专利名称：用于鉴别巴西橡胶树品种的方法和巴西橡胶树品种鉴别用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于简便而准确地鉴别巴西橡胶树品种的方法。
背景技术：
巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)是作为天然橡胶用原料而种植的典型的橡胶 树。迄今，巴西橡胶树品种已以树叶、树皮或树形等形式来鉴别。然而，在用巴西橡胶树的形式鉴别品种中，对于实际鉴别和确定品种需要花费很 长时间。此外，需要花费时间掌握和熟练该鉴别方法。另外，难以根据外观在巴西橡胶树品 种中对其进行鉴别，或者根据巴西橡胶树品种可能弓I起误判。另一方面，近年来已开发出一些利用植物基因工程的品种鉴别方法。在这些方 法中，品种鉴别通过检测品种间碱基序列的差异即多态性来进行。即，它们利用遗传客观 的特征作为指标，从而可以进行准确的品种鉴别。在许多商购可得的植物中，已开发出利 用基因工程，如RAPD(随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA))法、 RFLP(限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphisms))法和微卫 星(microsatellite)法等的品种鉴别方法。在巴西橡胶树方面，报道了如下作为能够检测基因多态性的DNA标记能鉴别矮 小突变体克隆的RAPD标记(非专利文献1)和用于耐旱突变体克隆的开发和筛选的DNA标 记(非专利文献2)。非专利文献 1 Venkatachalam, P.等 “ Identification, cloning and sequence analysis of a dwarf genome-specified RAPDmarker in rubber tree[Hevea brasiliensis(Muell. )Arg. ]"Plant Cell R印· 2004 ;23 (5) :327_32。非专利文献 2 :Venkatachalam, P.等"Molecular cloning and sequencing of a polymorphic band from rubber tree[Hevea brasiliensis(Muell. )Arg. ] :the nucleotide sequence revealed partial homology with proline-specific permease gene sequence，，Current Science 2006 ；90 (11) 1510-151
发明内容
本发明要解决的问题然而，用基因工程能够有效鉴别巴西橡胶树农场中实际种植的许多品种的品种鉴 别方法还未知。因此，本发明的目的是提供用于简便而准确地鉴别巴西橡胶树品种的方法。用于解决问题的手段本发明人进行了各种研究，并且已发现能鉴别巴西橡胶树品种的DNA片段和能够 通过PCR法稳定扩增该DNA片段的引物对。另外，已发现基于使用上述引物对扩增的DNA 片段可以简便而准确地鉴别巴西橡胶树品种，结果完成了本发明。
即，根据本发明的鉴别巴西橡胶树品种的方法的特征在于，根据扩增DNA片段的 有无、该扩增DNA片段的长度和该扩增DNA片段的限制性内切核酸酶的酶切图谱的至少一 个基准来鉴别巴西橡胶树品种，扩增DNA片段通过以下来获得以从巴西橡胶树提取的基 因组DNA作为模板，用至少一种选自以下的引物对进行PCR:由SEQ ID NO :1和SEQ ID NO: 2所示的碱基序列的引物组成的引物对、由SEQ ID NO :3和SEQ ID NO: 4所示碱基序列的 引物组成的引物对、由SEQ ID NO 5和SEQ IDNO 6所示碱基序列的引物组成的引物对、由 SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8所示碱基序列的引物组成的引物对、由SEQ IDNO :9和SEQ ID NO :10所示碱基序列的引物组成的引物对、由SEQ ID N0:11和SEQ ID N0:12所示碱基序 列的引物组成的引物对、由SEQ ID N0:13和SEQ ID NO :14所示碱基序列的引物组成的引 物对以及由SEQ ID N0:15和SEQ ID NO :16所示碱基序列的引物组成的引物对。此外，优选鉴别选自由GT1、RRIM600、PB260、PB330和PB340组成的组中的至少一 个品种。