肺癌分型的基因序列及其应用的制作方法

专利名称：：肺癌分型的基因序列及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种进行肺癌病理分型的基因检测分析方法，属于分子生物学技术应用领域。
背景技术：
：肺癌在病理学上分为小细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌等几种类型，在基本类型下还有多种亚型的区分。各病理类型的肺癌在肿瘤的生物学行为、对放疗、化疗及分子耙向药物的敏感性等方面存在差异，各型预后也不相同。因此，在临床上对肺癌作出诊断时，明确其病理分型对制订治疗方案、分析预后非常重要。在本发明之前，医学界对肺癌的病理分型主要依靠微观形态学及免疫组织化学方法。传统的病理组织学方法是将获取的病变组织通过固定、脱蜡、染色等步骤，制作成切片在在显微镜下分辨其微观结构。该方法步骤繁多，需要白白等待一二天的时间，在病理学专业人员对切片进行判读时也难免主观性。肿瘤的分子分型(molecularclassification)是从系统生物学角度，采用现代新型高通量分子分析技术，根据分子(分子遗传学、分子生物学)改变特征，对肿瘤进行分类分型。分子分型既与组织形态学分型相关，又是对后者的积极补充。现有关于肺癌的分子生物学知识认为，不同病理类型肺癌的基因表达谱不同，即不同的基因在不同的病理组织有不同的丰度。.DNA芯片或DNA微阵列，是通过微电子技术和微加工技术将大量特定序列的DNA片段或寡核苷酸片段按矩阵高密度固定于玻璃、硅片等载体上，待测样品用荧光分子标记后，与芯片上大DNA或寡核苷酸片段杂交，通过荧光扫描及计算机分析后获得大量基因信息的一种检测方法，其突出特点在于能够对微量样本中的核酸序列信息进行快速、准确、高通量的检测和分析，可以获得单个基因相关的表达水平，及相似的或完全相同基因表达模式的表达谱。应用高通量cDNA芯片和寡核苷酸芯片技术建立的基因表达谱，在过去几年3里已经试验性的用于肿瘤诊断，这是一个革命性的变化。随着这些工具的应用，以前不能明确的肿瘤亚群已经被确定。另外，基因信号的发展能够用来预测预后的结论，这是从标准的组织病理学和免疫组织化学方法不能得出的，开拓了用病理诊断分析肿瘤的途径。通过基因芯片应用实例，说明了这项技术应用范围的广阔，甚至能提高组织病理学诊断预测能力。小细胞肺癌与非小细胞肺癌的基因表达谱明显不同构成鳞癌特症性表达谱的基因大多参与细胞解毒和抗氧化过程(如GST、羧基酯酶等)，往往与支气管上皮细胞对环境致癌因素(如香烟成分)的代谢、解毒有关。而腺癌则以表面活性物质相关基因和小气道相关基因异常表达为特点(如SurfactantsA2和B、Mucin1)，提示这类肿瘤的细胞起源及其发病机制。大细胞肺癌的特征性基因表达谱，例如过表达HMGI(Y)、TPA等，以及低表达E-cad、PAX-8和r-catenin等，反映了上皮细胞-间充质细胞转分化。此外，一部分被组织学诊断为大细胞肺癌的病例，根据基因表达谱却可以清楚地归入鳞癌或腺癌组。真正有价值的正是通过对基因表达谱分析，识别目前尚不能通过组织形态学加以区别，但却有临床意义的肿瘤亚型。
发明内容本发明的目的之一是提供用于肺癌分型和诊断的基因序列，所述序列包括(a)SEQIDNO10至SEQIDNO323所示的序列;(b)SEQIDNO10至SEQIDNO323所示的序列中每条序列的互补序列;(c)与SEQIDNO10至SEQIDNO323所示的序列中每条序列有至少70%同源性的序列。本发明的目的之二是将基因序列用于肺癌分型和诊断领域，构建一种用于肺癌基因分型的基因芯片。实现本发明第二个目的的一种用于肺癌基因分型的基因芯片，其构成包括固定载体和固定在固定载体上的寡核苷酸探针，其中所述寡核苷酸探针包括(a)SEQIDNO10至SEQIDNO323所示的序列；(b)SEQIDNO10至SEQIDNO323所示的序列中每条序列的互补序列；(c)与SEQIDNO10至SEQIDNO323所示的序列中每条序列有至少70%同源性的序列。所述寡核苷酸探针还包括选自SEQIDNO1至SEQIDNO10的几种或全部阳性对照探针和阴性对照探针。本发明寡核苷酸基因芯片分为4个区，每个区域按18X17矩阵排列，每个区含有9个阳性对照、5个阴性对照和3个空白对照。本发明的目的之三是提供一种肺癌样品，因分型的方法。该方法采用基因技术筛选与肺癌分子分型相关的基因，对肺癌的基因分型诊断及肺鳞癌、肺腺癌内亚型的细分诊断提供有价值的依据，为肺癌分子分型研究、实现肺癌病例个体化治疗提供参考。实现本发明第三个目的的肺癌样品基因分型方法，包括以下步骤(1)分别提取95D细胞s肺腺癌组织、肺鳞癌组织的总RNA,以总RNA逆转录为cDNA，制作成有荧光标记的探针；(2)上述制备的杂交荧光探针与芯片进行杂交，获得杂交结果；(3)用ScanarrayLite激光共聚焦扫描仪扫描芯片，通过Gen印ix5.1分析软件分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值，其中Cy5/Cy3相差两倍以上且比值大于2.0或小于0.5表示基因有差异表达，并采用聚类方法分别对肺鳞癌和肺腺癌的基因表达谱进行相关性分析。本发明的用于肺癌分型和诊断的基因序列可以快速高通量地筛选出与肺癌分子分型可能相关的基因，对肺癌组织进行分子分型，提供一定线索，为临床诊断提供更多信息。图1为芯片各区01igo分布图。其中红色线框内是阳性对照，黄色线框内是空白对照，蓝色线框内是阴性对照。