专利名称：针的制作方法
技术领域：
本发明涉及作用于单细胞的针。
背景技术：
在国际公开第04/092369号小册子中，公开了将遗传基因等的导入物质导入到细 胞内的显微注射方法及装置。在该公开的技术中，首先使导入物质电吸附在作为刀头部的 微细针的前端上，使该微细针侵入到细胞内。接着，通过对该微细针施加脉冲电压，使导入 物质从微细针前端脱离，导入到细胞内。这里，微细针向细胞内的侵入通过使用与微细针同 轴伸缩的压电元件使微细针微动来进行。这样的技术是将遗传基因保持在微细针前端部上 的方式，能够以对细胞的低侵害来导入遗传基因，能够得到较高的生存率。但是，微细针向细胞内的侵入容积是微小的，此外，细胞膜具有流动性。因此，即使 微细针的前端移动到了认为是侵入到了细胞内的位置，也有细胞膜流动性地覆盖针部的表 面、不能贯通细胞膜的情况。因此，具有刀片驱动不稳定、不能得到良好的导入率的缺点。
此外，在上述文献中公开的技术中，不能够通过对微细针通电而给细胞带来电刺 激而高效率地观察活着的细胞。
发明内容
本发明是鉴于上述问题而做出的，目的是提供一种具备刀头部的针，在以低侵害 将生存率维持得较高的的同时，能够将物质以高效率导入到细胞中，或者能够给细胞带来 电刺激而高效率地观察活细胞。根据本发明的一技术方案，提供一种针，该针作用于单细胞，具备悬臂刀片，包括 具有柔性的支撑部、以及相对于上述支撑部形成为规定角度的刀头部；以及轴，与上述悬臂 刀片连接；能够将上述刀头部至少经由上述轴安装到能够沿规定方向移动的刀片驱动装置 上。
图1是表示安装有本发明的第1实施例所涉及的针的刀片驱动装置的整体结构 图。图2是表示刀片驱动装置的特征部的结构的图。图3是表示第1实施例所涉及的针的结构的图。图4是用于说明针的角度所引起的干涉的图。图5是用于说明针的可动范围的图。图6是表示安装有第1实施例所涉及的针的刀片驱动装置的电气结构的框图。图7是表示用于说明使用第1实施例所涉及的针的刀片驱动方法的流程图的图。图8是表示通过第1实施例所涉及的针刚刚将表达GFP荧光蛋白质的遗传基因导 入到HelaS3细胞中之后的显微镜图像的图。
图9是表示通过第1实施例所涉及的针将表达GFP荧光蛋白质的遗传基因导入到 HelaS3细胞中经过24小时后的相位差观察显微镜图像的图。图10是表示通过第1实施例所涉及的针将表达GFP荧光蛋白质的遗传基因导入 到HelaS3细胞中经过24小时后的荧光观察下的显微镜图像的图。
具体实施例方式以下，参照
用于实施本发明的优选的实施方式。[第1实施例] 如图1所示，本发明的第1实施例所涉及的针10经由刀片驱动装置14安装在用 于观察细胞的倒置显微镜12上而使用。倒置显微镜12具备照明装置16、显微镜XY载物台18、显微镜XY载物台手柄20、 未图示的物镜、以及目镜22。照明装置16对收容有细胞的皿24上的细胞进行照明。显微 镜XY载物台18将上述皿24沿X方向及Y方向移动。显微镜XY载物台手柄20驱动上述 显微镜XY载物台18。物镜及目镜22是用于观察在皿24上的细胞中反射或透射的光、或者 从细胞产生的荧光的光学系统。上述皿24至少其底面由透明的材料、例如玻璃形成，以便 能够进行细胞的观察。另外，这里说明了手动操作的倒置显微镜12，但也可以是通过计算机驱动控制显 微镜XY载物台18的电动的倒置型显微镜。进而，也可以是具备CCD摄像机等、在监视器上 显示观察图像那样的倒置型显微镜。此外，上述照明装置16具备透射照明光源26、聚光透镜28、以及反射照明光源30。 透射照明光源26从与上述目镜22相反一侧对上述皿24上的细胞照射照明光。聚光透镜 28将从上述透射照明光源26发出的照明光聚光在细胞上。反射照明光源30从与上述目镜 22相同的方向对上述皿24上的细胞照射照明光。