:94。C预变性3min;94。C变性30s，69。C退火2min;72。C延伸4min，5个循环；94。C变性30s，59。C退火2min;72。C延伸4min，30个循环；72。C延伸10min。2、第二次巢式PCR步骤l的产物克隆测序后，根据其靠近5'端的序列设计第二对巢式引物Sl-2和S2-2。引物S1-2:5，-AATGCAAAAGTGAACTGGTAATGTGAAGGC-3';引物S2-2:5'-AAACCAAATAGAGGTCATTGGAGATGCCGA-3';以步骤一获得的连接产物为模板，进行第二次巢式PCR。(1)第一轮扩增以步骤一获得的连接产物为模板，引物S1-2和TaKaRa公司LAPCRTMinvitroCloningKit里的接头引物Cl为引物，进行第一轮扩增。其中扩增体系和扩增程序同步骤l的步骤(1)。(2)第二轮扩增将步骤(1)的PCR产物稀释100倍，以此作为模板。以S2-2和C2为引物，进行第二轮扩增。其中扩增体系和扩增程序同步骤2的步骤(2)。3、扩增启动子全长序列步骤2的步骤(2)的产物测序、比对、拼接后，通过染色体步移的方法获得总长约3.2kb的小金海棠FiW基因启动子序列。设计一对特异性引物ps4和引物prl，扩增启动子全长序列，即其中1738bp的片段。引物ps4:5'-TATGTAGCCATCATCATCAGC—3，；引物prl:5，—CTGCTATAGAAAAGAGGTTTGC—3，。反应体系为小金海棠总DNA，肌(0.05-0.lug)，10XPyrobestBuffer(Mg2+Plus)2.5叱，7aAaraPyrobest0.6叱，dNTPMixture(10mM)0.5叱，引物ps4(50-60ng)，引物prll叱(50-60ng)，加水至25叱。PCR程序为:94。C预变性3min;94。C变性30s，56。C退火30s;72。C延伸3min30s，IO个循环;94。C变性30s，54。C退火30s;72。C延伸3min30s，20个循环;72。C延伸7min。然后在上述反应液中加入dATPlul，Taq酶O.5ul，72。C延伸30min。上述扩增得到1738bp左右的产物，将其进行T-A克隆测序，结果表明，该片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，即小金海棠尸yW基因的启动子，将其命名为Ful。扩增产物的电泳图如图1所示，泳道1为DL2000Marker,泳道2为D1，泳道3为Ful。将小金海棠尸V^基因的启动子(Ful)的转录起始位点用McPromoter软件进行预测。拟南芥FRO家族8个成员(除AtFR06以外)和Ful中潜在的顺式元用PLACE软件和PlantCARE软件进行分析。网址如下McPromoterhttp:〃tools.genome,duke.edu/generegulation/McPromoter厶PLACEhttp://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html;PlantCAREhttp://bioinfonnatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/;通过McPromoter在线预测了小金海棠尸^基因的转录起始位点，表明其可能位于自序列表中序列1的5'端第1563位的碱基T。通过PLACE和PlantCARE预测得出自序列表中序列1的5'端第1467—1472位核苷酸为光响应元件G-Box,自序列表中序列1的5'端第339—344位核苷酸为生长素应答元件，自序列表中序列1的5'端第270—273、1216—1219和1428—1431位核苷酸为铜元素响应元件，自序列表中序列1的5'端第1533—1540位核苷酸为TATA-Box，自序列表中序列1的5'端第1482—1487位核苷酸为CAAT-Box。实施例2、小金海棠FRO基因启动子(Ful)及其5'端缺失突变获得的启动子的功能验证根据实施例l获得的Ful启动子全长序列，设计引物构建5'端缺失突变启动子，并验证它们的启动子功能。