专利名称：一种短双链干扰rna的生成方法
技术领域：
本发明涉及一种短双链干扰RNA的生成方法，特别是一种以T7RNA聚合酶催化体外转录合成短双链干扰RNA，然后采用的酚一氯仿抽提法获得高纯度的短双链干扰RNA的生成方法，属于生物、基因工程技术领域。
背景技术：
RNA干扰是一种由小双链RNA有效地作用于同源RNA序列诱发的〃 基因沉默〃 。在此过程中，经细胞内核酸酶作用使与双链RNA有同源序列的信使RNA被降解，从而抑制了致病基因的表达。RNA干扰技术在探查基因功能和治疗人类疾病方面有广阔的应用前景，在肝炎，艾滋病，癌症，糖尿病，肥胖等多种疾病治疗和药物开发方面预期有突破性的进展。
实施RNA干扰技术主要有合成干扰用双链RNA、双链RNA导入细胞或体内、RNA干扰效应的检测和观察三部分内容，而获得双链RNA是进行RNA干扰研究的首要步骤。目前获得双链干扰RNA主要有三种办法，即化学合成法、体外转录法和体内转录法。由于化学合成法的造价太高一般不被采用；体内转录法的基本思路是先在体外构建能表达双链RNA的载体，再将载体转移到细胞内由细胞自发转录生成双链RNA，这样在长期稳定表达载体的细胞株中，双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用。虽然体内转录法有明显的优势，但仍局限于少数物种和细胞系，载体表达效率及其作用规律还在研究之中。体外转录法有多种形式，但基本作法是以目标基因mRNA上的一段同源DNA序列为模板，并将其同T7启动子引物褪火结合，然后在T7RNA聚合酶的作用下转录成RNA，两个互补的RNA褪火结合成双链RNA，但设计是基于38个碱基的寡核普酸转录模板上完成的，其5'端开始的2个碱基是随机选取的，其结果转录出的RNA3'端末尾2个碱基也是随机的。而且，合成的短双链RNA仅仅直接用乙醇沉淀后溶解，未进行任何的提纯。因此大大降低了目标基因的表达。
发明内容
本发明的目的在于在于克服现有技术中的不足，提供一种操作简便、成本低、目标基因表达效率高的短双链干扰RNA的生成方法，为大范围、高通量进行RNA干扰研究提供短双链干扰RNA合成方法。 本发明是通过以下技术方案实现的，本发明的方法流程如下
1、目标基因干扰位置的选择 在互联网生物数据库GenBank上查询要干扰基因的mRNA序列，在启始密码子(ATG) 75个碱基后寻找AAG开始的20个碱基序列作为目标基因序列。
2、 DNA寡核昔酸链的设计与合成 设计合成一条T7启动子DNA寡核苷酸链(18bP)， 一条含AAG开始的目标基因正向序列(20bp)和T7启动子反向互补序列(18bP)的DNA寡核苷酸链(38bP)， 一条含从G开始的目标基因反向序列(20bp)和T7启动子反向互补序列(18bP)的DNA寡核苷酸链(38bp)。
合成首先18个碱基的T7启动子DNA寡核苷酸同38个碱基的DNA寡核苷酸(含目标基因同源序列和T7启动子寡核苷酸互补序列)退火形成双链DNA，再在T7RNA聚合酶
作用下转录生成短双链RNA。 3、双链DNA模板形成和体外转录 将合成的T7启动子DNA寡核苷酸链分别同含目标基因正、反向序列和竹启动子反向互补序列的DNA寡核苷酸链，先在95t:下变性5分钟，然后缓慢降温便得到T7启动子互补的双链DNA，其中目标基因序列为单链。
4、短双链干扰RNA的分离、提纯 首先在短双链干扰RNA的分离、提纯过程中增加了酚/氯仿抽提步骤，采用了酚/氛仿法对合成产物进行了提纯，然后采用无水冷乙醉沉淀RNA，用70%的冷乙醇清洗沉淀后自然干燥，用40 iU PBS溶解，在反应体系每次可获得20-40 ii g短双链干扰RNA。
本发明的有益效果 本发明获得的短双链干扰PNA能够有效地敲低外源报告基因一绿荧光蛋白表达载体的表达，而且导入细胞的短双链干扰RNA没有非特异性免疫反应。本发明在38个碱基的寡核苷酸转录模板设计上有很大改动，既5'端开始的2个碱基选取2个腺嘌呤，其结果转录出的PNA3'端末尾2个碱基是尿嘧啶。当转录出的正、负两条单链RNA 火形成双链RNA时，两端各垂悬的尿嘧啶。许多RNA干扰研究认为，这种结构的双链RNA及其同RNA聚合酶111 、 RNA解旋酶等结合形成复合物更容易同目标基因的mRAN结合并切断它，从而更有效地敲低目标基因的表达。另外，文献对合成的短双链RNA直接用乙醇沉淀后溶解，未进行任何的提纯。本发明操作简单、成本低、效率高，为大范围、高通量进行RNA干扰研究提供了短双链干扰RNA合成方法。
具体实施例方式
实施例l 本发明的方法流程如下 1、目标基因干扰位置的选择 在互联网生物数据库GenBank上查询要干扰基因的mRNA序列，在启始密码子(ATG) 75个碱基后寻找AAG开始的20个碱基序列作为目标基因序列。