在黑白图中红色是黑线，黄色和蓝色是白线；图2为95D细胞总RNA电泳结果；图3为95D2在芯片的Block2上的杂交结果；图3.1(a)Cy3标记95D1，(b)Cy5标记95D2，在一张芯片杂交结果；图3.2(a)(b)均用Cy5标记的杂交结果；图4为鳞癌、腺癌部分癌组织及癌旁组织总RNA电泳结果；图4.1为同一鳞癌病人癌组织和癌旁组织总RNA电泳结果；图4.2为同一腺癌病人癌组织和癌旁组织总RNA电泳结果；图5为鳞癌和其癌旁组织与芯片杂交结果，其中(a)Cy3-鳞癌癌旁组织，(b)二者叠加图，(c)Cy5-鳞癌癌组织；5图6为腺癌和其癌旁组织与芯片杂交结果，其中(a)Cy3-腺癌癌旁组织，(b)二者叠加图，(c)Cy5-腺癌组织；图7为(a)肺鳞癌与其癌旁组织、(b)肺腺癌与其癌旁组织散点图8为7例腺癌病人癌组织与芯片杂交结果，其中(a)Cy3-XI，(b)Cy3-X3，(c)Cy3—X5，(d)Cy5—X2，(e)Cy5—X4,(f)Cy5-X6，(g)Cy5-X7;图9为8例鳞癌病人癌组织与芯片杂交结果，其中(a)Cy3-Ll，(b)Cy3-L3，(c)Cy3—L5，(d)Cy5—L2，(e)Cy5—L4，(f)Cy5-L6，(g)Cy5-L7，(h)Cy5-L8;图IO为(a)肺鳞癌、(b)肺腺癌癌旁组织与芯片杂交结果；图11为8例肺鳞癌和7例肺腺癌与芯片非监督聚类图，其中X代表腺癌，L代表鳞癌，p代表癌旁组织，红色为表达丰度高，黄色为丰度中，绿色为丰度低。在黑白图中，红色深，黄色浅，绿色中。具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步说明。实施例1构建肺癌分子分型相关基因信息库根据前期研究提供的肺癌分子分型相关基因和GenBank数据库中的信息，利用美国国家生物技术信息中(NCBI)提供的BLAST分析软件找出肺癌相关基因保守序列，然后用生物学软件ArrayDesigner4.2设计332条长度均为60bp(mer)的01igo探针。一、材料l.选定目的基因的来源1.l.搜集60个肺癌相关基因，购自AmericanTypeCultureCollection。1.2.在60个肺癌相关基因基础上，利用抑制消减杂交(SSH)和cDNAMicroarray进一步筛选肺癌相关基因。实验基于永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)及其R15H20服(恶性转化前时期)、R15H35细胞(恶性转化时期)，与用60个肺癌相关基因'建立的cDNA芯片杂交。利用SSH技术建立BEP2D细胞恶性转化不同时期的差异表达基因文库，其中A差减文库(BEP2D细胞的cDNA为tester,R15H35细胞的cDNA为driver)有416个克隆，B差减文库(R15H20细胞的cDNA为tester,BEP2D和R15H35细胞的cDNA混合后为driver)有301个克隆，C差减文库(R15H35细胞的cDNA为tester,BEP2D细胞的cDNA为driver)有586个克隆。将3个文库中的全部克隆制作在一张芯片上，筛选了15例肺癌组织、5例肺癌旁组织和其他8种癌组织(肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、白血病、子宫内膜癌、脑神经胶质瘤和结肠癌各1-3例)中mRNA的表达差异。获得208个具较大差异表达的基因肺癌组织高于肺癌旁组织表达的cDNA克隆27个，肺癌旁组织高于肺癌组织表达的31个，二者高于其他8种癌组织的分别为肺癌旁组织中63个，肺癌组织中87个。1.3.从文献报道中搜集主要与肺癌病理分型、分期、预后及耐药相关的基因J二、BLAST分析从基因GenBank中査出上述基因的相应全长DNA序列，将5'非编码区、3'非编码区及结构蛋白和非结构蛋白的基因序列分别进行BLAST分析，确保与其他物种的基因序列具有较强的特异性。根据分析结果获得肺癌相关基因的各保守区域的目的片段，作为设计01igo探针的备选序列。三、Oligo探针的设计利用生物软件ArrayDesigner4.2分别对BLAST检索所得肺癌基因的保守序列逐一进行分析，设计探针长度为60bp的探针。为减少非特异性杂交，保证芯片的敏感度和精确度，探针设计遵循以下5条基本原则①G+C含量为50%-70%;②探针的50%解链温度(Tm值)应接近7(TC，上下波动5X:;③避免单一碱基连续重复8次以上；④探针分子内部互补碱基少于3bp;⑤每个探针与非靶基因的相似性必须<70%，探针连续同源的碱基数《5个。对备选探针进行筛选时，各种参数尽量控制在最佳范围，以保证在同一张芯片上的探针在相同的杂交、清洗条件下得到最佳的杂交效果。通过GenBank搜索获得肺癌相关基因的全序列，将这些基因序列分别放入GenBank国际数据库系统进行BLAST分析，确定了各基因序列高度保守。故选取这些基因序列为01igo探针的目标序列。遵循探针设计的基本原则，运用ArrayDesigner4.2软件设计出长度为60mer的特异Oligo(寡核苷酸)探针332条。其序列见表l"332条01igo探针的序列"。实施例2肺癌分子分型相关寡核苷酸基因芯片的构建一、试剂准备7所需的主要试剂按以下方法配制1.PBS溶液称取8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HP04，800ml蒸馏水中，用HC1调至PH至7.4，加水定容至1L，高压灭菌备用。2.20XSSC:在800ml水中容175.3gNaCl，88.2g拧檬酸钠，调PH至7.4，加水定容至1L，高压灭菌待用。3.10%SDS:在900ml水中溶解100gSDS，加热至68'C助溶，用浓盐酸调节PH至7.2，加水定容至1L，分装备用。4.50XDenhardt贮存液5g聚蔗糖，5g聚乙烯咯垸酮，5g牛血清蛋白(组分V)溶解500ml水中，过滤除菌，备用。5.杂交液组成为50%甲酰胺，5XDenhardt液，6XSSC，0.5WSDS及100ug/ml，鲑鱼精DNA。二、实验方法1.寡核苷酸探针的制备所有寡核苷酸探针合成均采用标准亚磷酰氨化学法在3400DNA合成仪上合成。合成后用浓氨水55'C脱保护切割15h，用OPC柱纯化，紫外(UV-2400)定量。2.寡核苷酸芯片芯片制备2.1.制备氨基玻片将载玻片用强碱的乙醇溶液浸洗，双蒸水冲洗干净后，浸入赖氨酸的PBS溶液中包被，取出水洗，离心，烘干。室温放置2周。对欲点样的玻片在点样前进行扫描，剔除背景信号强度高、质量差的芯片。2.2.寡核苷酸芯片布阵将纯化探针用点样仪于玻片，分成4个区，每个区制成18X17矩阵。依据所要点样的片段个数，预先确定各oligo的点阵图，每个样品在芯片上各重复3次。