专利名称：区分莱姆病病原基因型的试剂及方法
技术领域：
本发明涉及一种用于区分某种病原的基因类型的试剂方法，以及这种试剂的使用 方法，更确切讲，本发明是一种用于区分莱姆病病原基因型的试剂和其使用方法。
背景技术：
莱姆病(Lyme disease)又称莱姆包柔体病或莱姆疏螺旋体病，是一种蜱传性的 自然疫源性人兽共患螺旋体病，因首次在美国康涅狄格州的莱姆镇发现而得名。目前已在 全球30多个国家和地区报告有本病和本病的自然疫源地存在，年发病人数在30万左右， 仍有不断增多的趋势，在美国有“第二艾滋病”之称(Gratz N. Emerging and resurging vector-borne disease. Ann Rev Entomol，1999，44 :51)。1992 年，世界卫生组织(WHO)将 此病列为重点防治研究对象。我国于1986年首次在黑龙江省海林县林区发现了该病，到目 前，我国至少30个省(区、市)均已发现有莱姆病分布，每年新发病例高达万余例，某些省 份林区的发病率在1_40%。人感染莱姆病后的临床症状主要表现为慢性炎症性多系统损伤，除皮肤慢性游 走性红斑、关节炎和慢性萎缩性肢皮炎外，常常会伴有心脏和神经系统的损伤，从而引起 脑膜炎、路神经炎、运动及感觉神经根炎、神经丛炎、多发单神经炎小脑共济失调等等症 状，严重影响人类健康。伯氏疏螺旋体的基因型与莱姆病的致病性和临床表现是密切相 关的，不同的基因型致病性不同，产生的临床症状也不同。莱姆病的病原体为伯氏疏螺旋 体，可分为11个基因型或群，我国已发现并报道的莱姆病螺旋体主要是狭义伯氏疏螺旋 体(Borreliaburgdorferi sensus stricto)、嘎氏疏螺旋体(B. afzelii)和伽氏疏螺旋体 (B. garinii)三个基因型。对莱姆病病原分离株进行基因型的鉴定在流行病学、临床、诊断、 治疗和疫苗研制方面具有重要的指导意义。到目前为止，区分莱姆病病原基因型的方法主要以聚合酶链式反应(PCR)、限制性 片段长度多态性(RFLP)和反向线状印迹(RLB)方法为主，但是PCR、RFLP以及RLB在区分 本病原时需要复杂的系统，对操作实验要求较高，现有技术中进行莱姆病分型可参考以下 文献Rauter C，Meuller M，Diterich I，et al. Critical evaluation of urine-based PCR assay for diagnosis of Lyme borreliosis. ClinDiag Lab Immunol,2005，12 910-917 ；Moran-Cadenas F，Schneider H，et al.，Acomparison of two DNA extraction approaches in the detection of Borreliaburgdorferi sensu Iato from live Ixodes ricinus ticks by PCR and reverse line blotting. Vector Borne Zoonotic Dis. 2007 ；7 (4) :555_561) ；Daniele Postic，Marc V. Assous, Patrick A. D. Grimont, Guy Baranton. Diversity of Borrelia burgdorferi Sensu Latoevidenced by restriction fragment length polymorphism of rrf (5S)-rrl(23S)intergenic spacer amp1 icons. International Journal of Systematic Bacteriology，1994，44(4) :743_752。
发明内容
本发明提供一种区分和鉴定莱姆病病原伯氏疏螺旋体的检测试剂，以及这种试剂 的使用方法。本发明的用于区分莱姆病病原基因型的试剂中至少有a.狭义伯氏疏螺旋体LAMP特异性引物；b.嘎氏疏螺旋体LAMP特异性引物；c.伽氏疏螺旋体LAMP特异性引物。本发明的用于区分莱姆病病原基因型的试剂中各特异性引物序列为a.狭义伯氏疏螺旋体LAMP特异性引物为F3 :5， -tagcagccttgacgagaa-3，B3 :5， -tttgacctagatcgtcagaa-3，FIP 5' -gccgtctttgtttttttctttgcttttttcagcgtttcagtagatttgc-3，BIP :5，-gtagacaagcttgagcttaaaggatttttttgtcagcttttacgcctt-3，；b.嘎氏疏螺旋体LAMP特异性引物为F3 :5，-gccaaaacattagtgtcaaga-3，B3 5' -ggttccttcttttacttccaatg-3'FIP :5，-catggtttttgcagacaattcaccttttgttctaaagacaaaacatcaacaga-3，BIP —已t^cBg已已已tg已已已已gcg^tgg已已ctttt已gct^cttttccttc已已g>_3，； c.