专利名称：：加快花生转化率的方法
技术领域：
：本发明涉及一种提高农杆菌介导花生外源基因遗传转化效率的技术方法，通过在花生遗传转化所用的农杆菌工程菌液中添加一定量的烟草提取液，并将烟草提取液与工程菌液在合适的时机加入和混匀，通过提高农杆菌毒性来提高花生外源基因遗传转化效率的方法。
背景技术：
：组培条件下以农杆菌为介导进行花生遗传转化已有较多的成功先例，多以嫩叶为外植体进行转化，印度Eapen和GeorgeI994年首次报道以9~10d苗龄嫩叶为外植体通过含双元质粒pBI121的农杆菌LBA4404转化获得转基因花生。美国ChengMing等人于1996和1997年报道以花生10d龄苗嫩叶为外植体通过含PBI121双元质粒农杆菌转化获得转基因植抹，得到l、T2代种子，证实外源基因已整合进花生基因组并在后代稳定表达。同一实验室的LiZhijian等通过对技术的改进获得转番茄班萎病毒壳蛋白(TSWV-CP)基因花生植林，并通过抗病性鉴定。国内方小平等以花生品种鄂花4号4d龄苗嫩叶作外植体，与AGL1菌株共培，经卡那霉素筛选获得获得国内首例转基因花生。Mckently、Baker、Lacorte等则分别以花生胚轴、胚状体和节瘤为外植体实现了外源基因对花生的转化。另外，国际半干旱热带地区作物所Sharma等用含双元质粒载体(pBI121;pROKII:IPCVcp)的农杆菌C58菌抹转化成熟种子子叶外植体，转化率达55%以上。本试验以花生丛生芽为外植体通过LBA4404菌株介导将含双价表达载体质粒转入花生体内，并经过了初步分子鉴定，说明通过花生丛生芽再生体系进行外源基因转化是可行性的。这与Sharma的研究基础相似，都是以丛生芽为外植体，但Sharma等的研究是以子叶为外植体获得的丛生芽，本研究则是以带子叶胚为外植体进行遗传转化试验，转化效率远低于Sharma等的研究结果，分析与丛生芽的再生数量有关。同时试验发现，花生丛生芽再生体系具有再生周期短、再生率高、丛生芽再生数量较多等优点，可作为花生外源基因转化比较好的受体体系，如对该再生体系继续优化，进一步提高初期茎枝诱导数量，则提高转化效率有利。
发明内容为解决农杆菌介导花生外源基因芽诱导率低、转化效率不高等缺点，本发明通过在花生遗传转化所用的农杆菌工程菌液中添加一定量的烟草提取液，并将烟草提取液与工程菌液在合适的时机力口入和混匀，通过提高农杆菌毒性来提高花生外源基因遗传转化效率的方法。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种提高花生转化率的方法；其包^r如下步骤从烟草无菌苗取叶片捣碎离心获得新鲜汁液；制备花生转基因用农杆菌工程菌液，4。C冰箱低温放置1.5-2hr,取出后震荡混勻，每100mL工程菌液加入2-2.5mL新鲜烟草提取液，混匀后用于花生外源基因遗传转化。在花生遗传转化研究中，常规技术多以在农杆菌工程菌液中添加乙酰丁香酮为主，但该物质对操作人员存在不良影响，成本高，并对后期芽诱导不利。本技术研究了利用烟草提取液提高转化效率的方法，效果显著。与常规技术相比，烟草提取液仅依靠其中的酚类物质作用于农杆菌毒性区，以提高农杆菌侵染花生的毒性，区别于常规技术中加入乙酰丁香酮化学物质，对操作人员没有任何附加的伤害，并且提高转化率效果更显著。图1是双价表达载体pBI121的载体图谱，该载体含35SCaMV启动子连接的人源轮状病毒抗原蛋白G1VP4基因(2350bp)或G2VP4基因(2350bp)，和新霉素磷酸转移酶NPTII基因，即以卡那霉素(Kan)抗性基因作为抗性筛选基因。具体实施例方式本发明提供一种提高花生转化率的方法，其包括如下步骤1.从烟草无菌苗取叶片捣碎离心获得新鲜汁液；2.