专利名称：：一种高危型hpv荧光pcr筛查方法及引物、探针和试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种人类乳头瘤病毒(HPV)的'滞查方法，特別是针对高危型HPV的荧光PCR筛查方法及引物、探针和试剂盒。
背景技术：
：宫颈癌是女性的常见恶性肿瘤，位居女性恶性肿瘤第二位，严重威胁着女性的健康和生命。国际宫颈癌生物学研究(IBSCC);f几构报道，93%以上的宫颈癌组织中可检出HPV-DNA。研究表明HPV是引起宫颈癌的主要因素，流行病学研究显示HPV感染是宫颈癌发生的必要条件。大量临床资料表明，HPV感染是引发宫颈病变的重要原因。HPV是一类特异感染人皮肤、黏膜的非均质、双股环形DNA病毒，基因约8kb长。根据其功能的活动时段可分为3个编码区，即早期区、晚期区和长控区。迄今已发现120多种HPV亚型，依致病力大小，将HPV分为低危型和高危型两种。低危型主要导致生殖道肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣、宫颈扁平湿疣类病变和4氐度子宫颈上皮内瘤样变(CINI级)，主要亚型有HPV6、11、42、43、44等。高危型主要导致高度子宫颈上皮内瘤样变，即CINII、III级和宫颈癌，主要亚型有HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68这13种亚型。现常用的HPV的检测方法如下PCR检测包括常规PCR检测、实时荧光定量PCR检测(FQ-PCR)和PCR结合反向点杂交技术检测等。它们不仅可以对HPV感染者进行准确的早期诊断，而且能对HPV快速分型，方法简便、灵敏度高、特异性强。4旦荧光定量PCR检测主要针对HPV6、11、16和18亚型感染，其他亚型感染则会漏诊。杂交捕获DNA分析该分析是由Digene公司推出的非放射性HPV-DNA分析系统，联合应用高效液相杂交法和敏感的化学发光信号扩增系统。现为第2代杂交捕获法(HCII),能检测13种高危型HPV(HR-HPV)(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68)和5种低危型HPV(LR-HPV)(6、11、42、43和44)。灵敏度和特异性均较高，操作相对筒便，条件要求低，目前已广泛应用。HCII的缺点为仅能定量不能分型。高危型HPV检测(HCII)联合细胞学检查对于CINI患者诊断的灵敏度、特异度分别高达100%、97.2%,因此临床意义重大。但两种方法联合使用价格比较贵，不适于广大普通人群筛查。原位杂交技术使用放射性或非放射性DNA或RNA纟笨针标记细月包或组织，能够定位，且假阳性率低。但对病毒复制较少的宫颈癌及浸润癌，其敏感性较低，仅为40%~50%。组合把基因自动检测应用基因芯片和电传感技术对HPV进行快速分型检测，基因芯片可对HPV多种亚型同时检测，是多种亚型感染检测的好方法，但应进一步完善以提高其敏感性和特异性。针对宫颈癌的筛查，现在还没有一种价格便宜，灵敏度高，特异性好的适于广大普通人群采用的方法。
发明内容为了克服上述技术缺陷，本发明的目的之一是提供一种高危型HPV的荧光PCR筛查方法。该方法针对高危型HPV基因序列，采用多重PCR分三管同时进行第一管采用的引物如SEQIDNO:l至SEQIDNO:6所示序列，采用的探4十如SEQIDNO:19所示序列；第二管采用的引物如SEQIDNO:9至SEQIDNO:14所示序列，釆用的探针如SEQIDNO:21至SEQIDNO:23所示序列；第三管采用的引物如SEQIDNO:7、IDNO:8、SEQIDNO:15至SEQIDNO:18所示序列，采用的探针如SEQIDNO:20、SEQIDNO:24和SEQIDNO:25所示序列。收集50pl样品，采用常规提取DNA的方法或试剂盒提耳又纯化核酸后，加入20pl灭菌水或TE等。在八排管中加入20pl反应液及5^1纯化后的核酸并混匀后，再放置于荧光定量PCR仪中反应，反应条件为90-95°Cl-5分钟，热循环为90-95。C5-20秒，50-62°C30-60秒，共30-40个循环。优选的，所述方法的反应条件为94。C2分钟，热循环为94。C10秒，55°C35秒，共40个循环。本发明的第二个目的是提供一种高危型HPV的荧光PCR筛查引物，这类引物是针对高危型HPV基因序列的，选自SEQIDNO:l至SEQIDNO:18所示序列中的至少一种。本发明还提供了高危型HPV荧光PCR筛查引物对，针对高危型HPV基因序列，选自以下所示序列的引物对中的至少一对SEQIDNO:l和SEQIDNO:2、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18。