1、以Ful启动子全长序列或5'端缺失突变启动子启动GFP表达的重组表达载体的构建1)Ful启动子全长序列启动GFP表达的重组表达载体的构建将实施例1中的步骤二的步骤3获得启动子(Ful)pMD19-T载体连接，测序鉴定，将鉴定表明含有Ful启动子片段的重组载体命名为pT-Ful。用Sphl和BamHI酶切pT-Ful，回收含有Ful启动子片段的酶切片段，连接到经Sphl和BamHI消化去除了35s启动子和NFS2片段的pBI221载体片段(原pBI221载体含有35s启动子和一个NFS2基因片段，并带有一个GFP基因位于BamHI位点一侧)上，测序鉴定，将鉴定表明含有Ful启动子片段和其下游连接的GFP基因的重组表达载体命名为pFul(pFul的构建流程图如图2所示)，pFul中GFP基因只能在Ful启动子的驱动下表达。2)Ful5'端缺失突变启动子启动GFP表达的重组表达载体的构建设计扩增Ful5'端缺失突变启动子的上游引物，分别与引物prl-5'-CTGCTATAGAAAAGAGGTTTGC-3'组成引物对，分别扩增Ful5'端缺失突变启动子。引物序列如下所述Psl:5'-TATGTAGCCATCATCATCAGC-3'(与prl组成扩增具有自序列表中序列1的5'端第736—1734位核苷酸序列(即序列8)的片段的引物对，)；Ps3:5'-CTAGAATGTTAATAGGGTCAACT-3，(与prl组成扩增具有自序列表中序列l的5'端第967—1734位核苷酸序列(即序列7)的片段的引物对，)；prol:5'-CATTGGAAGGAACACTGAGA-3'(与prl组成扩增具有自序列表中序列1的5'端第1094—1734位核苷酸序列(即序列6)的片段的引物对，)；pro2:5'-TCACCCGGCCTTCACATTAC-3'(与prl组成扩增具有自序列表中序列1的5'端第1293—1734位核苷酸序列(即序列5)的片段的引物对)；pro3:5'-ATAAGGGCGACCTCAAGTC-3'(与prl组成扩增具有自序列表中序列1的5'端第1348—1734位核苷酸序列(即序列4)的片段的引物对)；Pro4:5'-AAAAGGCTATTTCCACGACT-3'(与prl组成扩增具有自序列表中序列1的5'端第1454—1734位核苷酸序列(即序列3)的片段的引物对)；pro5:5'-ACCTCACAATAGAGCAACCG-3'(与prl组成扩增具有自序列表中序列1的5'端第1476—1734位核苷酸序列(即序列2)的片段的引物对)。分别将以上述引物Psl、Ps3、prol、pro3、Pro4或pro5与prl组成的引物对为引物，以pT-Ful为模板，进行PCR扩增，扩增Ful5'端缺失突变启动子，并对扩增的片段与pMD19-T连接，组成重组表达载体，并进行测序，将测序鉴定表明含有自序列表中序列8的核苷酸序列的重组表达载体命名为pT-Dl，将该自序列表中序列8的核苷酸序列所示的启动子命名为Dl;将测序鉴定表明含有自序列表中序列7的核苷酸序列重组表达载体命名为pT-D2，将该自序列表中序列7的核苷酸序列所示的启动子命名为D2;将测序鉴定表明含有自序列表中序列6的核苷酸序列重组表达载体命名为pT-D3，将该自序列表中序列6的核苷酸序列所示的启动子命名为D3;将测序鉴定表明含有自序列表中序列5的核苷酸序列重组表达载体命名为pT-D4，将该自序列表中序列5的核苷酸序列所示的启动子命名为D4;将测序鉴定表明含有自序列表中序列4的核苷酸序列重组表达载体命名为pT-D5，将该自序列表中序列4的核苷酸序列所示的启动子命名为D5;将测序鉴定表明含有自序列表中序列3的核苷酸序列的重组表达载体命名为pT-D6，将该自序列表中序列3的核苷酸序列所示的启动子命名为D6;将测序鉴定表明含有自序列表中序列2的核苷酸序列的重组表达载体命名为pT-D7，将该自序列表中序列2的核苷酸序列所示的启动子命名为D7。将上述测序表明正确的含有上述引物扩增的Ful的5'端缺失突变启动子的重组表达载体pT-Dl、pT-D2、pT-D3、pT-D4、pT-D5、pT-D6或pT-D7分别经印/zI和5函HI酶切，回收扩增的Ful5'端缺失突变启动子片段(Dl、D2、D3、D4、D5、D6或D7)，分别与Sp/zl和BamHI消化后去除了35s启动子和NFS2片段的pBI221载体片段连接，筛选得到重组表达载体，将重组表达载体分别进行测序鉴定。