此外，根据本发明的用于鉴别巴西橡胶树品种的试剂盒包括至少一种选自以下的 引物对由SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2所示碱基序列的引物组成的引物对、由SEQ ID NO: 3和SEQ IDNO 4所示碱基序列的引物组成的引物对、由SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所 示碱基序列的弓丨物组成的弓丨物对、由SEQ IDNO 7和SEQ ID NO 8所示碱基序列的引物组 成的引物对、由SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10所示碱基序列的引物组成的引物对、由SEQ ID N0:11和SEQ ID NO :12所示碱基序列的引物组成的引物对、由SEQ ID N0:13和SEQ ID NO :14所示碱基序列的引物组成的引物对以及由SEQ ID N0:15和SEQ ID N0:16所示碱基 序列的引物组成的引物对。发明的效果根据本发明，显现了能简便而准确地鉴别巴西橡胶树品种的有益效果。
图1是示出通过PCR扩增的各品种DNA片段的电泳图谱的示意图。图2是示出通过PCR扩增的各品种DNA片段的电泳图谱的示意图。图3是示出通过PCR扩增的各品种DNA片段的电泳图谱的示意图。图4是示出通过PCR扩增的各品种DNA片段的电泳图谱的示意图。图5是示出通过PCR扩增的各品种DNA片段的电泳图谱的示意图。图6是示出通过PCR扩增的各品种DNA片段的电泳图谱的示意图。图7是示出通过PCR扩增的各品种DNA片段的电泳图谱的示意图。图8是示出通过PCR扩增的各品种DNA片段的电泳图谱的示意图。图9是示出通过PCR扩增的各品种DNA片段的电泳图谱的示意图。图10是示出通过PCR扩增的各品种DNA片段的电泳图谱的示意图。图11是示出通过PCR扩增的各品种DNA片段的电泳图谱的示意图。
具体实施例方式以下将详细描述本发明。根据本发明的鉴别巴西橡胶树品种的方法的特征在于， 根据如下的至少一个基准来鉴别巴西橡胶树品种扩增DNA片段的有无，该扩增DNA片段的长度和该扩增DNA片段的限制性内切核酸酶酶切图谱，所述扩增DNA片段是以从巴西橡胶 树提取的基因组DNA作为模板，用选自随后所述的八个引物对的至少一个引物对进行PCR 而获得的。八个引物对是由SEQ ID NO :1所示碱基序列的引物和SEQ ID NO :2所示碱基 序列的引物组合的引物对、由SEQ ID NO: 3所示碱基序列的引物和SEQ ID NO 4所示碱基 序列的引物组合的引物对、由SEQ ID NO: 5所示碱基序列的引物和SEQ ID NO 6所示碱基 序列的引物组合的引物对、由SEQ ID NO: 7所示碱基序列的引物和SEQ ID NO 8所示碱基 序列的引物组合的引物对、由SEQ ID NO :9所示碱基序列的引物和SEQ ID N0:10所示碱基 序列的引物组合的引物对、由SEQ ID NO: 11所示碱基序列的引物和SEQ ID NO: 12所示碱 基序列的引物组合的引物对、由SEQ IDNO 13所示碱基序列的引物和SEQ ID NO 14所示 碱基序列的引物组合的引物对以及由SEQ ID NO 15所示碱基序列的引物和SEQ ID N0 16 所示碱基序列的引物组合的引物对。如上所述，用至少一组上述引物对进行PCR，从而稳定 扩增能够在巴西橡胶树的基因组DNA中鉴别品种的DNA片段，因而基于该扩增DNA片段能 够简便而准确地鉴别巴西橡胶树品种。另外，通过用多个引物对鉴别巴西橡胶树品种，也可 以简便而准确地鉴别仅通过一个弓I物对难以鉴别的品种。能够用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的碱基序列的引物组合的引物对进行扩 增的可鉴别品种的DNA片段的部分序列为包括根据巴西橡胶树品种的两个不同长度的微 卫星序列的两个DNA片段，该DNA片段示于序列表的SEQ ID Nos 17和18中。能够用SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的碱基序列的引物组合的引物对扩增的可鉴别品种的DNA片 段的部分序列示于序列表的SEQ ID Nos 19和20中。能够用SEQ ID NO 5和SEQID NO 6所示的碱基序列的引物组合的引物对扩增的可鉴别品种的DNA片段的部分序列示于序列 表的SEQ ID Nos 21和22中。