制备花生转基因用农杆菌工程菌液(1)从保存的平板上挑取农杆菌单菌落，接种到加有50mg/LKan和25mg/LRif的5mL农杆菌培养基(YEB)中，振荡培养过夜；(2)耳又lmL菌液接种到50mL加有50mg/LKan和50mg/LRifYEB液体培养基中，剧烈震荡培养至OD6oo-1.0-1.2，5000rpm离心lOmin,菌体用1/2MS(含有3%蔗糖)培养基重悬一次，5000rpm离心lOmin;(3)用1/2MS(含有3%蔗糖)培养基重悬，OD6(K)=0.5-0.7，4。C下储藏1-2小时用于共培养。3.4。C水箱低温放置1.5-2hr,取出后震荡混匀，每lOOmL工程菌液加入2-2.5mL新鲜烟草^是取液，混匀后用于花生外源基因遗传转化。1.1实验材料1.1.1植物材料花生(Jrac/z^/y;pogaeaL.)品种花生栽培品种鲁花14号、花育19号、花育22号、花育23号由山东省花生研究所提供，同时也是市售的花生品种；烟草(Mcoto加ta&cwwcvJa"A/)品种翠碧1号本实验室保存品系(二倍体)，该品种也是市售的花生烟草品种。1.1.2质粒及菌种本试马全所用农杆菌(JgroZ>a"en-wmwme/acz'e"s)菌才朱为LBA4404,可从生物技术公司购得。该质粒为双价表达载体pBI121,含35SCaMV启动子连接的人源轮状病毒抗原蛋白G1VP4基因(2350bp)或G2VP4基因(2350bp),和新霉素磷酸转移酶NPTII基因，即以卡那霉素(Kan)抗性基因作为抗性筛选基因，由中国农业科学院提供(载体图谱见附录)。1.1.3培养基(一)农杆菌培养基(YEB):<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>用5MNaOH调pH7.0-7.2，固体培养基加入1.5%的琼脂粉，定容，々装，高温高压灭菌15-20min。(二)MS培养基母液的配制<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(4)母液IV的酉己制<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1.1.4引物(所用引物均由上海生工生物公司合成)(1)根据G1VP4和G2VP4的序列(序列见附录)，设计通用引物引物1:5'-ACAATGGCTTCACTCATTTATA-3'引物2:5'画CACATCCTCAATAGCGTTCTCAC-3'(2)新霉素磷酸转移酶基因("prtl)扩增引物引物1':5'-TAGTCGGCTATGACTGGGCA-3'引物2':5'-GCCAACGCTATGTCCTGAT-3'1.1.5化学试剂(1)质粒提取液溶液I:50mM葡萄糖，25mMTris.Cl(PH8.0),10mMEDTA(PH8.0)。溶液II:0,2MNaOH,1%SDS。溶液III:60.0mL5MKac，11.5rnL冰乙酸，28.5mLH20。溶液I15磅高压灭菌15min。溶液II(2MNaOH和10%SDS贮存液)，现用现配。溶液I和溶液III保存于4°C。(2)lOxTE溶液O.lMTris(pH8'0)，0.01MEDTA(pH8.0)。(3)STE溶液0.1MNaCl,10mMTris(pH8.0),1mMEDTA(pH8.0)。(4)RNaseA(DNasefree)溶液10mg/mL脂aseA,10mMTris(pH7.5)，15mMNaCl，100°C煮沸15min,分装后贮于-20。C备用。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>其它化学试剂均为国产或进口分析纯。1.2农杆菌的转化(1)保存的农杆菌LBA4404活化后，划板，28。C培养2天后长出单克隆；(2)挑根癌农杆菌单克隆接种于50mLYEB液体培养基中，28°C,220rpm振荡培养至OD6qo=0.5;(3)5000rpm离心5min,弃上清；(4)菌体用10mL预冷的0.15M的NaCl重悬；(5)5000rpm离心5min，弃上清；(6)沉淀用1mL预冷的20mMCaCl2重悬；(7)在200jiL感受态细胞中加入1重组质粒，冰浴30min;(8)液氮中冷冻1min;(9)37。