将测序鉴定表明含有D1和连接于其下游的GFP基因的重组表达载体命名为pDl(pDl中GFP基因只能在D1的驱动下表达，如图3中pDl所示)；将测序鉴定表明含有D2和连接于其下游的GFP基因的重组表达载体命名为pD2(pD2中GFP基因只能在D2的驱动下表达，如图3中pD2所示)；将测序鉴定表明含有D3和连接于其下游的GFP基因的重组表达载体命名为pD3(pD3中GFP基因只能在D3的驱动下表达，如图3中pD3所示)；将测序鉴定表明含有D4和连接于其下游的GFP基因的重组表达载体命名为pD4(pD4中GFP基因只能在D4的驱动下表达，如图3中pD4所示)；将测序鉴定表明含有D5和连接于其下游的GFP基因的重组表达载体命名为pD5(pD5中GFP基因只能在D5的驱动下表达，如图3中pD5所示)；将测序鉴定表明含有D6和连接于其下游的GFP基因的重组表达载体命名为pD6(pD6中GFP基因只能在D6的驱动下表达，如图3中pD6所示)；将测序鉴定表明含有D7和连接于其下游的GFP基因的重组表达载体命名为pD7(pD7中GFP基因只能在D7的驱动下表达，如图3中pD7所示)。pBI221载体用J力aI和^MH消化后，回收大片段，用Klenow(DNA聚合酶I大片段，补平DNA片段)37度处理半小时，然后用T4连接酶连接。转化即可得到去除了NFS2片段的对照质粒，将其命名为pD0，pD0中GFP基因的上游去除了NFS2片段并且没有插入Ful或者它的5'端缺失突变启动子。2、Ful启动子及它的5'端缺失突变启动子控制GFP基因在拟南芥原生质体里的瞬时表达验证1)拟南芥原生质体的提取和转化①取4周后抽苔前的拟南芥Co1-0叶片，切成lmm宽的长条，置于甘露醇溶液(称1.82克D—甘露醇于20ml双蒸水)中，共切叶片约90片。叶片切条捞出，置于酶解液(含有质量百分浓度为15。/。的cellulaseRIO，质量百分含量为0.30%的MacerozymeRIO，1.09g/L甘露醇(Mannitol)，0.3MKC1，0.3MMES，0.15MCaCl"0.75mM(3-巯基乙醇(p-merc即toethanol)的溶液)中，避光，23°C，40-50rpm摇床上酶解3小时。②将步骤①获得的拟南芥叶片酶解液用100-200目孔径的过滤器过滤，收集滤液，置于15ml离心管(直径约lcm)中，均分为两管。于4。C，60g，离心15min收集沉淀，即为拟南芥叶片原生质体。③原生质体用冰冷的W5溶液(含有154mMNaCl，125mMCaCl2，5mMKC1，5mMglucose,质量百分含量为0.03%的MES，pH为5.8的溶液)轻柔洗涤，每管4ml，然后在4。C，100g离心lmin。弃上清液，沉淀用冰冷的W5溶液轻柔悬浮，每管4ral，冰上放置30min。然后，于23。C，100g离心lmin，离心强度(brake)设为4-5，弃上清液，每管沉淀用0.5mlMaMg溶液(取lMMgCl2l.5ml，MES0.1g，甘露醇(mannitol)7.3g溶于水中，用KOH调pH二5.6，用水定容至100ml，高压灭菌)重悬得到原生质体溶液。④分别取约10-20ugpBI221、pDO(对照)、pFul、pDl、pD2、pD3、pD4、pD5、pD6或pD7质粒于1.5mlEP管中，分别加100ul步骤③中的原生质体溶液。用剪去前端的200ul枪头轻柔混匀。加入110ulPEG/Ca溶液，轻柔混匀，放置20-30min。⑤加入0.44mlW5溶液，来回颠倒混匀。23°C，lOOg，lmin，brake设为4-5。弃上清，加100ulW5溶液，混匀。再加入900ulW5溶液，混匀。⑥上述混合液体置于六孔板内，23°C，弱光，孵育6-18小时。2)共聚焦显微镜观察和图像处理将步骤l)得到的转pDO(对照)、pFul、pDl、pD2、pD3、pD4、pD5、pD6或pD7质粒的拟南芥原生质体在ZeissLSM510META型共聚焦激光扫描显微镜下观察。