能够用SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8所示的碱基序列的引 物组合的引物对扩增的可鉴别品种的DNA片段的部分序列示于序列表的SEQ ID No:23中。 能够用SEQ ID NO :9和SEQ IDNO :10所示的碱基序列的引物组合的引物对扩增的可鉴别 品种的DNA片段的部分序列示于序列表的SEQ ID No 24中。能够用SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12所示的碱基序列的引物组合的引物对扩增的可鉴别品种的DNA片段的部分序列 示于序列表的SEQ ID No 25中。能够用SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14所示的碱基序列 的引物组合的引物对扩增的可鉴别品种的DNA片段的部分序列示于序列表SEQ ID No 26 中。能够用SEQ IDN0:15和SEQ ID NO :16所示的碱基序列的引物组合的引物对扩增的可 鉴别品种的DNA片段的部分序列示于序列表SEQ IDNo ,21中。在根据本发明的巴西橡胶树品种的鉴别方法中，用作PCR用模板的基因组DNA从 巴西橡胶树中提取。作为用于提取基因组DNA的巴西橡胶树，可使用巴西橡胶树植物体的 任何组织，对其生长阶段没有限制。从植物体的组织提取基因组DNA可通过以下常规方法 来进行如酚提取、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法或碱性SDS法等。另外，粗纯化产物可 用作基因组DNA。必要时，提取的基因组DNA可通过如下的已知DNA纯化方法来纯化通过 酚/氯仿处理或氯仿/异戊醇处理去除蛋白质，用异丙醇沉淀，用乙醇沉淀，用乙醇漂洗或 者核糖核酸酶处理等。然后，将提取的基因组DNA作为模板，用上述引物对的至少一对进行PCR。根据本 身已知和通常使用的方法进行PCR。反应条件可以是任一种，只要其扩增目标碱基序列，即 上述可鉴别品种的DNA片段的部分序列(如SEQ ID Nos 17-27)即可。
根据本发明，然后根据至少一个如下的基准来鉴别巴西橡胶树品种通过PCR扩 增的DNA片段的有无、该扩增DNA片段的长度和该扩增DNA片段的限制性内切核酸酶酶切 图谱。在本发明中，品种鉴别可通过扩增片段的有或无、长度和酶切图谱的任一种作为基准 来进行，但是从品种鉴别可在更宽的品种范围的角度，优选使用两个以上的基准进行品种 鉴别。即便在用上述引物对扩增DNA片段的有无以及其长度方面相同的品种中，如果某种 限制性内切核酸酶酶切图谱不同，那么也可以基于酶切图谱鉴别品种。例如，对于用SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的碱基序列的引物组合的引物对扩增的DNA片段，品种鉴别能够 通过用^pl作为限制性内切核酸酶酶切该片段来进行。按照上述基准进行的品种鉴别可具体如下进行。当通过扩增DNA片段的有无进 行品种鉴别时，可例如通过根据常规方式的电泳分离上述PCR得到的产物，从而检测用上 述引物对扩增的DNA片段的有无而进行。此外，用由SEQ ID NO :1所示的碱基序列的引物 和SEQ ID NO :2所示的碱基序列的引物组合的引物对经PCR扩增的DNA片段的长度通常在 约140bp到约250bp的范围内。用由SEQ ID NO 3所示的碱基序列的引物和SEQ IDNO 4 所示的碱基序列的引物组合的引物对经PCR扩增的DNA片段的长度通常在约1500bp到约 2500bp的范围内。用由SEQ IDNO 5所示的碱基序列的引物和SEQ ID NO :6所示的碱基序 列的引物组合的引物对经PCR扩增的DNA片段的长度通常为约500bp。用由SEQ ID NO 7 所示的碱基序列的引物和SEQ ID NO :8所示的碱基序列的引物组合的引物对经PCR扩增的 DNA片段的长度通常在约SOObp到约950bp的范围内。用由SEQ ID NO 9所示的碱基序列 的引物和SEQ ID N0:10所示的碱基序列的引物组合的引物对经PCR扩增的DNA片段的长 度通常在约IlOObp到约2500bp的范围内。用由SEQ ID NO 11所示的碱基序列的引物和 SEQ ID NO :12所示的碱基序列的引物组合的引物对经PCR扩增的DNA片段的长度通常为约 900bp。