C水浴，融化细胞2~3min;(10)力口1mLYEB,28。C轻轻振荡24h;(11)轻轻离心1min,用0.1mLYEB悬浮沉淀，将细胞悬液涂布于含50pg/mLKan,40pg/mLRif的YEB平板上，28。C培养23天；(12)筛出的克隆接种于液体培养基中培养，提质粒，用特异引物进行PCR检测。1.3子叶组织培养系统(l)挑选成熟花生种子，去掉外壳，在自来水冲洗干净后，先用70%酒精处理lmin进4亍表面灭菌，再用0.1%升汞(w/v)处理10min,然后用无菌水冲洗46遍，每次间隔5min，最后在无菌水中浸泡2h。在超净工作台上小心剥去种皮，延纵向分开，用解剖刀小心切去胚及与子叶相连的胚轴处，切成"V"型，每粒种子可产生两个子叶外植体。(2)花生子叶接种在诱导分化培养基(MSC1)上，在25°C±1°C、30004000Lux光强，16h光照条件下培养，每14d更换新鲜培养基。当有绿色芽点形成后，接种到芽伸长培养基(MSC2)上促进芽分化及伸长。待有4-6片叶时，切下转接到生根培养基(MSC3)诱导生根。约2周后根开始形成，再过一周时间将根系健壮的小植株移栽到经高温灭菌过的蛭石中，置于室内光照条件下培养23周后，然后移至温室，土壤为灭菌的大田土。每个月用Hoagland营养液浇一次，定期用自来水浇灌。(3)子叶组织培养系统的主要培养基i秀导分化培养基(MSC1):MS+5.00mg/L6-BA+1.50mg/L2,4-D，pH5.7-5.8;芽伸长培养基(MSC2):MS+0.50mg/L6-BA,pH5.7-5.8;生根培养基(MSC3):MS+2.00mg/LNAA,pH5.7画5.8。1.3.3烟草提取物的获得烟草种子灭菌种于MS培养基中，2-3周后取小苗幼嫩茎叶2g，放入无菌的50mL离心管中捣烂取汁液，然后加入2mL无菌水，振荡混合均匀静置3-5min,获得烟草提取物。取烟草提取物加到50mL1/2MS液体培养基重悬的菌液(OD6。。=0.5-0.7)中。1.4烟草提取物对转化的影响设置每50mLl/2MS培养基重悬的菌液中加入烟草提取物0.5、1.0、1.5、2.0mL,以鲁花14号和花育23号的子叶为外植体，4曼染10min,共培养3天后，移入诱导分化培养基，培养2-4周，期间观察外植体的芽分化率。1.5农杆菌介导的花生子叶遗传转化1.5.1活化农杆菌(1)从保存的平板上挑取农杆菌单菌落，接种到加有50mg/LKan和25mg/LRif的5mLYEB培养基中，振荡培养过夜；(2)取lmL菌液接种到50mL加有50mg/LKan和50mg/LRifYEB液体培养基中，剧烈震荡培养至006()()=0.8-1.0，5000rpm离心lOmin,菌体用1/2MS(含有3%蔗糖)培养基重悬一次，5000rpm离心10min;(3)用1/2MS(含有3%蔗糖)培养基重悬，OD6Q。=0.5-0.7,4。C下储藏1-2小时用于共培养。1.5.2侵染及共培养农杆菌侵染制备好的子叶外植体10min,然后用灭菌的滤纸洗干多余的菌液。随后将外植体置入铺有一层无菌滤纸的MSC1固体培养基中，25。C士rC暗培养3天。1.5.3芽诱导培养(1)共培养三天后，将外植体取出用含Cef为250mg/L、Carb为250-500mg/L的无菌水冲洗4-5遍后，用灭菌滤纸吸干，接到含Cef为250mg/L、Carb为250-500mg/L的i秀导分化培养基(MSC1)上，在25°C±1°C、3000-4000Lux光强，16h光照条件下选择培养14d;(2)然后转一妾到含有Cef为250mg/L、Carb为250-500mg/L、Kan为125mg/L诱导分化培养基(MSCl),在25。