伽氏疏螺旋体LAMP特异性引物为F3 :5， -ttcaacgcaaaaggtgaat-3，B3 5' -caactgttatttctccagagtt-3，FIP :5，-ccggttccatcgctttttatttctgttttgaaaaaacaatactaagagcaaacg-3，BIP :5，-aagactttgctcttgaaggaacttttttgcttaaaacaacagtgcc-3‘0本发明的检测试剂的使用方法是将待检的蜱进行研磨，然后离心沉淀，取上清液； 或者从待检的动物或人提取组织或关节滑液或血液样品，用所得到的上清液或组织样品培 养莱姆病病原螺旋体，再将培养液离心，取沉淀提取基因组DNA，将所提取的基因组DNA分 为三份，在LAMP反应缓冲液中分别加入狭义伯氏疏螺旋体特异性引物、嘎氏疏螺旋体特异 性引物和伽氏疏螺旋体特异性引物，再分别在每个加有特异性引物的LAMP反应缓冲液中 加入前述提取的DNA样品一份、灭菌超纯水以及Bst DNA聚合酶，然后进行LAMP扩增，取扩 增产物以TAE为缓冲液，在琼脂糖凝胶中进行电泳检测，根据电泳检测结果的泳道中是否 存在的特异性条带确定被检样品的莱姆病病原基因型。本发明的检测试剂的使用方法也可以是将待检的蜱进行研磨，然后离心沉淀，取 上清液；或者从待检的动物或人提取组织或关节滑液或血液样品，用所得到的上清液或组 织样品培养莱姆病病原螺旋体，再将培养液离心，取沉淀提取基因组DNA，将所提取的基因 组DNA分为三份，在LAMP反应缓冲液中分别加入狭义伯氏疏螺旋体特异性引物、嘎氏疏螺 旋体特异性引物和伽氏疏螺旋体特异性引物，再分别在每个加有特异性引物的LAMP反应 缓冲液中加入前述提取的DNA样品一份、灭菌超纯水以及Bst DNA聚合酶，然后进行LAMP 扩增，在各扩增产物中加入Mg2+试剂，根据相应试管内液体是否产生浑浊或白色沉淀的阳 性反应，确定被检样品的莱姆病病原基因型。
5CN 101967513 A
说明书
3/5页本发明的检测试剂的使用方法还可以是将待检的蜱进行研磨，然后离心沉淀，取 上清液；或者从待检的动物或人提取组织或关节滑液或血液样品，用所得到的上清液或组 织样品培养莱姆病病原螺旋体，再将培养液离心，取沉淀提取基因组DNA，将所提取的基因 组DNA分为三份，在LAMP反应缓冲液中分别加入狭义伯氏疏螺旋体特异性引物、嘎氏疏螺 旋体特异性引物和伽氏疏螺旋体特异性引物，再分别在每个加有特异性引物的LAMP反应 缓冲液中加入前述提取的DNA样品一份、灭菌超纯水以及Bst DNA聚合酶，然后进行LAMP 扩增，在各扩增产物中加入SYBR Green I，根据相应试管是否呈绿色的阳性反应确定被检 样品的莱姆病病原基因型。由以上内容可知本发明的检测方法是一种环介导的恒温扩增技术 (Loop-mediated isotheral amplification method， UVMP) 。 ^Fi帛白勺HiUifif *^ 2000年由日本科学家Notomi Τ.等发明的一种敏感性很高的DNA扩增技术。本发明的方法 具有特异性高于PCR方法，同时不需要复杂的操作系统，在普通的实验室就可以进行。具有 操作简单、特异性高、快速等特点，因此有关极好的实验研究和商业价值。
图1为1，2，3，4号离心管经狭义伯氏疏螺旋体特异性引物扩增的结果；图2为1， 2，3，4号离心管经嘎氏疏螺旋体特异性引物扩增的结果；图3为1，2，3，4号离心管经伽氏 疏螺旋体特异性引物扩增的结果。其中1，2，3，4分别为狭义伯氏疏螺旋体、嘎氏疏螺旋体、 伽氏疏螺旋体、灭菌超纯水。图1-3中M为DNA标准分子量DL2000，泳道1分别为狭义伯 氏疏螺旋体经3套LAMP特异性引物扩增的结果，泳道2分别为嘎氏疏螺旋体经3套LAMP 特异性引物扩增的结果，泳道3分别为伽氏疏螺旋体经3套LAMP特异性引物扩增的结果， 泳道4分别为灭菌超纯水经3套LAMP特异性引物扩增的结果。
具体实施例方式以下给出
具体实施例方式1.阳性基因组DNA的制备过程伯氏疏螺旋体的体外培养将标准的狭义伯氏、嘎氏和伽氏疏螺旋体菌株分别接 种于6mL玻璃试管中含有5mL BSKII (Sigma)培养基上。将接种狭义伯氏螺旋体菌株的试 管定为1号试管，将接种嘎氏螺旋体菌株的试管定为2号试管，将接种伽氏疏螺旋体菌株的 试管定为3号试管。将各试管置于33°C培养箱培养1-3周(每周应用暗视野显微镜检测一 次)。当菌液达到较高浓度时，收集菌液，4000rpm离心20分钟，丢弃上清，沉淀用TBS (20mM Tris-HCl, 150mMNaCl)悬浮，同上离心洗涤3次，_20°C保存备用。2.基因组DNA的提取应用基因组提取试剂盒(Gentra)，根据说明书进行三种疏螺旋体基因组DNA的提 取。测定所制备的基因组DNA的浓度，并应用稀释液稀释成lOOng/uL，_20°C保存备用。3. 2 X LAMP反应缓冲液的准备首先应用灭菌的超纯水按照表1所示比例配制无dNTP的2X反应缓冲液储存液。 所配制的缓冲液可在4°C保存3个月，-20°C长期保存。表 1.