用由SEQ ID NO :13所示的碱基序列的引物和SEQ ID NO :14所示的碱基序列的引 物组成的引物对经PCR扩增的DNA片段的长度通常在约600bp到约IOOObp的范围内。用 由SEQ ID NO :15所示的碱基序列的引物和SEQ ID NO :16所示的碱基序列的引物组合的引 物对经PCR扩增的DNA片段的长度通常在约450bp到约700bp的范围内。当通过扩增DNA片段的限制性内切核酸酶酶切图谱进行品种鉴别时，例如可通过 以下来进行用某种限制性内切核酸酶根据常规方式处理经PCR得到的产物，并通过电泳 分离，从而检测用上述引物对扩增的DNA片段的酶切图谱(酶切片段的长度和/或数量)， 并比较待鉴别的巴西橡胶树品种中的酶切图谱。另外，可单独或以两种以上的组合来使用 限制性内切核酸酶。品种鉴别的准确度能够通过以下来提高将上述通过DNA片段的扩增来鉴别品种 根据本发明的方法，与通过巴西橡胶树的树叶、树皮或树形等形式进行品种鉴别的常规方
法组合。对通过根据本发明的品种鉴别方法能够鉴别的巴西橡胶树品种不特别限定，其包 括例如，GTU PB260, RRIM600, PB330 和 PB340 等。给出下述实施例用于说明本发明，下述实施例并不意欲作为其限定。实施例1(由SEQID NO 1和SEQ ID NO 2所示的碱基序列组成的引物的设计) 从公开数据库(GenBank)中抽取巴西橡胶树的基因组DNA中的微卫星序列，并相互对比，从中已发现，虽然AY4866M和AY135656为同源序列，但微卫星的重复频率不同，因 此包括微卫星部分的长度根据不同品种而不同。从根据不同品种而不同的微卫星序列的两 侧设计分别增加包含微卫星序列的片段的PCR引物BSMS1F(SEQ ID NO 1)和BSMS1R(SEQ ID NO 2)。(植物材料和基因组DNA的提取)从巴西橡胶树农场采集GTl、RRIM600、PB260, PB330和PB340各自克隆的树 叶。从其叶中提取DNA作为进行可鉴别品种的DNA片段确认的材料。用DNeasy Plant Kit (Quiagen制造)从叶中提取DNA。(通过PCR扩增和检测微卫星序列)用上述PCR 引物 BSMS IF (SEQ ID NO :1)和 BSMS1R(SEQID N0:2)的引物对，在下 述反应液组合物和反应条件下，以各个克隆的基因组DNA为模板进行PCR。反应液为20 μ 1 水溶液，其含有IX反应缓冲液、0. 2mM dNTP混合物、0. 5单位Ex Taq DNA聚合酶(Takara Bio. Inc.制造)、1. 25 μ M各引物(BSMA1F和BSMS1R)和25ng模板DNA。使反应在94°C下 保持5分钟后，将在94°C下30秒、在55°C下30秒和在72°C下2分钟进行反应的反应周期 重复30次，然后使反应在72°C下保持7分钟并维持在4°C。由此获得的PCR产物用生物分 析仪2100 (Agilent制造)进行电泳，从而检测电泳图谱。检测的电泳图谱示于图1中。从 图1可见，品种间具有不同长度的DNA片段(约140bp-约250bp)的扩增。因此，清楚的是， 可通过以下来鉴别品种用SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2的引物对经PCR扩增微卫星序列 而获得的扩增DNA片段的长度。实施例2(通过RAPDPCR扩增具有品种间差异的DNA片段)将从巴西橡胶树获得的基因组DNA作为模板进行RAPDPCR反应。此时，PCR法中 的反应液组合物和反应条件如下。反应液为20 μ 1水溶液，其含有IX反应缓冲液、0. 25mM dNTP混合物、0. 5单位Ex Taq DNA聚合酶(Takara Bio. Inc.制造)、1. 25 μ M各引物和 25ng模板DNA。使反应在94°C下保持4分钟后，将在94°C下1分钟、在37°C下1. 5分钟和 在72°C下2分钟进行反应的反应周期重复35次，然后使反应在72°C下保持7分钟并维持 在 4 "C。此外，将 Takara PCR Thermal Cycle Dice (注册商标)Gradient (Takara Bio Inc. 制造)用于此反应。然后，将PCR反应液用生物分析仪2100 (Agilent制造)经电泳分离，从 而确认扩增片段的长度。将显示品种间扩增片段差异的PCR反应液，用TOPO-TA克隆试剂 盒anvitrogen制造)进行亚克隆，并转化到大肠杆菌中。