2、DNA寡核昔酸链的设计与合成 设计合成一条T7启动子DNA寡核苷酸链(18bP)， 一条含AAG开始的目标基因正向序列(20bp)和T7启动子反向互补序列(18bP)的DNA寡核苷酸链(38bP)， 一条含从G开始的目标基因反向序列(20bp)和T7启动子反向互补序列(18bP)的DNA寡核苷酸链(38bp)。
合成首先18个碱基的T7启动子DNA寡核苷酸同38个碱基的DNA寡核苷酸(含目标基因同源序列和T7启动子寡核苷酸互补序列)退火形成双链DNA，再在T7RNA聚合酶作用下转录生成短双链RNA。 在转录时，T7启动子DNA寡核苷酸链5' — 3'的最后一个碱基G，在转录时被T7RNA聚合醉纳入RNA序列，即转录生成的RNA的第一个碱基是G。另由于把38个碱基DNA寡核苷酸链5'端前3个碱基设计为AAG，转录生成的RNA第19、20、21个碱基为CUU。因此，转录的结果是转录生成的正向、负向RNA单链5'端均以G开始，3'端均以CUU结尾，其它碱基序列互补。当正向、负向RNA单链混合退火时形成碱基互补、两端各有2个悬垂UU的短双链RNA。这种结构是进行RNA干扰所希望的。
3、双链DNA模板形成和体外转录 将合成的T7启动子DNA寡核苷酸链分别同含目标基因正、反向序列和竹启动子反 向互补序列的DNA寡核苷酸链，先在95t:下变性5分钟，然后缓慢降温便得到T7启动子互 补的双链DNA，其中目标基因序列为单链。 在转录反应体系中，分别以两条含双链T7启动子和单链目标基因正、反向序列的 DNA链为模板，T7RNA聚合酶在双链T7启动子引导下，以三磷酸核苷混合物(rNTP)为原料， 分别转录合成正向单链RNA和反向单链RNA，此时的转录产物为DNA和RNA杂合物。为了获 得单链RNA，实验用DNA I酶降解反应体系中的DNA，分别获得了正向单链RNA和反向单链 RNA。将获得的正向单链RNA和反向单链RNA混合后在95 °C下变性5分钟，37 °C孵育1小时 后便获得短双链RNA。
4、短双链干扰RNA的分离、提纯 首先在短双链干扰RNA的分离、提纯过程中增加了酚/氯仿抽提步骤，采用了酚/ 氛仿法对合成产物进行了提纯，然后采用无水冷乙醉沉淀RNA，用70%的冷乙醇清洗沉淀 后自然干燥，用40 iU PBS溶解，在反应体系每次可获得20-40 ii g短双链干扰RNA。
权利要求
一种短双链干扰RNA的生成方法，其特征在于本发明的方法流程如下(1)目标基因干扰位置的选择在互联网生物数据库GenBank上查询要干扰基因的mRNA序列，在启始密码子(ATG)75个碱基后寻找AAG开始的20个碱基序列作为目标基因序列。(2)DNA寡核昔酸链的设计与合成设计合成一条T7启动子DNA寡核苷酸链(18bP)，一条含AAG开始的目标基因正向序列(20bp)和T7启动子反向互补序列(18bP)的DNA寡核苷酸链(38bP)，一条含从G开始的目标基因反向序列(20bp)和T7启动子反向互补序列(18bP)的DNA寡核苷酸链(38bp)。合成首先18个碱基的T7启动子DNA寡核苷酸同38个碱基的DNA寡核苷酸(含目标基因同源序列和T7启动子寡核苷酸互补序列)退火形成双链DNA，再在T7RNA聚合酶作用下转录生成短双链RNA。(3)双链DNA模板形成和体外转录将合成的T7启动子DNA寡核苷酸链分别同含目标基因正、反向序列和竹启动子反向互补序列的DNA寡核苷酸链，先在95℃下变性5分钟，然后缓慢降温便得到T7启动子互补的双链DNA，其中目标基因序列为单链。(4)短双链干扰RNA的分离、提纯首先在短双链干扰RNA的分离、提纯过程中增加了酚/氯仿抽提步骤，采用了酚/氛仿法对合成产物进行了提纯，然后采用无水冷乙醉沉淀RNA，用70％的冷乙醇清洗沉淀后自然干燥，用40μl PBS溶解，在反应体系每次可获得20-40μg短双链干扰RNA。
全文摘要
一种短双链干扰RNA的生成方法涉及一种以T7RNA聚合酶催化体外转录合成短双链干扰RNA，然后采用的酚一氯仿抽提法获得高纯度的短双链干扰RNA的生成方法，属于生物、基因工程技术领域。本发明提供一种操作简便、成本低、目标基因表达效率高的短双链干扰RNA的生成方法。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明的方法流程如下(1)目标基因干扰位置的选择；(2)DNA寡核昔酸链的设计与合成；(3)双链DNA模板形成和体外转录；(4)短双链干扰RNA的分离、提纯。
文档编号C12N15/10GK101748115SQ20081022959
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月11日 优先权日2008年12月11日
发明者肖懿 申请人:肖懿