试剂总体积900mLIM Tris-Cl (pH 8.8) stock sol.40mLKCl1.49gMgSO4 (MgSO4TH2O)1.93g(3.94g)(NH4)2S042.64gTween 202mLBetaine187.4g使用前每900uL的2X反应缓冲液储存液中加入IOOuL 25mM dNTP,混勻，制备成 2X反应缓冲液工作液，-20°C保存备用。3.检测过程在1. 5mL的离心管中按如下比例加入待检样品，同时设立标准阳性、阴性和超纯 水的空白的对照
2X反应缓冲液工作液 引物反应混合物 灭菌的超纯水 DNA样品 Bst DNA聚合酶
12. 5uL 0. 9uL 8. 6uL 2. OuL 1. OuL
25uL
总体积
将各离心管轻轻混勻，瞬间离心。装于1号离心管的狭义伯氏疏螺旋体的鉴定在 60°C水浴锅中扩增60分钟；装于2号离心管的嘎氏疏螺旋体的鉴定在65°C水浴锅中扩增 40分钟；装于3号离心管的伽氏疏螺旋体的鉴定在60°C水浴锅中扩增60分钟。各试管扩 增完成后立刻转入80°C水浴锅中灭活2分钟。各取扩增产物5uL，以TAE为缓冲液，在2% 的琼脂糖凝胶(含0. 5ug/mL溴化乙锭)中，在电压75V电泳中进行检测。4.检测实例取12个PCR管，每组4支分为三组Bb、Ba和Bg。每组PCR管分别标记1、2、3和
4号管。然后按如下加样顺序加样。在第一组的四个离心管中各加入2X反应缓冲液工作液12. 5uL，灭菌的超纯水 8. 6uL，Bst DNA聚合酶1. OuL ；狭义伯氏疏螺旋体LAMP特异性引物反应混合物0. 9uL，在第 二组的四个离心管中各加入2X反应缓冲液工作液12. 5uL，嘎氏疏螺旋体LAMP特异性引 物反应混合物0. 9uL，灭菌的超纯水8. 6uL，BstDNA聚合酶1. OuL ；在第三组的四个离心管中 各加入2X反应缓冲液工作液12. 5uL，伽氏疏螺旋体引物反应混合物0. 9uL，灭菌的超纯 水 8. 6uL, Bst DNA 聚合酶 1. OuL。然后在所有的1，2，3和4号离心管中分别加入狭义伯氏疏螺旋体、嘎氏疏螺旋体 和伽氏疏螺旋体DNA样品和灭菌超纯水2. OuL，将各离心试管轻轻混勻，瞬间离心。第一组 和第三组的样品在60°C水浴锅中扩增60分钟，然后立刻转入80°C水浴锅中灭活2分钟。第 二组的样品在65°C水浴锅中扩增40分钟，立刻转80°C水浴锅中灭活2分钟。分别取扩增 产物5uL，以TAE为缓冲液，在2%的琼脂糖凝胶(含0.5ug/mL溴化乙锭)中，在电压75V 电泳中进行检测。检测结果见图1-3所示。结果表明狭义伯氏疏螺旋体、嘎氏疏螺旋体、伽氏疏螺旋体基因组DNA都能被其
7特异性的引物扩增，种间没有交叉反应。灭菌超纯水的反应管中也没有扩增。以上检测结果参见表2表2
权利要求
一种用于区分莱姆病病原基因型的试剂，其特征是试剂中至少有a.狭义伯氏疏螺旋体LAMP特异性引物；b.嘎氏疏螺旋体LAMP特异性引物；c.伽氏疏螺旋体LAMP特异性引物。
2.权利要求1所述的a.狭义伯氏疏螺旋体LAMP特异性引物为 F3 -tagcagccttgacgagaa-3‘B3 :5， -tttgacctagatcgtcagaa-3‘FIP -gccgtctttgtttttttctttgcttttttcagcgtttcagtagatttgd' BIP -gtagacaagcttgagcttaaaggatttttttgtcagcttttacgcctt-S'；b.