将其中成功获得可鉴别品种的目 标 DNA 片段的质粒碱基序列用 ABI3730xl(Applied Biosystems 制造)和 ABI3100 (Applied Biosystems制造)进行亚克隆。结果，可鉴别品种的DNA片段的碱基序列如SEQ ID Nos 19-27所示。(通过PCR能够扩增SEQID Nos :19-27的可鉴别品种的DNA片段的引物的设计)从由此获得的如SEQ ID Nos :19和20所示的可鉴别品种的DNA片段，设计用于特 异性扩增DNA片段的引物对(4-lF(SEQID NO 3)和4_1R(SEQ ID NO :4))。此外，从SEQ ID Nos 21和22所示的DNA片段，设计用于特异性扩增DNA片段的引物对(12_6F(SEQ ID NO 5)和12-6R(SEQ ID NO :6))。另外，从SEQID Nos :23-27所示的DNA片段，分别设计用于特 异性扩增 DNA 片段的引物对(31F(SEQ ID NO 7) ^P 3IR(SEQ ID NO :8))，引物对(45F(SEQID NO 9)和 45R(SEQ ID NO: 10))，引物对(62F(SEQ ID NO :11)和 62R(SEQ ID NO 12))， 引物对(68F(SEQID NO :13)禾Π 68R(SEQ ID NO : 14))，以及引物对(77F(SEQ IDNO :15)禾口 77R(SEQ ID NO :16))。(通过PCR扩增和检测可鉴别品种的DNA片段)通过使用各自上述7种引物对G-1F(SEQ ID NO :3)和4_1R(SEQ ID NO :4)、 12-6F(SEQ ID NO 5)和 12_6R(SEQ ID NO :6)、31F(SEQ ID NO :7)和 31R(SEQ ID NO :8)、 45F(SEQ ID NO :9)禾口 45R (SEQ ID NO : 10)、62F (SEQ ID NO :11)和 62R(SEQ IDNO 12)、 68F(SEQ ID NO :13)和 68R(SEQ ID NO :14)以及 77F(SEQ ID NO :15)和 77R(SEQ ID NO: 16))，以上述克隆(GT1、RRIM600、PB260, PB330和PB340)的任意三个品种的各基因组DNA 为模板，在下述反应液组合物和反应条件下进行PCR。反应液为20 μ 1水溶液，其含有1 X 反应缓冲液、0. 2mM dNTP混合物、0. 5单位Ex Taq DNA聚合酶(Takara Bio Inc.制造)、 1. 25口] 各引物和251^模板0嫩。在使用各自5种引物对(4-lF(SEQ ID NO 3)和4_1R(SEQ ID NO :4)、12-6F(SEQ ID NO 5)和12_6R(SEQID NO :6)、31F (SEQ ID NO :7) ^P 3IR(SEQ ID NO :8)、45F(SEQID NO :9)和 45R(SEQ ID NO :10)以及 68F(SEQ ID NO :13)和 68R(SEQ ID NO 14))的情况下，使反应在94°C下保持4分钟后，将在94°C下30秒、在55°C下30秒和在 72°C下2分钟进行反应的反应周期重复30次，然后使反应在72°C下保持7分钟并维持在 4°C。在使用引物对(62F(SEQ ID NO :11)和62R(SEQ ID NO 12))的情况下，使反应在94°C 下保持4分钟后，将在94°C下30秒、在65°C下30秒和72°C下2分钟进行反应的反应周期 重复30次，然后使反应在72°C下保持7分钟并维持在4°C。在使用引物对(77F(SEQID NO 15)和77R(SEQ ID NO 16))的情况下，使反应在94°C下保持4分钟后，将在94°C下30秒、 在60°C下30秒和在72°C下2分钟进行反应的反应周期重复30次，然后使反应在72°C下保 持7分钟并维持在4°C。将由此获得的PCR产物用生物分析仪2100 (Agilent制造)进行电 泳从而检测电泳图谱，使用以下引物对的电泳图谱示意图分别示于图2-8中4_1F(SEQ ID NO 3)和 4_1R(SEQ ID NO :4)、12-6F(SEQ ID NO 5)禾口 12_6R(SEQ ID NO :6)、31F(SEQ ID NO 7)和 31R(SEQ ID NO :8)、45F(SEQ ID NO :9)和 45R(SEQ ID NO :10)、62F(SEQ ID NO 11)和 62R(SEQ IDNO 12)、68F(SEQ ID NO :13)禾口 68R (SEQ ID NO :14)以及 77F(SEQ ID NO: 15)和 77R(SEQ ID NO :16)。