并且，刀片驱动装置14由装置主体32、显微镜适配器(adapter) 34、以及操作模组 36构成。显微镜适配器34是上述装置主体32的向聚光透镜28安装的安装部。在图1中， 表示了在设有目镜22的一侧即倒置显微镜12的前面侧、将装置主体32安装在聚光透镜28 的右侧的状态。操作模组36经由未图示的线缆连接在上述装置主体32上，能够设置在任 意的位置上。上述装置主体32具备适配器保持部38、Z驱动部40、以及针尖XY调节旋钮42。 具备作为驱动对象的刀头部44的本实施例所涉及的针10安装在适配器46上。安装有这 样的针10的适配器46安装在上述适配器保持部38上。Z驱动部40通过将上述适配器保 持部38沿Z方向移动，使上述刀头部44沿Z方向移动。针尖XY调节旋钮42通过将上述 适配器保持部38沿X方向及Y方向移动，来调节上述刀头部44的XY位置。这里，适配器保持部38如图2所示，具有用于经由未图示的XY驱动机构(针尖XY 调节旋钮42通过该驱动机构驱动适配器保持部38)安装在Z驱动部40的未图示的直线移 动机构上的Z轴驱动部安装部48。进而，适配器保持部38在与上述Z轴驱动部安装部48 在长度方向的相反侧，具有用于拆装自如地安装上述适配器46的安装部件。作为该安装部 件，例如如果上述适配器46是金属制或在对应的部位上设有金属部的结构，则是磁铁50。 另外，在图2中，适配器保持部38的单点划线的右侧是收容在装置主体32内的部分。艮口，上述磁铁50设在作为装置主体32外部的位置上。此外，在该磁铁50的附近，为了适配器 46的定位，配设有用于与设在适配器46上的孔或槽嵌合的嵌合部52。嵌合部52朝向倒置 显微镜12的前面侧突出，适配器46从该前面侧插入而能够进行安装。另外，也可以在适配器保持部38的背面侧也设置磁铁50及嵌合部52，以便在装置主体32安装在聚光透镜28的左侧时也能够安装适配器46。或者，也可以构成为能够根据 装置主体32的安装位置更换适配器保持部38。安装在上述适配器46上的本实施例所涉及的针10如图3所示，由悬臂刀片54和 用于保持该悬臂刀片54的轴56构成。在悬臂刀片54上形成有上述刀头部44。该悬臂刀 片54与轴56的前端连接。上述悬臂刀片54通过硅加工制造而成，由硅基部58、柔性的杆部60、以及上述刀 头部44构成。硅基部58是与其他部分即上述轴56的连接用的部分。杆部60从上述硅基 部58延伸，例如厚度是2. 7 μ m，长度是240 μ m,具有2N/m左右的弹性常数。上述刀头部44 在这样的杆部60的自由端上相对于该杆部60的长度方向以大约90度的角度形成。本实施例所涉及的针10首先插入固定到在适配器46上开设的未图示的孔中，然 后将安装着该针10的适配器46安装到装置主体32上。通过这样，能够更换基本上更换频 率较高的构成品(消耗品)即针10，不会污染而能够反复使用该刀片驱动装置14。一般，如果做成将悬臂刀片54 —边直接用手拿持一边对装置主体32进行直接安 装的结构，则根据上述杆部60的尺寸也可知，由于悬臂刀片54整体很小，所以其作业性可 以说很差。在本实施例中，构成为将形成有刀头部44的悬臂刀片54连接在用于保持该悬 臂刀片54的轴56的前端，轴56具有充分的长度(至少达到适配器46的长度)。因此，通 过一边用手拿持该轴56 —边进行作业，与一边用手拿持上述悬臂刀片54 —边进行作业的 情况相比，能够提高其作业性。此外，在本实施方式中，构成针10的悬臂刀片54和轴56由不同的部件构成。它 们的连接既可以通过经由规定的接合部件粘接(固接)进行以成为一体，也可以经由规定 的拆装机构进行以便拆装自如。前者能够使针10整体的结构变得简单，后者能够有效地灵 活使用相同的轴56。进而，在本实施例中，轴56具有足够细的形状(至少是不妨碍倒置显微镜12具有 的规定功能的形状)。