C士1。C、3000-4000Lux光强，16h光照条件下继续培养，每14d更换新鲜培养基。子叶随着培养时间的继续伸长膨大，逐步将外植体的子叶部分切掉；(3)当有绿色芽点形成后，接种到Cef为250mg/L、Carb为250-500mg/LCarb、Kan为125mg/L的芽伸长培养基(MSC2)上促进芽分化及伸长，随着芽丛的继续生长，逐步将其切分成小块，继续伸长培养。1.5.4生根培养当诱芽长有3~4片小叶时，将诱芽切下，转接到加有Cef为250mg/L、Carb为250-500mg/L、Kan为25mg/LKan的生根培养基(MSC3)诱导生根，约2周后^f艮开始形成。1.5.5移栽温室将根系健壮的小植株移栽到经高温灭菌过的蛭石中，置于室内光照条件下培养2-3周后，然后移至温室，土壤为灭菌的大田土。每个月用Hoagland营养液浇一次，定期用自来水浇灌。1.6转基因植林的分子检测1.6.1转基因植抹的PCR检测1.6.1.1花生DNA的提取(1)取2-4g新鲜花生叶片，在液氮中充分研磨；(2)移至50mL离心管中，加入16mLDNA提取液，充分混匀，65°C水浴j呆温20min;(3)加入5mL5M的KAc溶液，水浴30min以上(中间轻摇几次)；(4)加入5mL氯仿苯酚(l:l)混合液，混匀，6000rpm离心15min(冰冻离心才几)；(5)上清转移到一个干净的50mL离心管中，加入5mL氯仿，6000rpm离心10min;(6)上清转移到一个干净的50mL离心管中，加入等体积冰冻的异丙醇，-20。C放置两小时以上;(7)4。C,6000rpm离心5min，用70%乙醇洗;条DNA5冗淀三次；(8)沉淀吹干后用水溶解，用分光光度法测A26o及A，以确定浓度，于-20。C贮存。DNA提取液Tris画HCl(pH8.0)100mmol/LEDTA(pH8.0)5mmol/LNaCl500mmol/LSDS1.25%1.6.1.2PCR扩增wp/II基因0.5mLEP管中，50(iLPCR反应体系Taq酶0.25^L10xbuffer5jiLMgCl23jxLdNTP(2.5mM)4pLTemplate1jjL"/fiiPrimer1'1jjLiiPrimer2'1jjLDDW34.75(iL反应条件94°C5min,94°C50s,55°C45s，72°Clmin,30循环后，72°C延伸10min,4。C保存。1.0%琼脂糖;10交电泳检测。1.6.1.3PCR扩增VP4基因0.5mLEP管中，50(xLPCR反应体系Taq酶0.25jaL10x緩沖液5}iLMgCl23|oLdNTP(2.5mM)4jiL模板IjiLVP4引物1lpLVP4引物2lpLDDW34.75)iL反应条件94。C5分钟，94。C55秒，57°C45秒，72。Cl分钟，30循环后，72。C延伸10分钟，4。C保存。1.0%琼脂糖凝胶电泳4企测。1.6.2转基因植林的PCR-Southern杂交和Southern杂交检测提取转基因花生植抹的基因组DNA,DNA用Saw//1酶切，电泳，转膜，用标记VP4部分片段的序列进行杂交。PCR-Southem杂交，PCR扩增目的基因后，转膜杂交过程同Southern杂交。实施例烟草提取物中含有较多的酚类物质，在花生外植体侵染过程中加入烟草提^f又物，提高酚类物质的含量，由表l可以看出，当50mL1/2MS培养基重悬的菌液中加入烟草提取物为1.0-1.25mL时，鲁花14号和花育23号的转化率提高最大。实验证明烟草提取物能提高花生外植体的转化率，但加入过量又会导致外植体的褐化引起转化率降低。表l烟草提取物对子叶外植体转化率的影响(2Q04年)烟草提耳又物的浓度(mL/50ml)0.00.51.01.251.5鲁花14号转化率(％)10172928.0021花育23号转化率(％)_1216272412由表2中看出，添加烟草换:耳又液后，泉花10号与金花1012的双^介表达载体基因遗传转化率显著提高，分别提高了4.4和5倍。