从图2观察到品种间具有不同长度的DNA片段(在约1500bp-约2500bp的范围 内)的扩增以及该扩增DNA片段的有无。因此，清楚的是，通过用SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4的引物对经PCR扩增可鉴别品种的DNA片段而获得的扩增片段的有无和/或长度，能 够进行品种鉴别。从图3观察到品种间扩增DNA片段(约500bp)的有无。因此，清楚的是，通过用 SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6的引物对经PCR扩增可鉴别品种的DNA片段而获得的扩增片 段的有无和/或长度，能够进行品种鉴别。从图4观察到品种间具有不同长度的DNA片段(约SOObp-约950bp范围内)的 扩增。因此，清楚的是，通过用SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8的引物对经PCR扩增可鉴别品 种的DNA片段而获得的扩增片段的长度，能够进行品种鉴别。从图5观察到品种间具有不同长度的DNA片段(约IlOObp-约2500bp范围内) 的扩增和该扩增DNA片段的有无。因此，清楚的是，通过用SEQ ID NO :9和SEQ ID NO=IO的引物对经PCR扩增可鉴别品种的DNA片段而获得的扩增片段的有无和/或长度，能够进 行品种鉴别。从图6观察到品种间扩增DNA片段(约900bp)的有无。因此，清楚的是，通过用 SEQ ID N0:11和SEQ ID NO 12的引物对经PCR扩增可鉴别品种的DNA片段而获得的扩增 片段的有无，能够进行品种鉴别。从图7观察到品种间具有不同长度的DNA片段(约600bp-约IOOObp范围内)的 扩增和该扩增DNA片段的有无。因此，清楚的是，通过用SEQ ID N0:13和SEQ ID N0:14的 引物对经PCR扩增可鉴别品种的DNA片段而获得的扩增片段的有无和/或长度，能够进行 品种鉴别。从图8观察到品种间具有不同长度的DNA片段(在约450bp-约700bp的范围内) 的扩增以及该扩增DNA片段(特别是约450bp)的有无。在图8中，认为浅色带是由非特异 性扩增产生的。因此，清楚的是，通过用SEQ ID N0:15和SEQ ID NO 16的引物对经PCR扩 增可鉴别品种的DNA片段而获得的扩增片段的有无和/或长度，能够进行品种鉴别。实施例3(通过PCR扩增和检测可鉴别品种的DNA片段)通过用上述8种引物对中的三种引物对BSMSlF (SEQ IDNO :1)和BSMSlR(SEQ ID NO :2)、4_1F(SEQ ID NO :3)禾口4_1R(SEQ ID NO 4)以及 12_6F(SEQ ID NO :5)禾口 12_6R(SEQ ID NO 6)，以上述克隆(GTl、RRIM600、PB260、PB330和PB340)的各基因组DNA作为模板， 在以下反应液组合物和反应条件下进行PCR。反应液为20 μ 1水溶液，其含有IX反应缓冲 液、0. 2mM dNTP 混合物、0. 5 单位 Ex Taq DNA 聚合酶(Takara Bio Inc.制造)，1.25 μ M 各 引物和25ng模板DNA。使反应在94°C下保持4分钟后，将在94°C下30秒、在55°C或60°C 下30秒以及在72°C下2分钟进行反应的反应周期重复30次，然后使反应在72°C下保持7 分钟并维持在4°C。将由此获得的PCR产物用生物分析仪2100 (Agilent制造)进行电泳， 从而检测电泳图谱，用BSMSl (引物对BSMSlF和BSMS1R)、HB4-1 (引物对4-1F和4-1R)和 Hbl2-6(引物对12-6F和12-6R)的电泳图谱的示意图分别示于图8_11中。此外，图中箭头 显示用于品种鉴别的带。另外，将用于鉴别的带的有无总结于表1。[表 1]
权利要求