因此，能够不使倒置显微镜12具有的规定功能(照明功能等)下降 而实现上述作业性的提高。另外，适配器46构成为，在将其安装在装置主体32上时，以规定角度朝向斜下方 对针10的轴56进行保持。此外，悬臂刀片54粘接在轴56上以相对于该轴56成为规定的 角度。进而，如上所述，刀头部44设置为，使其沿相对于杆部60的长度方向交叉的方向延 伸。因而，在适配器46安装在装置主体32上的状态下，刀头部44被保持为在杆部60的自 由端使前端朝向大致铅直方向下方。关于上述适配器46保持轴56的固定角度，如以下这样决定。即，如图4中赋予标 号62表示那样，如果将轴56抬起过高，则会与聚光透镜28干涉。如果设针10的长度为例 如50mm，则如果将轴56抬起超过60度就会与聚光透镜28干涉。此外，相反如果将轴56放 倒过多，则如图4中赋予标号64表示那样，会与皿24的侧壁干涉。一般，在细胞培养中使 用的频率较高的35mm玻璃底皿的情况下，如果比30度进一步放倒，则会与皿24的侧壁干涉。因而，在本实施例中，将上述适配器46保持轴56的固定角度设定为作为30度至60度 的中间的45度。在设定为通过适配器46以45度的角度保持轴56的情况下，能够得到图5的单点 划线所示那样的可动范围66。上述35mm玻璃底皿的玻璃面(Φ 14mm左右)能够不与聚光 透镜28及皿24的侧壁干涉而进行作业。 这样，适配器46保持轴56的固定角度考虑到与聚光透镜28和使用的皿24的干 涉而决定，以对针10赋予充分的可动范围66。并且，在适配器46上，为了插入固定针10， 通过以该固定角度保持轴56那样的角度来形成未图示的孔。另一方面，刀片驱动装置14的操作模组36如图1所示，具备Z调节用手柄68、速 度设定拨盘70、微调(上)按钮72、微调(下)按钮74、移动量设定拨盘76、以及Z值设置 按钮78。Z调节用手柄68及速度设定拨盘70用于适配器保持部38的粗调的Z方向的移动 (mm单位)。通过Z调节用手柄68的旋转操作，根据其旋转方向使用上述Z驱动部40将适 配器保持部38向Z方向驱动。速度设定拨盘70以大、中、小的3个等级切换设定与Z调节 用手柄68的旋转操作对应的的驱动量。此外，微调按钮72、74及移动量设定拨盘76用于适配器保持部38的细微的Z方 向的移动(4 111单位)。通过微调(上)按钮72或微调(下)按钮74的操作，对应于其按 钮而使用上述Z驱动部40将适配器保持部38沿Z方向微小地驱动。移动量设定拨盘76 以大、中、小的3个等级切换设定与1次微调按钮72、74的开启操作对应的微小驱动量。Z值设置按钮78是用于进行对Z方向任意的位置进行存储的指示的按钮。使得 即使操作上述Z调节用手柄68或上述微调按钮72、74，适配器保持部38也不会下降到比 由该Z值设置按钮78存储的位置靠下(皿24内的试样的方向)。另外，该Z值设置按钮 78具备未图示的离合器机构，如果操作者进行按下操作即开启操作，则在再次进行按下操 作之前维持该按下状态即开启状态。以后，将Z值设置按钮78为关闭状态下的Z调节用手 柄68及微调按钮72、74的操作称作“第1模式”，将Z值设置按钮78为开启状态下的Z调 节用手柄68及微调按钮72、74的操作称作“第2模式”。关于本实施例所涉及的刀片驱动装置14的电气结构，如图6所示，装置主体32除 了上述Z驱动部40以外，还具备用于检测适配器保持部38的位置的位置检测部80。作为 该位置检测部80，既可以光学地直接检测适配器保持部38的位置，也可以通过检测Z驱动 部40的驱动量而间接地进行检测。此外，也可以将位置检测部80与装置主体32分体设置。操作模组36具备输入部82、存储部84、判断部86、显示灯88、控制部90、以及电源 92。输入部82包括移动指示部82A、速度设定部82B、移动量设定部82C、以及Z值设置 部82D。