同时设空白对照、阴性对照、阳性对照。2.3.基因芯片的点制寡核苷酸芯片由北京华大基因芯片提供，寡核苷酸探针以3XSSC溶解到浓度为40pmol/ul。用spotarray24型芯片点样仪按照预先布阵的方式，在玻璃片上确定要点样的位置和点样方式，调整点样参数。将寡核苷酸探针点到经氨基化处理的载玻片上，点间距离为230um，室温下于干燥器中放置一周，固化玻片上的寡核苷酸。2.4.基因芯片的后处理用1XSSC水化上述芯片，使芯片上的点均匀；通过紫外交联65raJ固定玻片上的寡核苷酸上的胸腺嘧啶脱氧核苷残基和玻片上氨基之间的共价键；使用1-甲基-2-吡格烷酮封闭芯片，降低非特异杂交点。三、寡核苷酸芯片制备将332个oligo按表2布阵所示点于氨基化玻片上制成寡核苷酸芯片1.合成332条oligo，其中包括9个阳性对照。另添加5个阴性对照，3个空白对照，以2X2布阵设置4个区(Block)，每个区中探针的排布顺序见表2;2.每个区域按18X17矩阵，每个区含有9个阳性对照，5个阴性对照，3个空白对照(见图l);3.每个样品在芯片上有3次重复(横向重复3个点)。表2芯片分区和探针在芯片上的排布顺序Block1Block2Block3Block4Blockll-34-67-910-1213-1516-181positive1positive2positive3blanknegativelnegative22oligo22oligo23oligo24oligo25oligo26oligo273oligo28oligo29oligo30oligo31oligo32oligo334oligo70o'ligo71oligo72oligo73oligo74oligo75oligo76oligo77oligo78oligo79oligo80oligo816oligoll8oligoll9oligol20oligol21oligol22oligol237oligol24oligol25oligol26oligol27oligol28oligol298positive4positive5positive6negative3bl肌koligol669oligol67oligol68oligol69oligol70oligol71oligol7210oligol73oligol74oligol75oligol76oligol77oligol7811oligo215oligo216oligo217oligo218oligo219oligo22012oligo221oligo222oligo223oligo224oligo225oligo26213oligo263oligo264oligo265oligo266oligo267oligo26814oligo269oligo270oligo271oligo272oligo273oligo30715oligo308oligo309oligo310oligo311oligo312oligo31316oligo314oligo315Negative.4negative5blankpositive717positive8positive9Block2l隱34-67-910-1213-1516-181positive1positive2positive3blanknegativelnegative22oligo46oligo47oligo48oligo49oligo50oligoSl93oligo52oligo53oligo54oligo55oligo56oligo574oligo94oligo95oligo96oligo97oligo98oligo99oligolOOoligolOloligol02oligol03oligol04oligol056oligol42oligol43oligol44oligo45oligol46oligol47了oligol48oligol49oligol50oligol51oligol52oligol538positive4positive5positive6negative3blankoligol909oligol91oligol92oligol93oligol94oligol95oligol9610oligol97oligol98oligol99oligo200oligol77oligol7811oligo239oligo240oligo241oligo242oligo243oligo24412oligo245oligo246oligo247oligo248oligo249oligo28613oligo287oligo288oligo289oligo290oligo291oligo29214oligo293oligo294oligo295oligo296oligo297oligo32515oligo326oligo327oligo328oligo329oligo330oligo33116oligo332blanknegative4negative5blankpositive717positive8positive9Block31-34-67-910-1213-1516-181positive1positive2positive3blanknegativelnegative22oligolOoligolloligol2_oligol3oligol4oligol53oligol6一oligol7oligol8oligol9oligo20oligo214oligo58oligo59oligo60oligo61oligo62oligo63oligo64oligo65oligo66oligo67oligo68oligo696oligol06oligol07oligol08oligol09oligollOoligolll了oligoll2oligoll3oligoll4oligoll5oligoll6oligoll78positive4positive5positive6negative3blankoligol549oligol55oligol56oligol57oligol58oligol59oligol6010oligol61oligol62oligol63oligol64oligol65oligo20211oligo203oligo204oligo205oligo206oligo207oligo20812oligo209oligo210oligo211oligo212oligo213oligo25013oligo251oligo252oligo253oligo254oligo255oligo25614oligo257oligo258oligo259oligo260oligo261oligo29815oligo299oligo300oligo301oligo302oligo303oligo30416oligo305oligo306negative4negative5blankpositive717positive8positive9Block41-34-67-910-1213-1516-181positive1positive2positive3blanknegativelnegative2oligo34oligo35oligo36oligo37oligo38oligo3930ligo40oligo41oligo42oligo43oligo44oligo454oligo82oligo83oligo84oligo85oligo86oligo8710<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实施例3人高转移肺巨细胞癌细胞系95D细胞株在寡核苷酸芯片的验证一、试剂准备所需的主要试剂按以下方法配制1.1640培养液RPMIuh。1袋，溶于800ml水，加入碳酸氢钠2g，补加水至1L，用盐酸调节pH至7.2，过滤除菌分装备用。2.0.25%胰蛋白酶称取胰蛋白酶O.125g，加水50ml，过滤除菌后分装，-20'C保存。3.TAE电泳缓冲液用242gTris碱，57.lml冰醋酸，37.2gNa2EDTA2H20，加水至1L，配成50X储存液，用时稀释50倍。4.DEPC水将500ulDEPC溶解于500ml蒸馏水中，37。C放置12h，高压蒸汽灭菌后备用。'5.10%SDS:在900ml水中溶解100gSDS，加热至68'C助溶，用浓盐酸调节PH至7.2，加水定容至1L，分装备用。6.杂交液(1250W):甲酰胺(785W)，10%SDS(50W)，50XDenhardt(100W)20XSSPE(315W)。7.封闭液(54(H4):聚去氧腺苷酸核苷酸Polyda(5Pg/vW(2014)，tRNA(鄭g/W，2(mi)。8.杂交舱液(1000rt):Ddwater(6,1)，20XSSC(,1)，甲酰胺(230W)。9.杂交后清洗液洗液A:1XSSC，0.2%SDS，洗液B:0.2XSSC，洗液C:0.1XSSC。二.复苏、培养与传代95D细胞1.液氮中取出装有95D细胞的冻存管，立即投入盛有37。C水的烧杯中，频繁搅动使其融化成悬液；2.加入10%BCSRPMI164。完全培养液5ml，轻轻吹打均匀后离心1000rpmX5min，弃上清；3.再次加入培养液5ml，轻轻吹打成悬液，离心1000rpmX5min，弃上清；4.加入培养液5ml，轻轻吹打成单细胞悬液，接种入培养瓶中，置于37'C、湿化5%0)2孵箱中培养，24h后更换培养液。5.孵箱中取出培养瓶，吸出培养液，PBS冲洗2遍，加入0.25呢胰酶0.5ml，37'C孵育2-3分钟；6.反复吹打贴壁细胞，将细胞悬液移至15ml离心管中。加入5mlPBS，离心1000rpmX5min，弃上清；7.再次加入5mlPBS，訓0卬mX5min，弃上清；8.加入l(^BCSRPM:U4。完全培养液10ml，轻轻吹打成单细胞悬液，分别移入2只培养瓶中，置于37。C、湿化5%0)2孵箱中培养。三.提取总RNA1.待细胞培养24小时，去除培养液；2.按每10cm2加2mlTRIzol试剂的比例加入TRIzol;3.缓慢旋转培养皿数次，使TRIzol试剂充分接触培养皿表面进行消化；4.转移到经过DEPC处理无RNA酶的1.5mlEppendorf管中，室温放置5分钟，使其充分裂解；5.随后于4'C、12，000g离心5分钟，弃沉淀；6.按每lmlTRIzol中加入200ul氯仿(预冷)，至匀浆液中，盖紧离心管盖，震荡混匀后，冰上放置15min;7.4°C，12000g，离心15min;8.小心取上层水相将其转移入一新的EP管中；9.按每lmlTRIzol加入0.5ml异丙醇(预冷)，轻轻颠倒混匀液体，在-20。C放置30min;10.4°C，12000g，离心10min，弃去上清；11.按每lmlTRIzol加入lml75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；12.4°C，8'000g，离心5min，小心弃上清，用吸水纸吸干；13.在室温，超净台内干燥沉淀5-10min;14.加入Rnase-free的水完全溶解RNA沉淀后，一7(TC保存。总RNA鉴定(a)RNA浓度测定在微量比色杯中加入98WDEPC处理过的双蒸水，再加入样品(稀释50倍)，用ND-1000紫外分光光度计测定各样品的0D，和0D28。值，根据下列公式计算RNA浓度RNA量(Pg/W)OD26。X40X稀释倍数/1000。(b)RNA纯度测定在微量比色杯中加入99ulDEPC处理过的双蒸水，再加入样品乂稀释100倍)，用ND-1000紫外分光光度计测定各样品的0D脚、0D28O和0D23。，计算0D26。/0D28。比值。当0D湖/0D28。为1.8-2.0，说明提取RNA纯度较高，无蛋白污染。(c)RNA的完整性检测应用1%琼脂糖电泳检测RNA样品完整性，取5ul样品，应用琼脂糖电泳分离总RNA后，观察到完整清晰的28S、18S的RNA条带，且28S:18S=2:1时，说明该RNA样品完整且未降解。如该比值逆转，表明有RNA降解，因为28SRNA可以特征性的降解为18S的RNA。(三)反转录法标记探针1.