用488nmargon-ion激光激发，545nm分光境过滤，505-530nm检测GFP绿色荧光信号，560nm以上检测叶绿素自发荧光信号。图像先经LSM5ImageBrowser(Zeiss)处理，后用AdobePhotoshope8.0软件系统处理。上述实验进行了两次重复实验，结果如图4所示，对照pDO转化的原生质体(图4中pD0)中的GFP荧光充满整个细胞质。pBI221中的拟南芥y^。基因是一个位于叶绿体基质的半胱氨酸脱硫酶(L6on等，2002，BiochemicalJournal,366:557-564)，因此对照pBI221中GFP的荧光仅充满整个叶绿体(图4中pBI221)。除转pD3原生质体(图4中pD3)未出现发出绿色荧光现象外，所有的缺失体转化原生质体(转pDl、pD2、pD3、pD4、pD5、pD6或pD7质粒的原生质体)GFP均发生细胞质发光现象(图4中pDl、pD2、pD4、pD5、pD6、pD7)，转pFul原生质体在细胞膜出现荧光现象(图4中pFul)，因此推测自序列表中序列1的5'端第967一1093位之间含有潜在的负调控元件。同时，pD7具备转录活性，说明自序列表中序列1的5'端第1476—1734位的区域为具备启动子功能的基本元件，与预测的结果一致。图4中pFul、pDO、pDl、pD2、pD3、pD4、pD5、pD6、pD7和pBI221中自上而下的四个原生质体图分别为转pFul原生质体、转pDO原生质体、转pDl原生质体、转pD2原生质体、转pD3原生质体、转pD4原生质体、转pD5原生质体、转pD6原生质体、转pD7原生质体和转pBI221原生质体的488nmargon-ion激光激发照片，545mn分光境过滤照片，505-530ran检测GFP绿色荧光信号照片以及560nm以上检测叶绿素自发荧光信号的照片。实施例2、小金海棠FRO基因启动子(Ful)及其5'端缺失突变获得的启动子的在转基因植物中启动GUS基因的组织特异性检测1、含有小金海棠FRO基因启动子(Ful)及其5'端缺失突变获得的启动子与位于其控制之下的下游GUS基因的植物表达载体的构建将实施例l的步骤l获得的重组表达载体pT-Ful、pT-D3、pT-D4、pT-D5、pT-D6、pT-D7分别用HindIII和BaraHI消化，回收含有小金海棠FRO基因启动子(Ful)或其5'端缺失突变获得的启动子的序列(D3、D4、D5、D6或D7)，插入到pZHOl载体(载体图谱如图5所示，其BamHI酶切位点下游有一个GUS基因；Hua-LinZhou，Si-J"ieHe，Yang-RongCao，TaoChen,Bao-XingDu，Cheng-CaiChu,Jin-SongZhangandShou-YiChen.OsGUJl，aputativemembrane-boundendo-1，4-P-D-glucanasefromrice，affectsplantinternodeelongation.PlantMolecularBiology(2006)60:137-151;中国农业大学)的A'/7dlII和ia/fiHI酶切位点之间，进行酶切和测序鉴定。将测序鉴定表明含有自序列表中序列1的核苷酸序列和连接与其下游的GUS基因的重组表达载体命名为pZFul(pZFul中GUS基因只能在具有自序列表中序列1的核苷酸序列的启动子的驱动下表达，如图6中pZFul所示)；将测序鉴定表明含有D3和连接于其下游的GUS基因的重组表达载体命名为pZD3(pZD3中GUS基因只能在D3的驱动下表达，如图6中pZD3所示)；将测序鉴定表明含有D4和连接于其下游的GUS基因的重组表达载体命名为pZD4(pZD4中GUS基因只能在D4的驱动下表达，如图6中pZD4所示)；将测序鉴定表明含有D5和连接于其下游的GUS基因的重组表达载体命名为pZD5(pZD5中GUS基因只能在D5的驱动下表达，如图6中pZD5所示)；将测序鉴定表明含有D6和连接于其下游的GUS基因的重组表达载体命名为pZD6(pZD6中GUS基因只能在D6的驱动下表达，如图6中pZD6所示)；将测序鉴定表明含有D7和连接于其下游的GUS基因的重组表达载体命名为pZD7(pZD7中GUS基因只能在D7的驱动下表达，如图6中pZD7所示)。