本发明的第四个目的是提供高危型HPV荧光PCR筛查探针，该类探针是针对高危型HPV基因序列，选自SEQIDNO:19至SEQIDNO:25所示序列中的至少一种。本发明的第五个目的是提供一种高危型HPV的荧光PCR筛查试剂盒，该试剂盒针对高危型HPV，包含SEQIDNO:l至SEQIDNO:25所示序列中的至少一种。本发明的第六个目的是提供一种高危型HPV的荧光PCR筛查试剂盒，该试剂盒针对高危型HPV，包含以下所示序列的引物对中的至少一对SEQIDNO:l和SEQIDNO:2、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18。上述的高危型HPV包含14种亚型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、67和68型。与现有技术相比，本发明的针对14种高危型HPV的荧光PCR筛查方法及其引物、探针和试剂盒针对14种高危型HPV的筛查，其特异性和敏感性高，可操作性强，能同时检测14种高危亚型，且价格相对便宜，很适合广大普通群众的需求。具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。以下实施例主要是通过将本发明的筛查高危型HPV的荧光PCR的方法与HC2高危HPVDNA检测方法进行对照实验。其中所用到的引物序列如SEQIDNO:l至SEQIDNO:18所示，探针序列如SEQIDNO.19至SEQIDNO:25所示。具体见序列表。HC2(HybridCapture2)高危HPVDNA检测试剂盒是Digene公司开发的针对13种高危HPV的DNA检测试剂盒，是目前获美国FDA批准唯一可在临床使用的HPVDNA检测技术，并获欧洲CE组织认证及中国药监局SDA注册。该试剂盒可对HPV高危亚型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68共13种进行检测，其基本原理是在分子水平采用基因杂交-化学发光-信号放大的检测技术对HPVDNA进行定量检测。试验步骤如下1、样品DNA双链被释放并分解成为可以杂交的核苷酸单链。2、DNA单链与RNA组合探针结合为RNA-DNA杂合体。3、第一抗体(特异性抗体)与DNA-RNA杂交复合物固定在微孔壁上。4、偶联有碱性磷酸酶的第二抗体与RNA-DNA杂合体结合。5、碱性磷酸酶使酶底物发光，判读光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA杂合体的含量。(检测结果解释判定标准:RLU/Cutoff》1为阳性,<1为阴性。)本发明的高危HPV荧光PCR检测技术采用Taqman探针技术，可检测14种高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、67、68)，该技术精心设计七条探针，皆采用FAM/BHQ标记方法，在不影响特异性的情况下尽可能的对上述14种亚型进行合并，具体引物揮:针见表1所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>对上述亚型引物探针组合与HC2HPV试剂盒对比实验，阳性实验结果完全一致，阴性实验结果中242号标本(RLU/Cutoff为0.8)焚光PCR结果(CT:34.6434)为阳性，检出率高于HC2HPV试剂盒，具体实验结果见表2、表3，表2是HC2HPV阳性品使用荧光PCR对比实验结果，表3是HC2HPV阴性品使用荧光PCR法对比实验结果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>上述实验的具体操作为收集50jLil样品，采用常规提取DNA的方法或试剂盒提取纯化核酸后，加入20pl灭菌水。在八排管中加入2(Vl反应液及5pl纯化后的核酸并混匀后，再放置于焚光定量PCR仪中反应，同时在三种反应条件下进行90。Cl分钟，热循环为90。C5秒，50。C30秒，共30个循环；95°C5分钟，热循环为95°C20秒，62°C60秒，共35个循环；94°C2分钟，热循环为94°C10秒，55。C35秒，共40个循环。实验结果近似。在本发明的实施例中，仅将上述表2、表3的数据列举出来，作为代表说明实验结果。表2、表3的实验结果为在94。C2分钟，热循环为94。C10秒，55。C35秒，共40个循环的反应条件下得到的。上述表2，表3的实验结果证实了本发明的高危型HPV检测引物与探针的可用性。以下实验数据均在反应条件为94°C2分钟，热循环为94°C10秒，55°C35秒，共40个循环的设置下得到的。在实际操作中希望能够尽量减少检测管数，因此，对现有的引物与探针进行了分组混合，并证实14种高危型HPV荧光PCR检测试剂可以最终分为3组，即同一个标本进行3管PCR检测即可得知是否有此14种高危HPV感染。表4为将表1中的引物探针进行分组来同时检测的方案表。表5和表6为分组实验结果，其中，表5为组1的实验结果，表6为组2和组3的实验结果。从分组与单项对比的实验情况，初步得出可以将14种高危亚型分为三组，从而实现了在不降低灵敏度和特异性的情况下减少检测管数，降低成本的目的。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>为进一步验证荧光PCR引物探针的分组可靠性，对26份临床样品分别使用HC2HPV检测试剂盒与本发明的分三组同时反应的筛查方法进行同步检测。实验结果见表7，表7是26份临床样品HC2HPV与三组荧光PCR同步检测结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>上述的同步实验表明，本发明的三组荧光PCR检测方法配套引物探针与HC2HPV试剂盒结果完全符合。上述用到了18条引物和7条探针，序列分别如SEQIDNO:1至SEQIDNO:25所示。用这些引物和探针也可以组装成试剂盒，用来检测HPV。这些引物可以根据具体情况进行配对和使用，探针也可以根据具体需要进行选用。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>综合上述实验结果，将本发明的高危型HPV焚光PCR筛查方法及引物探针和含本发明所述的引物探针组成的试剂盒与HC2高危HPVDNA检测试剂以及HPV16/18型焚光PCR方法进行比较，比较的具体情况如表8所述。由表8的比较分析可见，本发明的高危型HPV荧光PCR筛查方法及引物探针和含本发明所述的引物探针组成的试剂盒的特异性、敏感性高，可操作性强，能同时检测14种高危亚型，且价格相对便宜，很适合广大普通群众的需求。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表<120>—种高危型HPV荧光PCR筛查方法及引物、探针和试剂盒<160〉25<210>1<211>27<212>人工序列1635F<400>1cccagagtatgggcttaatgataagaa27<210>1<211>24<212>人工序列163135R<400〉2gtctccatcgttttctttgtcctc24<210〉1<211〉30<212>人工序列31F<400>3ggaaatccagtatatgaattaagtgataaa30<210>1<211>30<212〉人工序列52F<400>4caatcctatatatgaaattaacaacgaaaa30<210>1<211>29<212〉人工序列33585267R<400>5ttccttgtcctcttcctctattaaatcta29<210>1<211>30<212>人工序列67F<400〉6caatccagtatataacttaaatgacgaaaa30<210〉1<211〉24<212>人工序列PV1845F<400>7ggacatggtccagattagatttgc24<210〉1<211〉20<212〉人工序列PV1845R<400>8acgttccgaaagggtttcct20<210>1<211>26<212〉人工序列PV3968F<400>9tgaaaagacttggtgcagattagact26<210>1<211〉28<212>人工序列PV3968R<400>10tgtaacacatttaaacgttgtgaaagtg<210>1<211〉22<212>人工序列PV3358F<400>11tcaaggacgtggtgcaaattag<210〉1<211>25<212>人工序列PV3358R<400>12ctgcatttaaacgtgctgatatttc<210〉1<211>21<212>人工序列PV51F<400>13gcgcactaatgacagcaaggt<210>1<211>24<212〉人工序列PV51R<400〉14cggtgcgtgtgatatattcttctg2822252124<210〉1<211>23<400>15agtgtgggcat卿aggtttgg<210>1<211>26<212>人工序列PV56R<400〉16gg犯ctttcagtatcatccagcctat<210>1<211>26<212>人工序列PV59F<400>17tggatcttctgagcaactatcatacc<210>1<211>20<212>人工序列PV59R<400〉18cgtctgacggttggacgttt<210>1<211>28<212〉人工序列PV5TFB<400>19tggaaatcctttttctcaaggacgtggt<210>1<211>26<212>人工序列PV1845FB<楊>20cgaggaagaggaagatgcagacaccg<210>1<211>28<212>人工序列PV3968FB<400〉21cagcaggacgaggatgaaggagacaatg<210>1<211>34<212〉人工序列PV3358FB<400>22tttaatagaggaagaggacaaggaaaaccatgga<210〉1<211〉24<212〉人工序列PV51FB<400>23ttgccacctgcacctgtgtctcga<210>1<211>25<212>人工序列PV56FB<400>2426283424taggtgctgggctaagtggccatcc25<210〉1<211〉18<212>人工序列PV59FB<400〉25acgccccccgaagccacg18权利要求1、一种高危型HPV荧光PCR筛查方法，其特征在于，针对高危型HPV基因序列，采用多重PCR分三管同时进行第一管采用的引物如SEQIDNO1至SEQIDNO6所示序列，采用的探针如SEQIDNO19所示序列；第二管采用的引物如SEQIDNO9至SEQIDNO14所示序列，采用的探针如SEQIDNO21至SEQIDNO23所示序列；第三管采用的引物如SEQIDNO7、SEQIDNO8和SEQIDNO15至SEQIDNO18所示序列，采用的探针如SEQIDNO20、SEQIDNO24和SEQIDNO25所示序列。2、根据权利要求1所述的一种高危型HPV荧光PCR筛查方法，其特征在于，所述方法的反应条件为90-95°C1-5分钟，热循环为90-95°C5-20秒，50-62。C30-60秒，共30-40个循环。3、根据权利要求1所述的一种高危型HPV荧光PCR筛查方法，其特征在于，所述方法的反应条件为94°C2分钟，热循环为94°C10秒，55°C35秒，共40个循环。4、高危型HPV荧光PCR筛查引物，其特征在于，针对高危型^PV基因序列，选自SEQIDNO:l至SEQIDNO:18所示序列中的至少一种。5、高危型HPV荧光PCR筛查引物对，其特征在于，针对高危型HPV基因序列，选自以下所示序列的引物对中的至少一对SEQIDNO:1和SEQIDNO:2、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16和SEQIDNO:17和SEQIDNO:18。6、高危型HPV荧光PCR筛查探针，其特征在于，针对高危型HPV基因序列，选自SEQIDNO:19至SEQIDNO:25所示序列中的至少一种。7、一种高危型HPV荧光PCR筛查试剂盒，其特征在于，针对高危型HPV基因序列，所述试剂盒包含SEQIDNO:l至SEQIDNO:25所示序列中的至少一种。8、一种高危型HPV荧光PCR筛查试剂盒，其特征在于，针对高危型HPV基因序列，所述试剂盒包含以下所示序列的引物对中的至少一对SEQIDNO:l和SEQIDNO:2、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:5、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16和SEQIDNO:17和SEQIDNO:18。全文摘要本发明提供了一种高危型HPV的荧光PCR筛查方法及其引物、探针和试剂盒。该方法针对高危型HPV基因序列，采用多重PCR分三管同时进行。反应条件为90-95℃1-5分钟，热循环为90-95℃5-20秒，50-62℃30-60秒，共30-40个循环。该试剂盒包含SEQIDNO1至SEQIDNO25所示序列中的至少一种或包含本发明中的引物对中的至少一对。与现有技术相比，本发明的高危型HPV的荧光PCR筛查方法及其引物、探针和试剂盒针对14种高危型HPV的筛查，其特异性和敏感性高，可操作性强，能同时检测14种高危亚型，且价格相对便宜，很适合广大普通群众的需求。文档编号C12Q1/70GK101613764SQ20091004162公开日2009年12月30日申请日期2009年8月3日优先权日2009年8月3日发明者刘文宽,荣周,苏晓波申请人:广州锐达生物科技有限公司;呼吸疾病国家重点实验室