直接标记法将95D细胞用荧光Cy3或Cy5标记取2(^g总RNA(按照美国Invitrogen公司第一链合成试剂盒说明书进行操作)进行反应，反应步骤如下-.1.1.5mlRNase-free离心管中加入以下成分mRNA20Mg01igo(dT18)(2ug/ul)1.25W〕RNase-free7K10.5)4f1.2.将微量离心管置于热循环仪内，68'C孵育10分钟后，迅速取出置于冰上冷却5分钟，离心轻甩；1.3.在暗室中向管中分别加入下列成分-组分剂量腿sin0.5145Xfirststrandbuffer糾130.1MDTT低浓度dNTP混合液(AGT各10mM，C4mM)lmMCy3-dCTP/Cy5-dCTP混匀并短暂离心后，置于42'C孵育2分钟;1.4.向管中加入lpl的SuperScriptIIRNaseH反转录酶(200u/nl)，混匀后，仍置于42t:避光孵育2小时；1.5.加入O.5MEDTA5W〕1MNaOH10f4,孵育68。C，15min;1.6.冷却至室温，加入25W1MHEPES，以中和NaOH;两反应液混合(用于同一张芯片杂交的Cy3标记物和Cy5标记物)；1.7.补水至50(mi，用酚氯仿异戊醇(25:24:1)提取液抽提一次；10000rpm，离心5min,取上液；1.8.加入YM-30室温下，12000卬m离心8min纯化探针，使终体积为4)il;1.9.加入4.5W，2M乙醇胺室温作用15min，终止偶联。对偶联荧光素的产物进行回收纯化，并浓縮干燥。cDNA的鉴定及浓度测定取lul反转录产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳，估计产物大小判断探针质量。取1W稀释至IOOW，用ND-1000紫外分光光度计测其光密度0D2M、0D28。值，测定所得cDNA的浓度和荧光掺入率。cDNA的浓度50ng/W。2.间接标记法步骤(3)中不加Cy3-dCTP/Cy5-dCTP标记，先进行反转录；在步骤(5)之后而要上面每个浓縮的探针分别在水中溶解，加入1W1M碳酸氢钠(pH9.0)，然后分别用lulCy3或Cy5标记，室温孵育60分钟。其他步骤同直接标记法。(四)芯片杂交与清洗l.杂交l.l.配制杂交液-20承SSPE封闭剂0.1514PolydA0.杂交液探针加热到95'C，3ndn，以最快速度离心2min。1.2.12W的杂交体系加到芯片上，混匀95。C变性3min,13000rpm离心5min将杂交液加到芯片上42。C杂交箱温育16小时以上。2.清洗杂交后，使用洗液A(2XSSC,0.1%SDS)洗涤2次、各5min,洗液B(0.2XSSC,O.1%SDS)洗涤2次、各5min，洗液C(0.2XSSC)洗涤2次、各5min，将芯片离心，吹干(用电吹风吹干芯片上的液体)。(五)荧光信号检测和结果分析将处理好的芯片置于激光共聚焦荧光扫描仪ScanArray3000(GeneralScanningInt.)上，分别用Cy3和Cy5的光线进行扫描，调整光的扫描强度使结果达到最佳。扫描结果用Gen印ix5.1软件采集图片中数据进行分析。三、结果分析1.95D细胞总RNA.提取的95D细胞总RNA经W琼脂糖凝胶电泳后可以清晰的看到18SRNA、28SRNA(图2,其中第一道是95D1;第二道是95D2;第三道是95D3)，二者含量比值约为1:2，比例适当说明RNA没有降解。其0D湖/0D2s。均在1.9一2.0之间，说明质量较好。提取的RNA要求无DNA污染，否则就要用DNase酶处理或进一步纯化成m腿。2.基因芯片杂交结果用反转录法标记的95DD细胞的探针与芯片进行杂交，结果如图3、3.1和3.2所示图3为基因在同一张芯片上连续横向点点的情况，基因的平均CV值(变异系数)为10%;图3.1为95D1，95D2均用间接标记法，在一张芯片杂交结果；图3.2为均用Cy5标记，95D2用间接标记法，95D3用直接标记法的杂交结果。图3.2经数据分析发现，332个基因中有322个基因有较高的重复性，其3次间重复的相互比值在0.5和2.0之间；有6个基因具较差的重复性，其3次间重复的部分相互比值不在此范围内。因此，332个基因3次重复杂交的重复性为98.2%。实施例4本发明寡核苷酸芯片的临床验证本实施例对15例病理学检验明确诊断肺癌的患者采样进行本发明寡核苷酸芯片验证。其中肺鳞癌8例，均为男性；肺腺癌7例，男性4例，女性3例。对其中6例(鳞癌4例、腺癌2例)同时采取癌旁组织检验。癌组织和癌旁组织于手术分离后30分钟内冻存于液氮中。验证方法如下。一.按实施例3方法配制TAE电泳缓冲液、DEPC水、10%SDS、杂交液、封闭液、杂交舱液和杂交后清洗液。二.杂交荧光探针的制备1.总RNA的提取与鉴定按TRIZOLReagent总RNA提取说明书进行操作:将组织用锡箔纸包好，存放于液氮中，要使用的器具提前预冷。1.1.从液氮中取出冻存管，用消毒好的钳子钳出组织，用锤子迅速砸碎组织，加入少量液氮迅速研磨，待组织变软，再加入液氮，再研磨如此三次，使组织充分研碎，之后移入玻璃匀浆器中；1.2.加入TRIzol。用量为每50100mg组织加lmlTRIzol试剂；1.3.在匀浆器中使TRIaol与组织充分混合并进行匀浆；1.4.将组织匀浆全部移入已经经过DEPC处理无RNA酶的1.5mlEppendorf管中，室温放置5分钟，使其充分裂解；1.5.随后于4。C、12，OOOg离心5min，弃沉淀;1.6.按每lmlTRIzol中加入20014氯仿(预冷)，至匀浆液中，盖紧离心管盖，震荡混匀后，冰上放置15min;1.7.4°C，12,OOOg，离心15min;1.8.小心取上层水相将其转移入一新的EP管中；1.9.按每lmlTRIzol加入0.5ml异丙醇(预冷)，轻轻颠倒混匀液体，在-20。C放置30min;1.10.4°C，12000g，离心10min，弃去上清；1.11.按每lmlTRIzol加入lml75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；1.12.4°C,8,000g，离心5min，小心弃上清，用吸水纸吸千；1.13.在室温，超净台内干燥沉淀5-10min;1.14.