2农杆菌转化及阳性克隆鉴定按照《分子克隆实验指南》(第三版)所述的方法制备农杆菌感受态细胞。采用冻融法用步骤1制备的质粒pZFul、pZD3、pZD4、pZD5、pZD6或pZD7转化根癌农杆菌GV3皿。转化子在含有利福平(50mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的YEB固体培养基上筛选。挑取平板上的单克隆，接种于YEB液体培养基中，28。C振荡培养过夜，提取质粒，进行PCR鉴定，将PCR鉴定含有pZFul、pZD3、pZD4、pZD5、pZD6和pZD7的根癌农杆菌GV3101分别命名为GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7。3农杆菌转化拟南芥1)种植野生型拟南芥Co1-0，到植株长至茎高3cm时，去除其顶生花序，以刺激叶生花序的生长。去除其顶生花序5-7d后可用于转化，此时叶生花序已长出，其下部的花已经有授粉的出现。转化前一天要浇透水，剪掉角果和已开的花。2)准备GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7菌液。将GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7分别接种于5mlYEB(含lmg/L卡那霉素和lmg/L利福平)液体培养基中，28'C培养24-36h，以1:50的比例转接到200mlYEB培养基，摇至OD,为1.2-1.6。然后于6000rpm，15min集菌，沉淀用适量渗透培养基(含有质量百分含量为5%的蔗糖和质量百分含量为0.02%的SilwetL-77)充分悬浮至OD,为0.6-0.8。3)将步骤2)获得的GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7悬浮液分别倒在一个小烧杯中，分别将取拟南芥植株，将拟南芥植株的花浸入悬浮液中3-5min，保证莲座叶以上部分浸没于液体中，浸泡5rain，可见植株上有一层薄膜。将植株横放避光浸泡16-24h。取出植株，将其放正，绑住松散花芽。培育至结实，收获成熟种子(T。代)，即得到转GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的T。代拟南芥植株。4.转基因纯合体的筛选(1)将转GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的T。代拟南芥植株收获后的种子分别播种于含50Pg/ml卡那霉素的1/2Ms培养基上。4°。春化2-3天，22'C培养。将抗性植株移至土中生长，成熟后分单株收获种子(T,代)即得到转GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的1\代拟南芥植株。(2)收取的转GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的T。代拟南芥植株种子分单株同样在含卡那霉素的选择培养基上生长，看分离比，挑取接近3:1的转基因株系分单株收获种子(T2代)。在T2代观察转基因植株的分离情况，挑取接近3:1的转基因株系继续种到T3代。分单株将T3种子播种于含卡那霉素选择培养基上，从T3代的分离情况来推测T2代哪些单株为纯合体植株。即得到单拷贝插入的转GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的拟南芥纯合体株系。将这些纯和株系用正向引物pro5和反向引物pr1进行PCR鉴定。筛选得到PCR鉴定阳性的转GV-pZFul、GV-pZD3、GV-pZD4、GV-pZD5、GV-pZD6或GV-pZD7的拟南芥纯合体株系。5、小金海棠i^O基因启动子的组织检测1)GUS组织化学染色检测按照上述方法将pZHOl转入拟南芥Col-0野生植株获得PCR鉴定阳性的转pZHOl拟南芥。将PCR鉴定阳性的转GV-pZFul拟南芥纯合体株系、转pZHOl拟南芥以及拟南芥Col-0野生植株的种子分别置于MS培养基上萌发生长一周。