移动指示部82A对应于上述Z调节用手柄68及上述微调按钮72、74的开启操作而 输出移动指示信号。速度设定部82B输出表示由上述速度设定拨盘70设定的移动速度的 速度设定信号。移动量设定部82C输出表示由上述移动量设定拨盘76设定的移动量的移 动量设定信号。Z值设置部82D对应于上述Z值设置按钮78的开启操作而输出Z值设置信 号。从该输入部82输出的各信号被输入到控制部90中。存储部84对上述Z值设置按钮78被进行开启操作时的、由上述位置检测部80检测到的适配器保持部38的位置进行存储，作为Z值。判断部86将由上述位置检测部80检 测到的适配器保持部38的位置与存储在存储部84中的Z值比较，判断适配器保持部38是 否到达了上述Z值的位置。显示灯88对应于来自上述Z值设置部82D的上述Z值设置信 号而点亮。操作者通过该显示灯88的点亮，能够确认Z值的存储。控制部90控制该刀片驱动部14的整体。并且，电源92供给使该刀片驱动部14 的各部动作 的电力。以下，对于使用这样构成的本实施例所涉及的刀片驱动部14的刀片驱动方法进 行说明。这里，以使用本实施例所涉及的刀片驱动部14将物质导入到在皿24内的培养液 中培养的细胞中的情况为例进行说明。S卩，如图7所示，首先选择装置主体32的安装侧，经由显微镜适配器34将装置主 体32安装在聚光透镜28上(步骤S10)。接着，将针10插入安装到已从装置主体32拆下的适配器46中(步骤S12)。接 着，将安装有该针10的适配器46从倒置显微镜12的前面侧安装到装置主体32的适配器 保持部38上(步骤S14)。然后，进行刀片定位(步骤S16)。即，通过目视，将形成在针10的前端上的刀头部 44的位置设定在未图示的物镜的中央位置(视野中央位置)上。该动作一边用目镜22观 察一边操作装置主体32的针尖XY调节旋钮42和操作模组36的Z调节用手柄68来进行。 此外，进行该操作时不在显微镜XY载物台18上载置皿24。另外，关于Z方向，将操作模组 36的速度设定拨盘70设置为大或中，通过Z调节用手柄68的操作，进行刀头部44的下降 动作，直到在视野中能够通过目视确认到悬臂刀片54的杆部60。如果这样进行了刀片定位，则接着进行试样的设置、即皿24向显微镜XY载物台18 上的载置(步骤S18)。该动作通过以下这样的顺序进行。即，首先，操作操作模组36的Z 调节用手柄68，将针10前端的刀头部44退避到安全的区域(Z方向上侧)。此外，将倒置 显微镜12的支柱94(参照图1)向后侧放倒。由此，装置主体32整体移动。如果这样确保 了试样设置的空间，则将皿24(试样)载置到显微镜XY载物台18上。然后，将倒置显微镜 12的支柱94复原。另外，上述皿24(试样)为了将物质导入到在该皿24内的培养液中培 养的细胞中，在使想要导入的物质分散的状态下进行设置。接着，选择导入对象的细胞(步骤S20)。该动作首先通过一边用目镜22观察一边 操作显微镜XY载物台手柄20，使显微镜XY载物台18动作，将皿24内的想要观察的细胞配 置在显微镜观察下。然后，使Z驱动部40动作，使针10的刀头部44从细胞的上方接近于 细胞。即，首先一边通过目镜22进行观察一边进行刀头部44的向Z方向的下降动作，直到 在视野中能够通过目视确认到悬臂刀片54的杆部60。这通过将操作模组36的速度设定拨 盘70设置为小、操作Z调节用手柄68来进行。由于皿24内的细胞与刀头部44不是相同 的高度，所以没有聚焦在刀头部44上，难以观察刀头部44。因此，以即使不比刀头部44更 大地聚焦也能够大体识别杆部60作为指标，进行向Z方向的下降动作。并且，如果下降到 了在视野中能够通过目视确认到杆部60的位置，则接着一边用目镜22观察一边通过目视 进行显微镜XY载物台18的向XY方向的调节，将被认为是刀头部44的位置设定在导入对 象的细胞的正上方。如以上那样，选择(决定)导入对象的细胞。