加入Rnase-free的水完全溶解RNA沉淀后，一70。C保存。总RNA鉴定按实施例3方法进行RNA浓度测定和RNA的完整性检测。2.反转录法标记探针取20Pg总RNA(按照美国Invitrogen公司第一链合成试剂盒说明书进行操作)进行反应，反应步骤如下162.1.1.5mlRNase-free离心管中加入以下成分mRNA20PgOligo(d"U(2ug/W)1.25WRNase-free水10.5(42.2.将微量离心管置于热循环仪内，68'C孵育10分钟后，迅速取出置于冰上冷却5分钟，离心轻甩；2.3.在暗室中向管中分别加入下列成分组分剂量腿sin0.5Xfirststrandbuffer0:1MDTT低浓度dNTP混合液(AGT各lOmM，C4mM)lmMCy3-dCTP混匀并短暂离心后，置于42t孵育2分钟；2.4.向管中加入lHl的反转录酶(200u/Vl)，混匀后仍置于42'C避光孵育2將育68。C，15min;小时；2.5.加入O.5MEDTA5W1MNaOH鹏2.6.冷却至室温，加入25W1M服PES，以中和NaOH;两反应液混合(用于同一张芯片杂交的Cy3标记物和Cy5标记物)；2.7.补水至500W，用酚氯仿异戊醇(25:24:1)提取液抽提一次；10000r/min，离心5min，取上液；2.8.加入YM-30室温下，12000r/min离心8min纯化探针，使终体积为4t4;2.9.加入4.5W2M乙醇胺室温作用15min，终止偶联。对偶联荧光素的产物进行回收纯化，并浓缩干燥。cDNA的鉴定及浓度测定取lul反转录产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳，估计产物大小判断探针质量。取稀释至100ri，用紫外分光光度计测其光密度0D260、OD280值，测定所得cDNA的浓度和荧光掺入率。cDNA的浓度50ngAH。三、芯片杂交与清洗1.杂交方式l.l.选用同一肺鳞癌病人的癌和癌旁组织，同一肺腺癌病人的癌和癌旁组织，分别与该芯片进行杂交，进一步验证初步筛选出来的基因表达的差异性；1.2.随机选取8例鳞癌病人的癌组织分别与该芯片杂交，检查不同鳞癌病人间的一致性及内部存在差异基因；随机选取7例腺癌病人的癌组织分别与该芯片杂交，检査不同腺癌间的一致性及内部存在的差异基因；1.3.其中6例肺癌病人(2例腺癌、4例鳞癌)的癌旁组织分别与该芯片杂交;探针芯片同一肺鳞癌病人/肺腺癌病人7例肺腺癌病人8例肺鳞癌病人6例肺癌病人癌组织癌旁组织癌组织癌组织癌旁组织寡核苷酸基因芯片XXXXX2.杂交2.1.按实施例3方法配制杂交液。2.2.12ri的杂交体系加到芯片上，混匀95X:变性3min，13000rpm离心5min，将杂交液加到芯片上42"温育16小时以上。3.清洗杂交后，使用洗液A(2XSSC,0.1%SDS)洗涤2次、各5min，洗液B(0.2XSSC，O.1%SDS)洗涤2次、各5min，洗液C(0.2XSSC)洗涤2次、各5min，将芯片离心，吹干。四、荧光信号检测和结果分析1.信号检测将经严格洗片后的杂交芯置于激光共聚焦荧光扫描仪ScanArray3000(GeneralScanningInt.)上，分别用Cy3和Cy5的光线进行扫描，调整光的扫描强度，过滤背景噪声，使结果达到最佳，获得荧光信号图像。用预先选定的内参照对Cy3/Cy5的原始信号进行均衡和修正。2.结果分析用Gen印ix5.1软件对图像进行处理，分析Cy3和Cy5两种荧光信号的强度和比值，获得两种组织中差异表达的基因信息。用以下条件作为差异表达的标准(1)Cy5/Cy3的自然对数的绝对值〉0.69(Cy3和Cy5信号相差两倍以上)；(2)Cy3/Cy5的信号灰度值，比其背景值必须大于2倍。Cy5/Cy3比值<0.5为表达下调，比值〉2.0为表达上调。同时MADS软件对15例肺癌和其中6例肺癌病人(2例腺癌、4例鳞18癌)的癌旁组织基因表达谱进行非监督聚类分析。五.结果1.组织总RNA的提取病理组织的RNA经电泳进行了完整性鉴定，图4、图4.1、图4.2所示部分样本RNA电泳结果，可以看出大部分RNA都具有较好的完整性。2.表达芯片杂交结果2.1.同一肺鳞癌病人癌组织和其癌旁组织、同一肺腺癌病人癌组织和其癌旁组织与该芯片进行杂交(见图5)。由于Cy3荧光信号和Cy5荧光信号分别以绿色和红色表示。因此，对于某一点的两种叠加荧光信号，如果Cy3信号较强，该点多显绿色(呈下调趋势)代表该基因在癌组织中高表达，而在癌旁组织中低表达；如果Cy5信号较强，该点多显红色(呈上调趋势)代表该基因在癌组织中低表达,而在癌旁组织中高表达；如果强度相似，即显示黄色。该图反映了芯片上每条基因在癌组织和癌旁组织中表达丰度的差异。2.2.基因芯片杂交信号散点图如图7所示。X轴以Cy3荧光强度值为坐标，Y轴以Cy5荧光强度值为坐标，每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号。45。C对角线是基因表达稳定不变的区域，代表Y与X的比值在0.52.0之间，基本属非差异表达。远离这条线的点代表Y值与X值的比值在0.52.0范围之外，说明在表达芯片上的信号差异表达量大于2倍(很可能是有表达差异的数据)。2.3.8例鳞癌病人的鳞癌组织分别与该芯片杂交，检查不同鳞癌病人癌组织间的异质性；7例腺癌病人的腺癌组织分别与该芯片杂交，检查不同腺癌病人癌组织间的异质性，见自8、图9杂交结果。2.4.6例肺癌癌旁组织与芯片杂交结果如图10所示。3.数据分析结果3.1.1例鳞癌组织和其癌旁组织与芯片杂交，表达上调的基因有4条，表达下调的基因156条。见表3、4。1例腺癌组织和其癌旁组织杂交，表达上调的基因有23条，表达下调的基因147条。见表5、6。3.2.差异表达基因通过GeneBank进行生物信息学分析，主要分为以下几类-①癌基因wnt4、c-fos;②细胞周期调控基因SPP1，CDK4;③肿瘤增殖、转移基因pro-alpha-ltypecollagen,collagenalpha-2，PAI-1。3.3.