然后将培养后各取一部分植株按照下述方法进行GUS染色检测GUS活性，另一部分植株转移到缺铁的培养基(不含有铁素的MS培养基(MS培养基配制时不加铁成分))上继续生长，3天后再次检测GUS活性。上述检测GUS活性的方法为将植株放入1.5ml离心管中，加入GUS缓冲特异性液(含有50mol/L的磷酸氢钠缓冲液(pH7.0)，10mmol/LEDTA，0.1%TritonX-100，2mmol/L铁氰化钾，2mmo1/L亚铁氰化钾的溶液)浸没，再加入5%(体积百分比)的GUS染色液，混匀后于37'C温育过夜，用70%的乙醇脱色后在体视镜下观察照相。结果如图7所示，结果表明，在正常供铁的培养基(MS培养基)中生长一周(图7A)及继续生长3天后(图7D)的转GV-pZFul拟南芥植株，GUS染色均不显蓝色，GUS报告基因不表达，此结果与拟南芥Col-0野生植株以及转pZHOl拟南芥GUS染色的结果相同。将转GV-pZFul拟南芥同一株系的其他植株转移到缺铁的MS培养基上继续生长3天后再次检测GUS活性的结果表明，■GUS基因能在根部和地上部表达(GUS染色显蓝色)，而转pZHOl拟南芥和拟南芥Col-0野生植株在缺铁培养基上生长后没有GUS活性(GUS染色不显蓝色)。这一结果表明该Ful启动子在缺铁条件的诱导下，启动GUS基因的表达。图7中A为MS培养基上萌发生长一周的转GV-pZFul拟南芥，B为MS培养基上萌发生长一周的转pZH01拟南芥，C为MS培养基上萌发生长一周的拟南芥Col-0野生植株，D为MS培养基上生长一周后继续生长3天的转GV-pZFul拟南芥，E为MS培养基上生长一周后转移至缺铁MS培养基中生长3天的转GV-pZFul拟南。序列表〈160〉8〈210〉1〈211>1738〈212>DNA〈213〉苹果属小金海棠(Afa/t^x/aq/!'朋m/s)〈400>1tatgtagccatcatcatcagccatggcacttgatcatttgctgaaa^caatgaggtatat60aatattcatatatttgcatgcaccttcttaattacttactgaaaatcggt120acaccaaatgtcataataataca已gtggttgaat已cttaaaagaaattcaaccttgtatt180atgacatttggtatagcggactgttttgcgcactgaaaatttctccgctcacacatcaca240taatccctctaaactgtaatgtt3tttatgtactatttttggccggagtggccggacgag300ctttcattgtatcaagttgtctttcggtttgaagaaccgtcgttaatcacatgagctctt360agtt肌gttaaaagctatggtaattaactggaatgtttta420ctattgcttactgagtgaagttatgcattagagaattcaataatctatcgcatgtggtccaMaacct已gttegtagatatagggtgttggatttatatccatccgttcctggttcgaaei540ctcttctttcttaa^ttattctaatagttttgaaccctctcctccccttaatgttataaa600tgagatatgaa^tgggcatg660tgcctcctaatcaatgtagttcctagttttacattttgttacggattcacaacctccctc720attttceigtELcccttgttccacaccaatgtgacgttattta^ccgtataa780acttcacaatcag3a^tcgttttttttttatcatcatctaaa&atcat11tttaaagtgc840atattcatttgatgtg8.ctatttagtcattcatatgtgtcga^csa^tcaataattc■tgataacgagtaactacctcatgatgatccatttatgaattctcttgattaagagt33tt960taagatctagaatgttaMaattcagaagtaaagagattaaatacttgga1020tcataaaaga^caaacatatatgtatgcaaatg^ttgggg^tgggC犯3catgtetttta1080tgcc犯ag3CctgcattggaaggaacactgeigertceLgtattcggcatctc1140caatgacctctatttggttttcactccacctcacccggccttcacattaccagttcactt1200ttgcattcacaatttgtacatcgaaattattcatttatctttatgatttg1260gcttcatatttataatatttataacgtcgtgttttcatta1320gaacgtatctttata^tata^gggcgacctcaagtcaaaaagactctct1380actttgcgcgagtcggggga邓ggg犯gggggggggg组gtttattgtacacagcttta1440ttcttactttgcasaaaggctatttccacgactcgaacctcaca^tagagcaaccgttcc1500gttacgcc3agactcgaacccatgaatctttatatataaatagcaaatattgtctttttt1560tttctattcaatttacacgtgaattcactgaagatttgacta^gtttatgtttttcattg1620gacaaaMttgta^tsttttcatttcccaaaatcagataaaagttcgtg168017<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>gggggggggga^cgactcg38ctgaagatttcca犯aagttaatgtttattgtacacagctttattcttaccctcacaatagagcaaccgttccgttacgcaaatagcaaatattgtctttttttttctatgactaagtttatgtttttcattggacaaaa3^aa^tca^ga^a^agttcgtgct3aaa^tttgcaaaaacaagactcgatcaMttaca"tttgtaasta^attgcaagctggctatttcccgtgaattcattttcatttc120180240300360<210>5〈211〉442〈212〉腿〈213〉苹果属小金海棠(Ma/w;a'"q/7we"^)〈400〉5aa^tgsaataacgtcgtgttttcattaaa3tt犯ga^gaacgtatctttata^tatataa60gggcgacctc犯gtcaaaaagactctctactttgcgcgagtcgggggaaggggaaggggg120ggggg犯tgttt3ttgt:acacagctttattcttactttgca^a^aggctatttccacgac180tcgaacctcacaatagagcaaccgttccgttacgccaagactcgaacccatgaatcttta240tatataaatagcaaatattgtctttttttttctattcaatttacacgtgaattcactgaa300gatttgactaagtttatgtttttcattggacaaaatttgtaaatattttxatttcccaaa360aagttaaaaaatcagataaaagttcgtgctaaaaaMtgcaagctatataaagatatcaa420gcaaacctcttttctatagcag442〈210〉6〈211〉641〈212〉DNA〈213〉苹果属小金海棠(M"/w)〈400〉6ttgacaactgcattggaaggaacactgagatcagtattcggcatctccaatgacctctat60ttggttttcactccacctcacccggccttcacattaccagttcacttttgcattcacaat120ttgtaca犯tgctatattcgaaattatteatttatctttatgatttgtagaataaaggct180tcatatttataatatttgtaacgtcgtgtt11cattaaaatta^g￡Ltg^240cg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