表2田间烟草提取液花生外源基因遗传转化实验(2004年)添加烟草提取液转化率(°/。)CK转化率(％)提高(倍)泉花10号2.20.54.4金花10121.50.35由表3中看出，添加烟草提取液后，花育19号与花育22号的G1VP4基因遗传转化率显著提高，分别提高了2.2倍。表3轮状病毒G1VP4基因遗传转化实验U005年)添加烟草提取液转化率(％)CK转化率(％)提高(倍)花育19号17.25.53.1花育22号15.16.82.权利要求1.一种提高花生转化率的方法；其包括如下步骤(1)从烟草无菌苗取叶片捣碎离心获得新鲜汁液；(2)制备花生转基因用农杆菌工程菌液，4℃冰箱低温放置1.5-2小时，取出后震荡混匀，每100mL工程菌液加入2-2.5mL新鲜烟草提取液，混匀后用于花生外源基因遗传转化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，制备花生转基因用农杆菌工程菌液的过程包括(1)从保存的平板上挑取农杆菌单菌落，接种到农杆菌培养基中，振荡培养过夜；(2)取少量菌液接种到加有卡那霉素和利福平的农杆菌液体培养基中，剧烈震荡培养至OD60q=1.0-1.2,4000-5000rpm离心10min,菌体用含有3%蔗糖的1/2MS培养基重悬一次，4000-5000rpm离心10min;(3)用含有3%蔗糖的1/2MS培养基重悬，OD6oo=0.5-0.7，4。C下储藏1-2小时用于共培养。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述少量菌液为l-2mL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述农杆菌的转化步骤包括(1)保存的农杆菌LBA4404活化后，划板，28。C培养2天后长出单克隆；'(2)挑根癌农杆菌单克隆接种于50mLYEB液体培养基中，28°C,200rpm振荡培养至OD600=0.7;(3)5000rpm离心5min,弃上清；(4)菌体用10mL预冷的0.15M的NaCl重悬；(5)5000rpm离心5min，弃上清；(6)沉淀用1mL预冷的20mMCaCl2重悬；(7)在200fiL感受态细胞中加入1pg重组质粒，冰浴30min;(8)液氮中冷冻1min;(9)37。C水浴，融化细月包23min;(10)力o1mLYEB，28。C轻轻振荡2~4h;(11)轻轻离心1min,用0.1mLYEB悬浮沉淀，将细月包悬液涂布于含50jig/mLKan,40pig/mLRif的YEB平板上，28。C培养2~3天；(12)筛出的克隆接种于液体培养基中培养，提质粒，用特异引物进行PCR检测。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，获得所述烟草提取液的步骤包括烟草种子灭菌种于MS培养基中，2-3周后取小苗幼嫩茎叶2g，》文入无菌的50mL离心管中捣烂耳又汁液，然后加入2mL无菌水，4展荡混合均匀静置3-5min,获得烟草提取物。全文摘要本发明提供一种提高花生转化率的方法；其包括如下步骤从烟草无菌苗取叶片捣碎离心获得新鲜汁液；制备花生转基因用农杆菌工程菌液，4℃冰箱低温放置1.5-2小时，取出后震荡混匀，每100mL工程菌液加入2-2.5mL新鲜烟草提取液，混匀后用于花生外源基因遗传转化。与现有技术相比，本发明对操作人员没有任何附加的伤害，并且提高转化率效果更显著。文档编号C12N15/84GK101586118SQ20091015226公开日2009年11月25日申请日期2009年7月10日优先权日2009年7月10日发明者万书波,单世华,张廷婷,李春娟,闫彩霞申请人:山东省花生研究所