非监督聚类方法用于对15例样本、332个基因进行分组，样本以树状形式总体描述，树枝长度反映出样本的相关性，5例肺腺癌和5例肺鳞癌被分在一组，2例中低分化的鳞癌分在一组(见图ll，其中X代表腺癌，L代表鳞癌，P代表癌旁组织)。3.4.7例腺癌组织对332个基因表达的一致性在52-92%之间(见表7)。对其两两比较，共获得21个比较组。其中有5组(23%，5/21)之间的相似性在50-60%之间;有9组(42.9%，9/21)之间的相似性在60-70%之间；有4组(19%,4/21)之间的相似性在70-80%之间，有2组(9.5%，2/21)之间的相似性在80-90%之间，有一组(5%,1/21)之间的相似性在90%以上。3.5.8例鳞癌组织对332个基因的一致性在55-97%之间(见表8)。对其两两比较，共获得28个比较组。其中有11组(39%，11/28)之间的相似性在50-60%之间；有8组(28.6%，8/28)之间的相似性在60-70%之间;有3组(10.7%,3/28)之间的相似性在70-80%之间，有4组(14.3%，4/28)之间的相似性在80-90%之间，有2组(7.1%，2/28)之间的相似性在90%以上。3.6.7例肺腺癌组织的共有差异基因29个，与鳞癌组相区别的有7个如DCTN2、Stst2、BRCA2、TGFD等；8例肺鳞癌组织的共有差异基因46个，与腺癌组相区别的有24个，如KRT6A、HMGB2、lumican等。肺腺癌组织和肺鳞癌组织对Bax、Myb、EGR1等22个基因都表达。(见表9)3.7.本实施例15例样本以外，新收集1例肺癌组织与芯片杂交后，与7例肺腺癌的相似性63%，与8例肺鳞癌的相似性49%，最终的病理诊断证实确为肺腺癌。表3肺鳞癌与其癌旁组织比较表达上调的基因<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表4肺鳞癌与其癌旁组织比较表达下调的基因(部分)基因编号基因名称GeneBankCy5/Cy3148PAI-1NM—000602.10.01184Antigenpeptidetransporter2NM—000544.30.02175Uracil-DNAglycosyiase(腦)NM—003362.20.02159wnt—4NM—030761.30.03表5肺腺癌与其癌旁组织比较表达上调的基因(部分)基因编号基因名称GeneBankCy5/Cy3238S100P—AA131149AA131149.123.64190SPP1NM—000582.211.0742rearrangedIgk即palightchainvariableregionX72475.16.3475pro-alpha-ltype3collagenX14420.15.03200c脆fromcloneDKFZp564H191AK026634.12.43265TOPIIBX680602.11表6肺腺癌与其癌旁组织比较表达下调的基因(部分)基因编号基因名称GeneBankCy5/Cy3153Opioidreceptor,kappa1NM—000912.30.0228advancedglycosylationendproduct-specificreceptorAGERNM—001136.30.03127CK19NM—002276.30.03184Antigenpeptidetransporter2NM—000544.30.05148PAI-lNM—000602.10.05159wnt-4NM—030761.30.06表77例腺癌组织相互之间异质性分析结果X2X3X4X5X6X7XI67%64%64%52%57%55%X260%74%55%67%92%21X382%65%77%61%X466%75%76%X587%57%X665%表88例鳞癌组织相互之间异质性分析结果L2IJ97%50%82%52%57%61%55%55%跳63%55%70%52%62%67%88%75%89%65%58%59%51%61%56%53%65%93%65%表9.腺癌、鳞癌的共有差异基因及二者之间差异基因基因编号基因名称腺癌共有差异基因腺癌、鳞癌之间差异基因鳞癌共有差异基因14Solutecarrierfamily2716Zd36cll.sl(TGFBR2)V36P50a(DCTN2)(PIGPC1)61CENPM(LAMB2)V160Stat2V201BRCA2V331TGFV192Alpha-2-macroglobulin207BaxV248Beta-2-microglobuIin199cDNAfromcloneDKFZ564H191223Collagenalpha-2V246HLA-AV247HLA-B114FLJ22883fisV22212MDR213Myb'V42RearrangedIgkappalightchainvarizbleregion101RPL23V119LOCI54336200TI-227H65UBC291CX43294EGRl304KLF6321TGFV256GST-n257HSPBlV259MDM270LAMB2208CDK4V137c陽fos127Ckl9V17HMGB2111Zetal108EEFIAIV228KRT6A131lumicanV26NCI-CGAP-Lul135N-myc49ODCl92POLR2GV53RB-bindingproteinV224SmallcelllungcarcinomaepithelialantigenV312Mmp9、V292Cx4323<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表1.332条01igo探针的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>本说明书使用了若干英文縮略词。