之后的动作根据在操作模组36的存储部84中是否设置了 Z值而不同。在第1次的刀片驱动中，由于在存储部84中还没有设置Z值(步骤S22)，所以进行第1模式(无Z值)下的刀片导入(步骤S24)。即，一边操作操作模组36的Z调节用 手柄68或微调按钮72、74，一边用目镜22观察，一边确认“细胞的变形”或“杆部60的挠 曲”，一边决定Z方向的最佳位置。此时，Z调节用手柄68的操作是一边通过速度设定拨盘 70的大、中、小适当切换其感度一边进行的。此外，微调按钮72、74的操作是一边通过移动 量设定拨盘76的大、中、小适当切换其感度一边进行的。这样，使刀头部44下降，向皿24的底面接近，刀头部44的前端在下降的途中，接 触在皿24内的细胞上。这里，如果使刀头部44进一步下降，则刀头部44的前端在细胞内、 即细胞膜以及核上形成孔或伤口。通过使分散在皿24内的物质流通到这样形成的孔或伤 口中，物质流入到细胞内。根据想要导入的粒子的尺寸等，即使不形成孔或伤口，通过用刀 头部44使细胞变形带来的物理刺激使结合在牵张感受器(strech receptor)等上的通道 打开也能够使物质流入。这样进行物质的导入。在这样进行了导入时，如果操作者按下操作模组36的Z值设置按钮78，则操作模 组36的控制部90判别出Z值设置按钮78被按下。根据该判别，控制部90将在上述步骤 S24中由位置检测部80检测到的适配器保持部38的当前位置作为表示最佳位置的Z值存 储到存储部84中(步骤S26)。此时，使显示灯88点亮。然后，操作者通过操作操作模组36的Z调节用手柄68使针10上升，使刀头部44 退避(步骤S28)。此时，将操作模组36的速度设定拨盘70设置为中或小，通过Z调节用手 柄68的操作，进行刀头部44的上升动作。另外，如果在使刀头部44上升而将刀头部44从细胞拔出后经过某一定时间，则细 胞膜通过自我修复而恢复，成为物质被取入细胞内的状态。并且，如果刀头部44的退避完成(步骤S28)，则如果不需要进行向下个试样细胞 的物质的导入(步骤S30)，则操作者关闭操作装置主体32的未图示的电源开关而结束。相对于此，在进行向其他的细胞的物质导入的情况下(步骤S30)，回到上述步骤 S20，对任意的试样细胞分别重复进行物质的导入。即，操作者通过一边用目镜22观察一边 操作显微镜XY载物台手柄20，使显微镜XY载物台18动作，将刀头部44设定在导入对象的 细胞的正上方。即选择导入对象的细胞(步骤S20)。在第2次之后的刀片驱动中，由于在存储部84中设置了 Z值(步骤S22)，所以执 行实施第2模式(有Z值设置)下的刀片导入动作(步骤S28)。在此情况下，由于在存储 部84中设置有Z值，所以在水平方向上定位后，不用在意Z调节用手柄68及微调按钮72、 74的过头操作，仅通过进行使刀头部44充分下降的操作，就能够下降到最佳位置。即，操 作模组36的判断部86将由位置检测部80检测到的适配器保持部38的位置与设置在存储 部84中的值比较，判断适配器保持部38(刀头部44)是否到达了上述Z值的位置。并且， 如果判断部86判断为到达了那里，则操作模组36的控制部90进行控制，以使得即使操作 了 Z调节用手柄68及微调按钮72、74，Z驱动部40也不会进一步下降。另外，由于在存储部84中设置有最佳Z位置，所以也可以使适配器保持部38 (刀 头部44)自动下降到该位置。即，也可以使第2模式下的手柄操作自动化。此外，电动型的倒置型显微镜通过计算机驱动控制显微镜XY载物台18，并且具备CXD摄像机等，将观察图像显示在监视器上。