嘎氏疏螺旋体LAMP特异性引物为 F3 -gccaaaacattagtgtcaaga-3‘ B3 -ggttccttcttttacttccaatg-S'FIP -catggtttttgcagacaattcaccttttgttctaaagacaaaacatcaacaga-S'BIP —已t^cBg已已已tg已已已已gcg^tgg已已ctttt已gct^cttttccttc已已g>_3，；C.伽氏疏螺旋体LAMP特异性引物为 F3 :5， -ttcaacgcaaaaggtgaat-3， B3 -caactgttatttctccagagtt-S'FIP -ccggttccatcgctttttatttctgttttgaaaaaacaatactaagagcaaacg-S' BIP :5， _aagactttgctcttgaaggaacttttttgcttaaaacaacagtgcc_3，0
3.权利要求1或2所述的用于区分莱姆病病原基因型的试剂的使用方法，其特征是将 待检的蜱进行研磨，然后离心沉淀，取上清液；或者从待检的动物或人提取组织或关节滑液 或血液样品，用所得到的上清液或组织样品培养莱姆病病原螺旋体，再将培养液离心，取沉 淀提取基因组DNA，将所提取的基因组DNA分为三份，在LAMP反应缓冲液中分别加入狭义 伯氏疏螺旋体特异性引物、嘎氏疏螺旋体特异性引物和伽氏疏螺旋体特异性引物，再分别 在每个加有特异性引物的LAMP反应缓冲液中加入前述提取的DNA样品、灭菌超纯水以及 BstDNA聚合酶，然后进行LAMP扩增，取扩增产物以TAE为缓冲液，在琼脂糖凝胶中进行电泳 检测，根据电泳检测结果的泳道中是否存在的特异性条带确定被检样品的莱姆病病原基因 型。
4.权利要求1或2所述的用于区分莱姆病病原基因型的试剂的使用方法，其特征是将 待检的蜱进行研磨，然后离心沉淀，取上清液；或者从待检的动物或人提取组织或关节滑液 或血液样品，用所得到的上清液或组织样品培养莱姆病病原螺旋体，再将培养液离心，取沉 淀提取基因组DNA，将所提取的基因组DNA分为三份，在LAMP反应缓冲液中分别加入狭义 伯氏疏螺旋体特异性引物、嘎氏疏螺旋体特异性引物和伽氏疏螺旋体特异性引物，再分别 在每个加有特异性引物的LAMP反应缓冲液中加入前述提取的DNA样品、灭菌超纯水以及 BstDNA聚合酶，然后进行LAMP扩增，在各扩增产物中加入Mg2+试剂，根据相应试管内液体 是否产生浑浊或白色沉淀的阳性反应，确定被检样品的莱姆病病原基因型。
5.权利要求1或2所述的用于区分莱姆病病原基因型的试剂的使用方法，其特征是将 待检的蜱进行研磨，然后离心沉淀，取上清液；或者从待检的动物或人提取组织或关节滑液或血液样品，用所得到的上清液或组织样品培养莱姆病病原螺旋体，再将培养液离心，取沉 淀提取基因组DNA，将所提取的基因组DNA分为三份，在LAMP反应缓冲液中分别加入狭义 伯氏疏螺旋体特异性引物、嘎氏疏螺旋体特异性引物和伽氏疏螺旋体特异性引物，再分别 在每个加有特异性引物的LAMP反应缓冲液中加入前述提取的DNA样品、灭菌超纯水以及 BstDNA聚合酶，然后进行LAMP扩增，在各扩增产物中加入SYBR Green I，根据相应试管是 否呈绿色的阳性反应确定被检样品的莱姆病病原基因型。
全文摘要
本发明涉及一种用于区分莱姆病病原基因型的试剂和其使用方法。本发明的用于区分莱姆病病原基因型的试剂中至少有狭义伯氏疏螺旋体LAMP特异性引物；嘎氏疏螺旋体LAMP特异性引物和伽氏疏螺旋体LAMP特异性引物；本发明的检测方法采用环介导的恒温扩增技术进行检测。
文档编号C12R1/01GK101967513SQ20091025820
公开日2011年2月9日 申请日期2009年12月10日 优先权日2009年12月10日
发明者关贵全, 杨吉飞, 殷宏, 牛庆丽, 罗建勋 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所