对其中在生物学领域常用的英文縮略词的中文词义注解如下英文缩写英文全称中文词义DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸RNARibonucleicacid核糖核酸cDNAComplementaryDNA互补脱氧核糖核酸PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液SDSSodiumdodecylsulphate十二烷基硫酸钠SSCSaline-SodiumCitrateBuffer氯化钠柠檬酸钠缓冲液DEPCD他ylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯RnaseRibonuclease核糖核酸酶DTTD他iothreitol二硫苏糖醇TrisTrishydroxymethylaminonethane三P5甲基氨基甲'廣GTPGuanosinetriphosphate三憐酸鸟昔DMSODimothylsulfoxide.二甲基亚砜HEPEShydroxyethylpiperazineethanesulfonicacid羟乙基哌嗪乙磺酸BCSBovinecalfserum小牛血清，RPMI1640RosewellparkmemorialinstituteRPMI1640培养液1640mediumOPColigonucleotidepurification寡核苷酸纯化试齐!j盒catridgeBpBasepair碱基对CVCoefficientofvariation变异系数ODOpticaldensity光密度rpmRevolutionperminute每分钟转速40肺癌分型基因序列表序列表〈110>中国人民解放军总医院<120>肺癌分型的基因序列及其应用〈140〉200810212208.4<141>2008-09-05<160>332〈170〉Patentlnversion3.1〈210>1〈211〉60〈212>DNA〈213>人类(Homosapiens)〈400〉1cggagcgtggttactcgttcacgaccacggccgagcgcgaaattgtgcgggacatcaagg60<210>2〈211>60〈212>薩〈213>人类(Homosapiens)<400〉2agcacttttacgggtggggggagggagtgttctgctggtctccaattaccaagaattctc60<210>3<211>60<212>DNA〈213>人类(Homosapiens)〈400>3aggctctagctctgggccctccttcagcccccatcatgggaataaattaattttctcaat60〈210〉4<211>60〈212>DNA<213>人类(Homosapiens)<400>4gaatccaaatgagctctagacattatcacagactgaatagatcttaactgtctcctacat60<210>5〈211〉60〈212〉DNA〈213>人类(Homosapiens)<400>5tctgcactatagccatttgccccaacttaagtttagaaattacaagtttcagtaatagct60〈210>6<211〉60<212>薩〈213>人类(Homosapiens)<400>6agtcacatcctgggatccagtgtataaatccaatatcatgtcttgtgcataattcttcca60肺癌分型基因序列表〈210>7<211>60<212>DNA<213〉人类(Homosapiens)〈400〉7gctgaaagctagacctttggtattttccatgctataattcttatggctgctgaaatgtgt60〈210〉8〈211>60〈212>醒<213>人类(Homosapiens)〈400>8ccccttg卿aggggaggggcctagggagccgcaccttgtcatgtaccatcaataaagta60〈210〉9〈211>60〈212〉DM<213〉人类(Homosapiens)〈400>9agcaatcctaggtagggtttaatccccagtaaaattgccatattgcacatgtcttaatga60〈210〉10〈211〉60<212>DNA〈213〉人类(Homosapiens)<400>10aacggag卿tgattctgagacaccacgaggacatgc鄉tgg鄉agtgcggatgcctg60〈210>11〈211〉60<212>腿〈213〉人类(Homosapiens)〈400>11aactgggcctgtggagttgcccgtgtcccaggggtagtcgaggccgtacgggattgataa60<210〉12<211〉60<212>DNA〈213>人类(Homosapiens)<400>12ccaggaatacacataagagcaaaaatgctattctacaatatcctcatcttaccagctcac60〈210>13<211〉60<212>赚〈213>人类(Homosapiens)<400〉13tctccacgctgcctctggaggtcaggagaaaactatgtggcttccctaacacagacaggg60〈210〉14<211〉60<212>腿<213〉人类(Homosapiens)肺癌分型基因序列表〈400〉14cactattttgtaataaatgtggctggagctgatccagctgtctctgacctacaaaaaaaa60〈210〉15<211>60<212>DNA〈213>人类(Homosapiens)<400>15ggtggaaaacttttgtatccctaagcatattattttatagtgtctgccatgccatgtgga60<210>16〈211〉60<212〉醒〈213〉人类(Homosapiens)〈220〉<221>miscfeature〈222〉(38):—.(38)<223〉nisa，c，g，ort〈400〉16tctagactggt卿gccgagccaccggtgagaagcaanggacagcagcaggaagagccat60〈210〉17〈211>60〈212〉隨〈213>人类(Homosapiens)〈400〉17gc鄉ttgtagcttt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