1.一种用于鉴别巴西橡胶树品种的方法，其特征在于，所述巴西橡胶树品种根据至少 一种以下基准来鉴别扩增DNA片段的有无、和/或所述扩增DNA片段的长度、和/或所述 扩增DNA片段的限制性内切核酸酶的酶切图谱，其中所述扩增DNA片段通过以从巴西橡胶 树提取的基因组DNA为模板，用选自下列引物对的至少一种引物对进行PCR而获得由SEQ ID NO :1和SEQID NO :2所示的碱基序列的引物组成的引物对、由SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4所示的碱基序列的引物组成的引物对、由SEQID NO :5和SEQ ID NO 6所示的碱基序 列的引物组成的引物对、由SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8所示的碱基序列的引物组成的引 物对、由SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10所示的碱基序列的引物组成的引物对、由SEQ ID N0:11和SEQ ID NO :12所示的碱基序列的引物组成的引物对、由SEQ ID N0:13禾口 SEQ ID NO :14所示的碱基序列的引物组成的引物对以及由SEQ ID N0:15和SEQ ID N0:16所示的 碱基序列的弓I物组成的弓I物对。
2.根据权利要求1所述的用于鉴别巴西橡胶树品种的方法，其鉴别选自由GT1、 RRIM600、PB260, PB330和PB340组成的组中的至少一个品种。
3.一种用于鉴别巴西橡胶树品种的试剂盒，其包括选自下列引物对的至少一种引物 对由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示的碱基序列的引物组成的引物对、由SEQ ID NO 3和SEQID NO 4所示的碱基序列的引物组成的引物对、由SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6所 示的碱基序列的引物组成的引物对、由SEQID NO :7和SEQ ID NO :8所示的碱基序列的引物 组成的引物对、由SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10所示的碱基序列的引物组成的引物对、由 SEQ ID N0:11和SEQ ID NO :12所示的碱基序列的引物组成的引物对、由SEQ ID N0:13禾口 SEQ ID NO :14所示的碱基序列的引物组成的引物对以及由SEQ ID N0:15和SEQ IDNO 16 所示的碱基序列的弓I物组成的弓I物对。
全文摘要
公开的是能够准确并以简便方式鉴别巴西橡胶树植物品种的方法。具体公开的是用于鉴别植物巴西橡胶树品种的方法，其特征在于基于至少一种选自以下各项的标准鉴别巴西橡胶树的品种DNA片段的有无、该DNA片段的长度以及该DNA片段的限制性内切核酸酶的酶切图谱，其中该DNA片段通过使用从巴西橡胶树提取的基因组DNA作为模板，并使用选自下列引物对的至少一种引物对进行PCR扩增包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的引物；包含SEQ ID NO3所示核苷酸序列的引物和包含SEQ IDNO4所示核苷酸序列的引物；包含SEQ ID NO5所示核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO6所示核苷酸序列的引物；包含SEQ ID NO7所示核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO8所示核苷酸序列的引物；包含SEQ ID NO9所示核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO10所示核苷酸序列的引物；包含SEQ IDNO11所示核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO12所示核苷酸序列的引物；包含SEQ ID NO13所示核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO14所示核苷酸序列的引物；以及包含SEQ ID NO15所示核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO16所示核苷酸序列的引物。还公开用于实现上述方法的品种鉴别试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102066576SQ20098010498
公开日2011年5月18日 申请日期2009年1月15日 优先权日2008年1月15日
发明者奥村晓 申请人:印度尼西亚技术评价应用厅, 株式会社普利司通