在不是手动操作型的倒置显微镜12、而是在这 样的电动型的倒置型显微镜中使用本实施方式所涉及的刀片驱动装置14的情况下，也可 以预先在图像上选择需要进行物质的导入的细胞、自动地移动到该位置。即，也可以将显微 镜XY载物台18的向XY方向的调节自动化。另外，作为导入到细胞内的物质，可以是遗传基因、色素、量子点等的荧光试剂、离 子、肽、蛋白质、多糖类等，只要是能够分散到皿24内的物质就可以。[实际例子]表示将HelaS3细胞浸渍在遗传基因溶液中、尝试导入的例子。导入的遗传基因是 表达GFP荧光蛋白质的遗传基因，导入的正确与否可以通过荧光观察来确认。图8表示刚导入了遗传基因之后的尝试了导入的细胞的显微镜观察像。选择观察 图像中的多个细胞尝试了导入。图9及图10是在导入经过24小时后确认导入的成功与否 的显微镜观察像。图9是相位差观察像，表示经过24小时之后的细胞的状态。图10是通 过荧光观察观察该细胞的像，在导入成功了的细胞中，能够得到遗传基因所表达的较强的 荧光强度。通过该结果可以确认非常高效率地在细胞中导入了遗传基因。以上，在本实施例所涉及的针10中，具备与悬臂刀片54连接的轴56，安装到刀片 驱动部14上时的作业性提高，所以在与以往同样以低侵害使生存率较高的同时，能够将导 入物质可靠且以较高的导入效率导入到细胞内。[第2实施例]在上述第1实施例中，说明了经由刀片驱动部14在倒置显微镜12上仅安装1个 针10进行使用的例子。但是，也可以经由多个刀片驱动部14同时使用多个针10，例如可以 安装在聚光透镜28的两侧使用。通过这样使用多个针10，不仅能够用于物质的导入的用途，也能够用于例如在通 过对多个刀头部44间赋予电位差而给细胞带来电刺激的用途。另外，上述电刺激并不限定 于使用多个刀头部44，也能够通过对1个刀头部44与未图示的规定电极(例如带有ITO的 玻璃底等)之间赋予电位差而进行。在这样的情况下，刀头部44具有导电性是优选的。由此，在本实施例中，能够以低侵害使生存率维持得较高的同时，能够给细胞带来 电刺激而高效率地观察活细胞。以上基于实施例说明了本发明，但本发明并不限定于上述实施例，当然在本发明 的主旨的范围内能够进行各种变形及应用。例如，在上述实施例中，将刀片驱动装置14的装置主体32安装到在聚光透镜28 上安装的显微镜适配器34上，但并不限于此，也可以安装到支撑聚光透镜28的支撑部等 上。
权利要求
一种针，该针作用于单细胞，具备悬臂刀片(54)，包括具有柔性的支撑部(60)、以及相对于上述支撑部形成为规定角度的刀头部(44)；以及轴(56)，与上述悬臂刀片连接，其特征在于，能够将上述刀头部至少经由上述轴安装到能够沿规定方向移动的刀片驱动装置(14)上。
2.如权利要求1所述的针，其特征在于， 上述悬臂刀片和上述轴由不同的部件构成。
3.如权利要求2所述的针，其特征在于， 上述悬臂刀片和上述轴经由规定的接合件粘接。
4.如权利要求2所述的针，其特征在于，上述悬臂刀片和上述轴经由规定的拆装机构连接。
5.如权利要求1所述的针，其特征在于，上述轴在向上述刀片驱动装置的安装时作为手持部发挥功能。
6.如权利要求1所述的针，其特征在于，上述轴具有不妨碍连接上述刀片驱动装置的倒置显微镜(12)所具有的预定功能的形状。
全文摘要
一种针(10)，作用于单细胞，具备悬臂刀片(54)，包括具有柔性的支撑部(60)、以及相对于上述支撑部(60)形成为规定角度的刀头部(44)；以及轴(56)，与上述悬臂刀片(54)连接；其中，能够将刀头部44)至少经由轴(56)安装到能够沿规定方向移动的刀片驱动装置(14)(适配器保持部(38))上。
文档编号C12N15/09GK101889075SQ200880119548
公开日2010年11月17日 申请日期2008年12月5日 优先权日2007年12月10日
发明者今冈由佳, 佐佐木靖夫, 馆山清彦 申请人:奥林巴斯株式会社